一種青魚IFN-γ基因及應用的製作方法

2023-10-20 09:41:07 2

一種青魚IFN-γ基因及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種青魚IFN-γ基因及應用。一種分離的青魚IFN-γ基因，其序列為SEQ ID NO.1所示，編碼的蛋白質為SEQ ID NO.2所示，本發明應用螢光定量PCR檢測了IFN-γ基因在Poly I:C誘導後的表達變化。發現在腎、脾、鰓、頭腎和皮膚組織中，Poly I:C能顯著誘導IFN-γ的表達，通過轉染重組質粒到草魚CIK細胞，在體外成功表達青魚IFN-γ。將青魚IFN-γ基因的開放閱讀框序列連接到真核表達載體pcDNA3.1（+）上製備成DNA疫苗注射入青魚體內，能顯著增強魚體對病毒的感染預防能力。
【專利說明】_種青魚IFN-Y基因及應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種青魚IFN-γ基因及應用。 技術背景
[0002] 幹擾素（IFN)是一類能夠誘導脊椎動物細胞進入抗病毒狀態的分泌型細胞因子， 根據基因、蛋白結構及功能性質的不同，分為I型、II型和III幹擾素。與I型和III幹擾素不 同，脊椎動物的II型幹擾素迄今為止僅發現INF- γ。IFN- γ主要由NK細胞、激活T淋巴細 胞、巨噬細胞和神經元細胞等特定細胞產生。在天然免疫中，細胞內病原體感染引起單核吞 噬細胞和抗原提呈細胞分泌IL-12和IL-18, IL-12和IL-18刺激NK細胞分泌IFN-γ，然 後IFN-γ誘導巨噬細胞產生毒性物質如活性氧中間物和活性氮中間物，清除胞內病原體； IFN-γ也可通過誘導宿主細胞合成大量抗病毒蛋白如2' -5'寡聚腺苷酸合成酶、dsRNA依 賴蛋白激酶（PKR)、G結合蛋白和腺苷脫氨酶，建立起抗病毒狀態。IFN-γ還調節T細胞增 殖和分化、介導白細胞聚集、增強抗原提呈，在細胞介導的適應性免疫反應中起更重要的作 用。最近幾年來，IFN-γ基因序列已經在幾種魚中被克隆到，包括斑馬魚、河豚魚、虹鱒、大 西洋鮭、斑點叉尾鮰、金魚、鯉魚等。
[0003] 青魚（Mylopharyngodon piceus)是中國主要淡水養殖的經濟魚類，本發明對青魚 IFN-γ基因進行克隆和序列分析，並在草魚CIK細胞中表達，旨在為研宄青魚IFNy基因的 組織結構、遺傳進化特點、表達調控規律及其在抗病毒免疫中對其他細胞因子的調控作用 奠定了基礎。


【發明內容】

[0004] 本發明公開了一種青魚IFN-γ基因，其序列為SEQ ID NO. 1所述，編碼的胺基酸 序列為SEQ ID NO. 2所示，在天然免疫中青魚IFN-γ能調節部分免疫基因表達。
[0005] 本發明的另一個目的在於提供了一種青魚IFN-γ基因在製備提高淡水魚免疫力 藥物中的應用。優選用於青魚，將該製備為DNA疫苗，用於青魚，可明顯提高青魚的免疫力。
[0006] 為了達到上述目的，本發明採取以下技術措施：
[0007] -種青魚IFN-γ基因，通過以下步驟製備得到：
[0008] 按Trizol (Invitrogen)說明書提取總青魚組織RNA。將各組織的總RNA分別用 Dnase I (Takara)處理後，利用反轉錄試劑盒SMART PCR cDNA Synthesis Kit(Clontech) 進行反轉錄合成cDNA第一鏈。
[0009] 根據已知硬骨魚類IFN-γ序列設計簡併引物JBl-F和JB1-R。擴增得到中間片 段後，再按 SMARTer RACE cDNA Amplification kit(Clontech)分別設計正向（RACE1-3F， RACE2-3F)和反向（RACE1-5R，RACE2-5R)的巢式引物，經兩輪PCR反應擴增其3'和5' 端片段。反應條件為：94°C 5min ;94°C 30s，65?72°C 45s，運行5循環；94°C 30s，65? 72°C 45s，運行 5 循環；94°C 30s，65 ?72°C 30s，72°C 45s，運行 27 循環；72°C lOmin。將第 一輪PCR擴增產物用無菌水稀釋50倍後取I μ L稀釋液做為第二輪PCR反應的模板，反應 條件為：94°C 5min ;94°C 30s，60 ?70°C 30s，72°C 45s，運行 35 循環；72°C lOmin。。目的產 物經I. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測後，回收純化，測序結果拼接後，即得到青魚IFN-γ基因， 其序列為SEQID NO. 1所示，編碼的蛋白質為SEQ ID NO. 2所示，開放閱讀框為549bp，編碼 182個胺基酸。
[0010]

【權利要求】
1. 一種分離的青魚IFN-Y蛋白，其序列為SEQ ID NO. 2所示。
2. 權利要求1所述蛋白對應的核苷酸序列。
3. 根據權利要求2所述的核苷酸序列，其序列為SEQ ID NO. 1所示。
4. 權利要求1所述的蛋白或權利要求2所述的基因在製備提高淡水魚免疫力藥物中的 應用。
5. 根據權利要求4的應用，所述的淡水魚為青魚。
【文檔編號】C07K14/57GK104479004SQ201410707864
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月28日 優先權日:2014年11月28日
【發明者】周勇, 曾令兵, 範玉頂 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所