複方消炎利膽製劑的質量控制方法

2023-10-20 14:29:52

專利名稱：：複方消炎利膽製劑的質量控制方法
技術領域：
：本發明涉及中藥的質量控制領域，具體涉及一種含穿心蓮、溪黃草和苦木三味中藥的複方消炎利膽製劑的質量控制方法。
背景技術：
：中藥指紋圖譜是指某種或某幾種中藥材具有的特徵性成分的色譜或光譜的圖譜，中藥指紋圖譜對於有效控制中藥材或中成藥的質量具有重要的意義。隨著中醫中藥的廣泛推廣，指紋圖譜作為中藥材及其提取物質量控制方法，目前已為國際所共識。但目前中藥指紋圖譜往往僅涉及單味藥材或單方製劑的研究，對多種中藥材配伍組成的中成藥複方製劑的指紋圖譜研究仍處於起步階段。「消炎利膽」製劑為純中藥複方製劑，是一種治療慢性膽囊炎、膽道炎的常用中藥，屬於國家中藥保護產品。其組方由穿心蓮(Andrographispaniculata)、溪黃草(Rabdosialophanthoidesvar.gerardiana)、苦木(Picrasmapuassioides)三味藥材組成，具有清熱、祛溼、利膽的功效，用於肝膽溼熱引起的口苦、脅痛；急性膽囊炎、膽管炎，臨床療效確切。主藥穿心蓮，又名一見喜，為爵床科穿心蓮屬植物，具有清熱解毒、涼血消腫等多種功效(中外健康文摘·醫藥學刊，2007，4，163-164)，臨床上可治膽囊炎、咽喉腫痛等熱毒炎症；溪黃草，為唇形科香茶菜屬植物，具有清熱利溼，涼血散瘀，清肝利膽，退黃等功效，用於治療溼熱瀉痢，跌打瘀腫，急性黃疸型肝炎，急性膽囊炎等疾病(時珍國醫國藥，2003，14，498-500)；苦木，為苦木科苦木屬植物，具有清熱，祛溼，解毒的功效，用於風熱感冒，咽喉腫痛，腹瀉下痢，溼疹，瘡癤，毒蛇咬傷(《中華人民共和國藥典》2000年版)。以上藥物皆具有苦寒藥性，相互配伍後清熱解毒、祛溼利膽功效顯著。對各種膽道疾病有明顯的消炎、止痛、退黃、退熱作用，尤其對急、慢性膽囊炎，膽結石並發炎症等療效顯著。目前全國有133家藥廠(國家食品藥品監督管理局官方網站，http://app1.sfda.gov.cn/datasearch/face3/base.jsp？tableId＝25&tableName＝TABLE25&title＝國產藥品&bcId＝118102890099723943731486814455)在生產該產品，其製劑主要為片劑和膠囊劑。但是，到目前為止，由穿心蓮、溪黃草、苦木三味中藥組成的複方消炎利膽製劑的質量控制鑑別方法落後，《中華人民共和國藥典》1995年版1997增補版及衛生部藥品標準中藥成方製劑第十冊(WS3-B-2023-95)中對複方消炎利膽片僅採用試管反應進行鑑別。而含量測定方法也僅有測定來源於穿心蓮中的穿心蓮內酯含量的規定，沒有其餘兩味組成中藥(苦木、溪黃草)特徵成分的含量測定要求。僅以穿心蓮內酯作為指標性成分，無法全面評價複方消炎利膽製劑的質量。「2010年藥典編制大綱」提出中藥材及中成藥應「逐步由單一指標性成分的定性、定量測定，向活性、有效成分及生物測定的綜合檢測模式過渡，向多成分和指紋或特徵圖譜整體質量控制模式轉化」。其中，在對鑑別的技術要求中指出，所採用的色譜特徵圖譜，「應至少指認其中3個以上的有效成分、特徵成分或主成分並對其比例作出規定，而指認峰的峰面積之和應大於總峰面積的50％。」(參見2010年版《中華人民共和國藥典》一部提取物質量標準起草技術要求)。為此，有必要建立一種方法簡便、穩定、精密度高的指紋圖譜，用以科學、有效地控制複方消炎利膽製劑的質量。該指紋圖譜應具有以下幾個特點1、至少應指認出指紋圖譜中3個以上的色譜峰，指認色譜峰的峰面積之和應大於總峰面積的50％；2、指認的色譜峰應能覆蓋複方中的組成中藥；3、指認的色譜峰中應當覆蓋與組方功效大體相應的活性成分。
發明內容為解決現有技術存在的問題與不足，本發明的主要目的在於基於含穿心蓮、溪黃草和苦木三味中藥的複方消炎利膽製劑的指紋圖譜建立一種簡便、穩定、精密度高的質量控制方法。本發明的目的通過下列技術方案實現本發明提供的含穿心蓮、溪黃草和苦木三味中藥的複方消炎利膽製劑的質量控制方法，採用反相高效液相色譜法建立了複方消炎利膽製劑標準指紋圖譜，通過檢測複方消炎利膽製劑的供試指紋圖譜與標準指紋圖譜的相似度不小於0.8來控制複方消炎利膽製劑的質量。該圖譜包含15個主要色譜峰，其中8個色譜峰的化學結構已經被準確指認，以穿心蓮內酯色譜峰的保留時間為1計算15個主要色譜峰的相對保留時間，並計算各色譜峰峰面積佔指紋圖譜總峰面積百分比，分別為1號峰0.118±0.001，3.08±0.04％；2號峰0.172±0.001，1.81±0.02％；3號峰0.322±0.002，3.71±0.06％；4號峰0.751±0.002，3.65±0.37％；5號峰0.782±0.001，3.77±0.11％；6號峰0.867±0.001，3.67±0.64％，迷迭香酸；7號峰0.876±0.001，3.73±0.06％；8號峰0.934±0.002，5.80±0.13％；9號峰1.000，25.40±0.26％，穿心蓮內酯；10號峰1.016±0.003，4.31±0.19％，苦木鹼己；11號峰1.096±0.001，4.89±0.21％，異穿心蓮內酯；12號峰1.118±0.001，3.53±0.29％，14-去氧穿心蓮內酯苷；13號峰1.158±0.001，4.21±0.14％，14-去氧-11，12-二去氫穿心蓮內酯苷；14號峰1.355±0.002，17.01±0.54％，脫水穿心蓮內酯；15號峰1.382±0.002，5.56±0.33％，新穿心蓮內酯。以上的複方消炎利膽製劑的質量控制方法，具體包括以下的步驟a、複方消炎利膽製劑標準指紋圖譜的建立取中藥穿心蓮、苦木各150g，切碎混合，用80％～85％乙醇加熱提取二次，濾過，濾液回收乙醇並濃縮成稠膏，得到43.5g浸膏；取溪黃草150g剪碎，加水煎煮二次，合併濾液，濾過，煎液濃縮至適量，加5倍量70％乙醇，搖勻，靜置，濾過，濾液回收乙醇並濃縮成稠膏，得到9g浸膏。分別取上述穿心蓮和苦木混合稠膏5g和溪黃草稠膏1.03g，合併，加入100mL70％的甲醇，超聲溶解，取4mL過0.45μm微孔濾膜，然後取濾過液1.5mL用固相萃取柱(DIKMAProElutTMC18)淨化，續濾液配製成終濃度為20mg/mL的供試品溶液；取穿心蓮內酯對照品，以適量甲醇溶解，製成每1mL甲醇中含有穿心蓮內酯1mg的溶液，即得穿心蓮內酯的對照品溶液；分別精密取上述供試品及對照品溶液10μL，參照國家藥典附錄中規定的高效液相分析方法，注入高效液相色譜儀進行色譜分析，記錄色譜圖；以穿心蓮內酯的色譜保留時間為1計算各色譜峰的相對保留時間及各色譜峰面積的百分比，得到如上所述的標準指紋圖譜；b、複方消炎利膽製劑指紋圖譜的建立取待測複方消炎利膽製劑20粒，若有糖衣除去糖衣，研細，分別取內容物1g，加入20mL70％的甲醇，超聲提取兩小時，取1mL過0.45μm微孔濾膜，然後取濾過液用固相萃取柱(DIKMAProElutTMC18)淨化，續濾液配製成濃度為20mg/mL的供試溶液；穿心蓮內酯對照品溶液按步驟a所述製備；按步驟a所述條件對上述供試品和對照品溶液進行色譜分析，記錄色譜圖；以穿心蓮內酯的色譜保留時間為1計算各色譜峰的相對保留時間及峰面積，得到供試指紋圖譜；c、供試複方消炎利片指紋圖譜與標準指紋圖譜的相似度不小於0.8。上述步驟a和b中，發明人經過反覆實驗，確立了較佳的色譜條件採用十八烷基矽氧鍵合矽膠為固定相；以含有0.02％三氟乙酸的甲醇—水溶液作為流動相，連續梯度洗脫0min時，流動相A為80％的0.02％的三氟乙酸水溶液，流動相B為20％的0.02％的三氟乙酸甲醇溶液；70min時，流動相A為30％的0.02％的三氟乙酸水溶液，流動相B為70％的0.02％的三氟乙酸甲醇溶液；流速為0.8mL/min；檢測波長為225nm；柱溫為40℃；進樣體積10μL；以穿心蓮內酯計算，理論塔板數不低於200000此條件下得到的標準指紋圖譜包含15個主要色譜峰，發明者還利用公知的現代色譜分離手段，富集並分離得到了該標準指紋圖譜中的8個主要色譜峰，並利用核磁共振波譜、多級質譜等手段，結合文獻，鑑定了上述8個化合物的結構。8個主要色譜峰分別是6號峰0.867±0.001，3.67±0.64％，迷迭香酸；9號峰1.000，25.40±0.26％，穿心蓮內酯；10號峰1.016±0.003，4.31±0.19％，苦木鹼己；11號峰1.096±0.001，4.89±0.21％，異穿心蓮內酯；12號峰1.118±0.001，3.53±0.29％，14-去氧穿心蓮內酯苷；13號峰1.158±0.001，4.21±0.14％，14-去氧-11，12-二去氫穿心蓮內酯苷；14號峰1.355±0.002，17.01±0.54％，脫水穿心蓮內酯；15號峰1.382±0.002，5.56±0.33％，新穿心蓮內酯。上述化學結構已經被準確指認的色譜峰的峰面積總和佔總峰面積的68％。標準指紋圖譜的15個色譜峰中的1號峰、3號峰、5號峰、7號峰、8號峰、9號峰、11號峰、12號峰、13號峰、14號峰、15號峰來源於組方中藥穿心蓮，2號峰、4號峰、6號峰來源於組方中藥溪黃草，10號峰來源於組方中藥苦木。發明者進而採用脂多糖誘導的小鼠單核巨噬細胞RAW264.7釋放一氧化氮(nitricoxide，NO)、腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)及白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)抑制活性模型及15-酯氧酶(15-lipoxygenase，15-LO)抑制活性模型，對來源於組方中藥穿心蓮中的特徵性成分穿心蓮內酯，溪黃草中的特徵性成分迷迭香酸進行活性評價，試驗結果表明穿心蓮內酯對脂多糖誘導的小鼠單核巨噬細胞RAW264.7釋放NO、TNF-α及IL-6有明顯的抑制活性，迷迭香酸對15-LO的釋放具有明顯的抑制活性；而苦木中的特徵性成分苦木鹼己根據文獻報導其具有很強的環磷酸腺苷磷酸二酯酶(PDE)抑制活性(ChemicalandPharmaceuticalBulletin1984，32，1872-1877)。一氧化氮(NO)是由精氨酸胍基氮經過一氧化氮合成酶(NOS)的催化氧化而形成的。在脂多糖等的誘導下NOS的一種亞型iNOS會產生NO，NO不但參與了炎症疾病的發生，而且能夠促進前列腺素E2等炎症介質的釋放(中國風溼病學雜誌1999，3，191-193)，介導和調節包括炎症在內的多種生理和病理過程(中國藥理學通報1992，8，409-415)。腫瘤壞死因子(TNF-α)是一種內源性化學因子，主要是由活化的單核巨噬細胞產生。受到刺激後，T細胞能夠活化自然殺傷細胞(NK細胞)和肥大細胞並使其分泌TNF-α，血管內皮細胞在一定條件下也具有產生和釋放TNF-α的能力(中國臨床康復2005，27，123-125)。TNF-α參與多種炎症反應的過程，而且許多報導顯示TNF-α誘導細胞的轉變、聚合和腫瘤的發生(Nature2005，435，752-753；Cytokine&GrowthFactorReviews2002，13，135-141；Lancet2001，357，539-545；Nature2004，431，405-406)。白細胞介素-6(IL-6)也是一種內源性化學因子，它是急性炎症反應的一種重要介質，而且它是一種多功能的細胞因子。IL-6的異常表達與許多自身免疫性疾病和腫瘤的發病機制及發展進程相關(國外醫學藥學分冊2006，33，81-85)。15-酯氧酶(15-LO)是花生四烯酸(AA)脂氧酶代謝途徑的關鍵酶。而花生四烯酸(AA)是生物合成前列腺素(PGs)、血栓素合成酶(TXs)和白三烯(LTs)的主要前體。炎症發生時，細胞膜上的花生四烯酸(AA)在環氧化酶和脂氧化酶的作用下產生一系列具有生理活性的脂類介質，主要包括前列腺素PGE2和白三烯LT4，引起炎症反應。環磷酸腺苷(cAMP)參與調節體內多種細胞活動，是生命的重要調節物質(TheJournaloftheAmericanMedicalAssociation1970，214，1281-1288)，它的變化又與多種疾病有關(NucleotidesinDisease1975，UniversityParkPress，Baltimore)，近代藥理表明其能夠抑制炎症細胞釋放組胺、溶酶體酶、氧自由基和某些炎症介質(Therapies2002，57，163-168；Pharmacology，1989，39，19-27)。而環磷酸腺苷磷酸二酯酶(PDE)是環磷酸腺苷(cAMP)的不可逆性水解酶(JournalofPharmaceuticalSciences1975，64，1-37)，抑制環磷酸腺苷磷酸二酯酶(PDE)可以顯著降低血漿中環磷酸鳥苷(cGMP)含量，提高cAMP含量，從而起到抗炎的作用。抑制NO、TNF-α、IL-6等炎症介質的釋放以及抑制15-LO、PDE等與炎症相關的酶的活性都可以治療多種炎症疾病。炎症介質以及引起炎症的相關酶已經成為研究炎症最重要的藥物靶點，尋找活性強、毒性小的抑制劑日益成為人們開發新的抗炎藥物所關注的熱點。鑑於穿心蓮內酯、迷迭香酸、苦木鹼己三種抗炎成分的作用，本發明的質量控制方法進一步還可以包括將穿心蓮內酯、迷迭香酸、苦木鹼己或它們的組合作為指標性成分進行含量測定的步驟。本發明提供的由穿心蓮、溪黃草、苦木三味中藥組成的複方消炎利膽製劑的質量控制方法的用途包括1、制定了對由穿心蓮、溪黃草、苦木三味中藥組成的複方消炎利膽製劑進行質量控制的鑑別方法；2、對由穿心蓮、溪黃草、苦木三味中藥組成的複方消炎利膽製劑，選擇了高效液相指紋圖譜中的特徵性、活性組分色譜峰，可以作為進一步建立複方消炎利膽製劑中抗炎成分含量測定方法的基礎，用以控制複方消炎利膽製劑的質量。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果1、通過供試指紋圖譜與標準指紋圖譜的對比，可方便的控制產品的質量的穩定性，均一性。2、在含15個色譜峰的標準指紋圖譜中8個色譜峰的化學結構已被確認，有利於對有效成分的進一步研究和利用。3、發現了穿心蓮內酯、迷迭香酸和苦木鹼己的抗炎活性，可選擇它們作為指標性成分進行含量測定控制。4、本發明的質量控制方法重現性好、穩定性高、精密度優異且操作簡便。圖1是複方消炎利膽製劑的高效液相標準指紋圖譜；圖2是複方消炎利膽製劑的高效液相標準指紋圖譜的重現性；圖3是相同色譜條件下，各色譜峰單體化合物的高效液相圖譜；圖4是市售複方消炎利膽製劑的高效液相指紋圖譜相似度。具體實施例方式下面結合實施例，對本發明做進一步地詳細說明，但本發明的實現方式並不局限於此。實施例1複方消炎利膽製劑高效液相標準指紋圖譜的建立取中藥穿心蓮、苦木各150g，切碎混合，用80％～85％乙醇加熱提取二次，濾過，濾液回收乙醇並濃縮成稠膏，得到43.5g浸膏；取溪黃草150g剪碎，加水煎煮二次，合併濾液，濾過，煎液濃縮至適量，加5倍量70％乙醇，搖勻，靜置，濾過，濾液回收乙醇並濃縮成稠膏，得到9g浸膏。分別取上述穿心蓮和苦木混合稠膏5g和溪黃草稠膏1.03g，合併，加入100mL70％的甲醇，超聲溶解，取4mL過0.45μm微孔濾膜，然後取濾過液1.5mL用固相萃取柱(DIKMAProElutTMC18)淨化，總損失率約為17％，續濾液配製成終濃度為20mg/mL的供試品溶液，根據上述供試品溶液的配置方法，配置6份終濃度為20mg/mL的複方消炎利膽製劑供試品溶液；取穿心蓮內酯對照品，以適量甲醇溶解，製成每1mL甲醇中含有穿心蓮內酯1mg的溶液，即得穿心蓮內酯的對照品溶液；分別精密取上述供試品及對照品溶液10μL，參照國家藥典附錄中規定的高效液相分析方法，注入高效液相色譜儀進行色譜分析，記錄色譜圖。液相色譜條件為採用十八烷基矽烷鍵合矽膠為固定相；採用連續梯度洗脫，流動相A為含有0.02％三氟乙酸的水溶液；流動相B為含有0.02％三氟乙酸的甲醇溶液；梯度洗脫程序如下0min時，流動相A為80％的0.02％的三氟乙酸水溶液，流動相B為20％的0.02％的三氟乙酸甲醇溶液；70min時，流動相A為30％的0.02％的三氟乙酸水溶液，流動相B為70％的0.02％的三氟乙酸甲醇溶液；流速為0.8mL/min；檢測波長為225nm；柱溫為40℃。獲得的複方消炎利膽製劑的高效液相標準指紋圖譜有15個主要色譜峰(如圖1)，以穿心蓮內酯的色譜保留時間為1計算的各色譜峰的相對保留時間，分別為0.118±0.001、0.172±0.001、0.322±0.002、0.751±0.002、0.782±0.001、0.867±0.001、0.876±0.001、0.934±0.002、1.000(穿心蓮內酯)、1.016±0.003、1.096±0.001、1.118±0.001、1.158±0.001、1.355±0.002、1.382±0.002，各色譜峰相對保留時間的相對偏差均小於1.0％(見表1)，表明採用該方法所獲得的高效液相指紋圖譜具有較好的重現性(見圖2)，同時計算了各色譜峰的峰面積百分比(見表2)。以穿心蓮內酯計算，理論塔板數不低於200000。表1複方消炎利膽製劑高效液相指紋圖譜相對保留時間重現性表2複方消炎利膽製劑高效液相指紋圖譜中15主要色譜峰峰面積百分比實施例2色譜峰的分離及結構鑑定分別對組成複方消炎利膽製劑的三味中藥穿心蓮、苦木、溪黃草進行提取分離。取穿心蓮60％乙醇提取物500g，加水混懸，分別用環己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取。對乙酸乙酯浸膏部位進行矽膠柱分離，以氯仿:甲醇溶劑系統進行梯度洗脫(100:0，99:1，98:2，95:5，90:10，80:20，50:50，0:100)。將洗脫得到的相似部分進行合併，得到APE-1至APE-10共十個部分。分別對各部分進行反覆矽膠柱層析，分離得到了化合物II、IV～VIII。取溪黃草60％乙醇提取物600g，加水混懸，對其進行大孔樹脂HP-20柱分離，以水/乙醇溶劑系統進行梯度洗脫(0％、30％、50％、70％、95％)，得到XHC-1至XHC-5共五個部分。對XHC-2進行反向ODS柱，凝膠HW-40柱，以及製備高效液相柱層析，分離得到化合物I。取苦木60％乙醇提取物100g，加水混懸，用等體積的氯仿萃取。將萃取得到的浸膏60g進行矽膠柱分離，以環己烷乙酸乙酯溶劑系統梯度洗脫，其中環己烷乙酸乙酯(1:1)洗脫餾分在甲醇中析出結晶，得到化合物III。通過理化常數和現代波譜學手段(MS、NMR)，結合文獻相關數據，鑑定了這些化合物的結構。所獲得的各化合物的結構如下表3所示表3指紋圖譜中所指認的各化合物結構所獲得的各化合物的物理化學常數如下化合物I(迷迭香酸)白色無定形粉末，ESI-MSm/z405[M-H+2Na]+，359[M-H]-，推測其分子量為360，結合1H-NMR、13C-NMR數據可推測其分子式為C18H16O8。化合物I的1H-NMR、13C-NMR數據與文獻(雲南植物研究，1987，9，407-411)報導的迷迭香酸(Rosmarinicacid)一致，故鑑定化合物I為迷迭香酸，其13C-NMR數據見表4。表4化合物I的13C-NMR數據(DMSO-d6)化合物II(穿心蓮內酯)無色針狀結晶(甲醇)，mp229-231℃。Legal和Kedde反應顯紅色，提示可能存在α，β-不飽和內酯結構。IR(KBr)cm-13397(OH)，1726(C＝O)，1508，1454(C＝C)。ESI-MSm/z349[M-H]-，373[M+Na]+，推出化合物分子量為350，結合1H-NMR、13C-NMR數據可推測其分子式為C20H30O5。化合物II的1H-NMR、13C-NMR數據與文獻(ChemicalandPharmaceuticalBulletin，1994，42，1216-1225.)報導的穿心蓮內酯(Andrographolide)一致，故鑑定化合物II為穿心蓮內酯，其13C-NMR數據見表6。化合物III(苦木鹼己)淡黃色針狀結晶(甲醇)，改良碘化鉍鉀反應呈橙紅色，提示為生物鹼。ESI-MSm/z267[M+H]+，265[M-H]-，推出化合物分子量為266，結合1H-NMR、13C-NMR數據可推測其分子式為C15H10N2O3。UV圖譜顯示243nm和281nm處最大吸收峰。化合物III的1H-NMR、13C-NMR數據與文獻(ChemicalandPharmaceuticalBulletin，1985，33，5239-5244)報導的苦木鹼己(4-Methoxy-5-hydroxy-canthin-6-one)一致，故鑑定化合物III為苦木鹼己，其13C-NMR數據見表5。表5化合物III的13C-NMR數據(CDCl3)化合物IV(異穿心蓮內酯)無色片狀結晶(甲醇)，mp207-209℃。Legal和Kedde反應顯紅色，提示可能存在α，β-不飽和內酯結構。IR(KBr)cm-13334(OH)，1752(C＝O)，1676(C＝C)。ESI-MSm/z349[M-H]-，373[M+Na]+，結合1H-NMR、13C-NMR數據可推測其分子式為C20H30O5。化合物IV的1H-NMR、13C-NMR數據與文獻(ChemicalandPharmaceuticalBulletin，1994，42，1216-1225.)報導的異穿心蓮內酯(Isoandrographolide)一致，故鑑定化合物IV為異穿心蓮內酯，其13C-NMR數據見表6。化合物V(14-去氧穿心蓮內酯苷)無色片狀結晶(甲醇)，mp199-201℃。Legal和Kedde反應顯紅色，提示可能存在α，β-不飽和內酯結構。IR(KBr)cm-13477(OH)，1751(C＝O)，1648(C＝C)。ESI-MSm/z495[M-H]-，519[M+Na]+，結合1H-NMR、13C-NMR數據可推測其分子式為C26H40O9。化合物V的1H-NMR、13C-NMR數據與文獻(ChemicalandPharmaceuticalBulletin，1994，42，1216-1225.)報導的14-去氧穿心蓮內酯苷(Deoxyandrographiside)一致，故鑑定化合物V為14-去氧穿心蓮內酯苷，其13C-NMR數據見表6。化合物VI(14-去氧-11，12-二去氫穿心蓮內酯苷)白色粉末(甲醇)。Legal和Kedde反應顯紅色，提示可能存在α，β-不飽和內酯結構。UV圖譜顯示219nm和250nm處最大吸收峰。ESI-MSm/z493[M-H]-，517[M+Na]+，結合1H-NMR、13C-NMR譜數據可推測其分子式為C26H38O9。化合物VI的1H-NMR、13C-NMR數據與文獻(ChemicalandPharmaceuticalBulletin，1994，42，1216-1225.)報導的14-去氧-11，12-二去氫穿心蓮內酯苷(14-Deoxy-11，12-dihydroandrographiside)一致，故鑑定化合物VI為14-去氧-11，12-二去氫穿心蓮內酯苷，其13C-NMR數據見表6。化合物VII(脫水穿心蓮內酯)無色針狀結晶(甲醇)，mp203-204℃。Legal和Kedde反應顯紅色，提示可能存在α，β-不飽和內酯結構。IR(KBr)cm-13431(OH)，1740(C＝O)，1638(C＝C)。ESI-MSm/z331[M-H]-，355[M+Na]+，結合1H-NMR、13C-NMR數據可推測其分子式為C20H28O4。化合物VII的1H-NMR、13C-NMR數據與文獻(ChemicalandPharmaceuticalBulletin，1994，42，1216-1225.)報導的脫水穿心蓮內酯(14-Deoxy-11，12-dihydroandrographolide)一致，故鑑定化合物VII為脫水穿心蓮內酯，其13C-NMR數據見表6。化合物VIII(新穿心蓮內酯)無色片狀結晶(甲醇)，mp202-204℃。Legal和Kedde反應顯紅色，提示可能存在α，β-不飽和內酯結構。IR(KBr)cm-13449(OH)，1748(C＝O)，1648(C＝C)。ESI-MSm/z479[M-H]-，503[M+Na]+，結合1H-NMR、13CNMR數據可推測其分子式為C26H40O8。化合物VIII的1H-NMR、13C-NMR數據與文獻(ChemicalandPharmaceuticalBulletin，1994，42，1216-1225.)報導的新穿心蓮內酯(Neoandrographolide)一致，故鑑定化合物VIII為新穿心蓮內酯，其13C-NMR數據見表6。上述分離得到的各單體化合物，採用實施例1中建立的色譜條件，參照國家藥典附錄中規定的反相高效液相分析方法，注入高效液相色譜儀進行色譜分析，記錄色譜圖(見圖3)。實施例3穿心蓮內酯對脂多糖誘導的小鼠單核巨噬細胞RAW264.7釋放NO、TNF-α及IL-6的抑制活性一.對脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞釋放一氧化氮(NO)的抑制活性實驗小鼠單核巨噬細胞RAW264.7(ATCCTIB-71)培養於含10％熱滅活(56℃，30min)胎牛血清(FBS)、100U/mL青黴素鈉(Gibco)、100μg/mL鏈黴素(Gibco)的RPMI1640(Gibco)培養液中，37℃，5％CO2的恆溫培養箱中孵育生長。由於NO極不穩定，在細胞培養上清液內很快代謝成亞硝酸基(NO2-)，故採用Griess法測定樣品中NO2-的濃度作為衡量NO水平的指標。Griess試劑A0.1％N-萘乙二胺鹽酸鹽(naphthylethylenediaminedihydrochloride)溶於水中；Griess試劑B1％對氨基苯磺醯胺(sulphanilamide)溶於5％H3PO4中。使用前等體積混合試劑A和B。用RPMI1640培養液將RAW264.7細胞稀釋至5×105cells/mL濃度，接種於96孔細胞培養板中，每孔加入200μL細胞懸浮液。CO2培養箱中培養1h後，每孔加入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma)(終濃度1μg/mL)和DMSO溶解的不同濃度的測試樣品0.4μL，同時設LPS組(加入LPS，但不加入測試樣品，對NO釋放的抑制率為0％)和空白對照組(不加入LPS和測試樣品，僅加入0.4μLDMSO，對NO釋放的抑制率為100％)，每個樣品設4個平行孔。在37℃，5％CO2恆溫培養箱中培養24h，吸取100μL培養液上清至酶標板中，離心(1000×g，4℃，3min)，加入100μLGriess試劑，室溫避光反應10min，於酶標儀測定其540nm處的吸光值。用濃度分別為1、5、10、50μmol/L的NaNO2繪製標準曲線，根據NaNO2標準曲線計算細胞培養上清液中NO2-的濃度進而計算測試樣品對NO釋放的抑制率。以氫化可的松(hydrocortisone)作為陽性對照(IC5064.3μM)。實驗結果表明，穿心蓮內酯的IC50值(IC501.42μM)顯著優於陽性對照藥氫化可的松，說明它具有抑制RAW264.7細胞釋放NO的作用。二.對脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞釋放TNF-α的抑制活性實驗細胞培養同NO釋放抑制活性測試。對TNF-α的抑制活性測試使用mouseTNF-αELISAkit試劑盒(R&D)。用RPMI1640培養液將RAW264.7細胞稀釋至5×105ce1ls/mL濃度，接種於96孔細胞培養板中，每孔加入200μL細胞懸浮液。CO2培養箱中培養1h後，每孔加入脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)(Sigma)(終濃度1μg/mL)和DMSO溶解的不同濃度的測試樣品0.4μL，同時設LPS組(加入LPS，但不加入測試樣品，對TNF-α釋放的抑制率為0％)和空白對照組(不加入LPS和測試樣品，僅加入04μLDMSO，對TNF-α釋放的抑制率為100％)，每個樣品設3個平行孔。在37℃，5％CO2恆溫培養箱中培養6h後吸取培養液上清，按照ELISA試劑盒說明書方法進行標準曲線繪製和TNF-α的測定，計算抑制率。以氫化可的松作為陽性對照(IC5085.6μM)。實驗結果表明，穿心蓮內酯的IC50值(IC5027.15μM)顯著優於陽性對照藥氫化可的松，說明它具有抑制巨噬細胞釋放TNF-α的作用。三.對脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞釋放IL-6的抑制活性實驗細胞培養同NO釋放抑制活性測試。對IL-6的抑制活性測試使用mouseIL-6ELISAkit試劑盒(R&D)。用RPMI1640培養液將RAW264.7細胞稀釋至5×105cells/mL濃度，接種於96孔細胞培養板中，每孔加入200μL細胞懸浮液。CO2培養箱中培養1h後，每孔加入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma)(終濃度1μg/mL)和DMSO溶解的不同濃度的測試樣品0.4μL，同時設LPS組(加入LPS，但不加入測試樣品，對IL-6釋放的抑制率為0％)和空白對照組(不加入LPS和測試樣品，僅加入0.4μLDMSO，對IL-6釋放的抑制率為100％)，每個樣品設3個平行孔。在37℃，5％CO2恆溫培養箱中培養6h後吸取培養液上清，按照ELISA試劑盒說明書方法進行標準曲線繪製和IL-6的測定，計算抑制率。以氫化可的松作為陽性對照(IC5063.8μM)。實驗結果表明，穿心蓮內酯的IC50值(IC506.75μM)顯著優於陽性對照藥氫化可的松，說明它具有抑制巨噬細胞釋放IL-6的作用。實施例4迷迭香酸對15-脂加氧酶(15-LO)的抑制活性15-脂加氧酶(15-LO)是最主要的脂加氧酶，其通常作用底物為亞油酸鹽和花生四烯酸鹽。本實驗利用純化的15-LO作用於亞油酸，測定反應過程中的產物過氧化物的含量，反映相應的脂加氧酶的活性。對15-LO的抑制活性測試使用脂加氧酶抑制劑篩選試劑盒(LipoxygenaseInhibitorScreeningAssayKit，760700)。使用前等體積混合DevelopingRegent1(Cayman，760711)和DevelopingRegent2(Cayman，760712)配置成顯色劑Chromogen；取10μL15-LO(Cayman，760714)加入990μLTris-HCl(0.1M，pH7.4)，配置成15-LO試劑，混勻置於冰上備用；取亞油酸溶液(Cayman，760716)25μL，加入0.1MKOH溶液(Cayman，760713)25μL，渦旋混合後，加入950μL去離子水稀釋，即為底物溶液，備用。實驗在96孔酶標板中進行，設定空白對照組[每孔加入100μLTris-HCl(0.1M，pH7.4)]，100％酶活性組[每孔加入90μL相應的15-LO試劑，10μLDMSO]及測試樣品組[每孔加入90μL相應的15-LO試劑，10μL用DMSO溶解的測試樣品]，每組設兩個平行孔。以上所有孔中各加入10μL配製好的底物溶液，開始反應，將96孔酶標板置於水平搖床上振搖5min。每孔加入100μL顯色劑Chromogen終止酶反應，用封板膜封板，置於水平搖床上振搖5min。取掉封板膜，測定500nm下的吸光值。根據A500計算測試樣品對15-LO的抑制率實驗結果(見表-7)表明，迷迭香酸對15-LO具有較強的抑制作用。表-7迷迭香酸(1mM)對15-LO的抑制活性實施例5市售複方消炎利膽片中藥製劑的質量分析購買市售的廣州白雲山和記黃埔中藥有限公司生產的三個批號複方消炎利膽片(生產批號E7A001、E7A002、E7A003)，廣東萬年青製藥有限公司生產的一個批號的複方消炎利片(生產批號0802106)以及廣東羅浮山藥業有限公司生產的一個批號的複方消炎利膽片(生產批號LO7G060)。分別取20片製劑，除去糖衣，研細，再各取內容物1g，加入20mL70％的甲醇，超聲提取兩小時，取1mL過0.45μm微孔濾膜，然後取濾過液用固相萃取柱(DIKMAProElutTMC18)淨化，各廠家製劑的總損失率分別約為73％(廣州白雲山和記黃埔中藥有限公司)、68％(廣東萬年青製藥有限公司)、72％(廣東羅浮山藥業有限公司)，續濾液配製成終濃度為20mg/mL的各製劑供試溶液。分別精密取供試液10μL，採用實施例1中建立的色譜條件，參照國家藥典附錄中規定的高效液相分析方法，注入高效液相色譜儀進行色譜分析，記錄色譜圖。獲得的各市售複方消炎利膽片製劑的色譜圖與複方消炎利膽片製劑的高效液相標準指紋圖譜比較，五個市售製劑色譜圖至少檢出15個指標色譜峰中的11個(見表-8)，保留時間相對標準偏差小於1％；使用藥典委員會提供的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A》軟體計算，五種中藥製劑供試液高效液相色譜圖的相似度分別為0.898，0.879，0.832，0.833和0.854(見附圖4)。其中S1為複方消炎利膽片的標準指紋圖譜，S2為廣州白雲山和記黃埔中藥有限公司生產的E批號為7A001的複方消炎利膽片製劑，S3為廣州白雲山和記黃埔中藥有限公司生產的批號為E7A002的複方消炎利膽片製劑，S4為廣州白雲山和記黃埔中藥有限公司生產的批號為E7A003的複方消炎利膽片製劑，S5為廣東萬年青製藥有限公司生產的批號為0802106的複方消炎利膽片製劑，S6為廣東羅浮山藥業有限公司生產的批號為LO7G060的複方消炎利膽片製劑。表-8市售複方消炎利膽片的中藥製劑高效液相指紋圖譜相似度由表-8可以看出，市售的各廠家生產的多批次複方消炎利片指紋圖譜有一定的波動性，一些成分的含量有所變化，一些成分有缺失情況，但基本一致，與標準指紋圖譜的相似度不小於0.8。採用本發明提供的反相高效液相方法，能夠全面反映產品的質量，有效的控制複方消炎利膽片的產品質量。權利要求1、一種複方消炎利膽製劑的質量控制方法，該複方消炎利膽製劑含穿心蓮、溪黃草和苦木三味中藥，其特徵在於採用反相高效液相色譜法建立複方消炎利膽製劑的標準指紋圖譜和供試指紋圖譜，以供試指紋圖譜與標準指紋圖譜的相似度不小於0.8做為質量控制標準，所述標準指紋圖譜(採用UV檢測器)包含15個主要色譜峰，其中8個色譜峰的化學結構已經被準確指認，以穿心蓮內酯色譜峰的保留時間為1計算15個主要色譜峰的相對保留時間，並計算各色譜峰峰面積佔指紋圖譜總峰面積百分比，分別為1號峰0.118±0.001，3.08±0.04％；2號峰0.172±0.001，1.81±0.02％；3號峰0.322±0.002，3.71±0.06％；4號峰0.751±0.002，3.65±0.37％；5號峰0.782±0.001，3.77±0.11％；6號峰0.867±0.001，3.67±0.64％，迷迭香酸；7號峰0.876±0.001，3.73±0.06％；8號峰0.934±0.002，5.80±0.13％；9號峰1.000，25.40±0.26％，穿心蓮內酯；10號峰1.016±0.003，4.31±0.19％，苦木鹼己；11號峰1.096±0.001，4.89±0.21％，異穿心蓮內酯；12號峰1.118±0.001，3.53±0.29％，14-去氧穿心蓮內酯苷；13號峰1.158±0.001，4.21±0.14％，14-去氧-11，12-二去氫穿心蓮內酯苷；14號峰1.355±0.002，17.01±0.54％，脫水穿心蓮內酯；15號峰1.382±0.002，5.56±0.33％，新穿心蓮內酯。2、根據權利要求1所述的複方消炎利膽製劑的質量控制方法，其特徵在於包括如下步驟a、複方消炎利膽製劑標準指紋圖譜的建立取中藥穿心蓮、苦木各150g，切碎混合，用80％～85％乙醇加熱提取二次，濾過，濾液回收乙醇並濃縮成稠膏，得到43.5g浸膏；取溪黃草150g剪碎，加水煎煮二次，合併濾液，濾過，煎液濃縮至適量，加5倍量70％乙醇，搖勻，靜置，濾過，濾液回收乙醇並濃縮成稠膏，得到9g浸膏；分別取上述穿心蓮和苦木混合稠膏5g和溪黃草稠膏1.03g，合併，加入100mL70％的甲醇，超聲溶解，取4mL溶液過0.45μm微孔濾膜，然後取濾過液1.5mL，用固相萃取柱(DIKMAProElutTMC18)淨化，續濾液配製成終濃度為20mg/mL的供試品溶液；取穿心蓮內酯對照品，以適量甲醇溶解，製成每1mL甲醇中含有穿心蓮內酯1mg的溶液，即得穿心蓮內酯的對照品溶液；分別精密取上述供試品及對照品溶液10μL，參照國家藥典附錄中規定的反相高效液相法，注入高效液相色譜儀進行色譜分析，記錄色譜圖；以穿心蓮內酯的色譜保留時間為1計算各色譜峰的相對保留時間及各色譜峰面積的百分比，得到標準指紋圖譜；b、複方消炎利膽製劑供試指紋圖譜的建立取待測複方消炎利膽製劑20粒，若有糖衣除去糖衣，研細，分別取內容物1g，加入20mL70％的甲醇，超聲提取兩小時，取1mL過0.45μm微孔濾膜，然後取濾過液用固相萃取柱(DIKMAProElutTMC18)淨化，續濾液配製成終濃度為20mg/mL的供試溶液；穿心蓮內酯對照品溶液按步驟a所述製備；按步驟a所述條件對上述供試品和對照品溶液進行色譜分析，記錄色譜圖；以穿心蓮內酯的色譜保留時間為1計算各色譜峰的相對保留時間及峰面積，得到供試指紋圖譜；上述複方消炎利膽製劑的劑型是任何一種藥劑學上的劑型；c、供試複方消炎利膽片指紋圖譜與標準指紋圖譜的相似度不小於0.8。3、根據權利要求2所述的複方消炎利膽製劑的質量控制方法，其特徵在於所述複方消炎利膽製劑的劑型是複方消炎利膽片。4、根據權利要求2所述的複方消炎利膽製劑的質量控制方法，其特徵在於所述反相高效液相色譜法的色譜條件是採用十八烷基矽烷鍵合矽膠為固定相；採用連續梯度洗脫，流動相A為含有0.02％三氟乙酸的水溶液；流動相B為含有0.02％三氟乙酸的甲醇溶液；連續梯度洗脫程序如下0min時，流動相A為80％的0.02％的三氟乙酸水溶液，流動相B為20％的0.02％的三氟乙酸甲醇溶液；70min時，流動相A為30％的0.02％的三氟乙酸水溶液，流動相B為70％的0.02％的三氟乙酸甲醇溶液；流速為0.8mL/min；檢測波長為225nm；柱溫為40℃；進樣體積10μL；以穿心蓮內酯計算，理論塔板數不低於200000。全文摘要本發明涉及中藥的質量控制領域，具體涉及一種複方消炎利膽製劑的質量控制方法及其應用。包括標準指紋圖譜的建立，供試品指紋圖譜的建立以及二者的比對。本發明建立的複方消炎利膽製劑標準指紋圖譜，在225nm顯示15個主要色譜峰，並確認了其中8個色譜峰的化學結構。從8個化學結構中進一步確認了穿心蓮內酯、迷迭香酸和苦木鹼己這3個組分為抗炎作用的活性成分。作為方法的補充，可選擇上述3個組分或它們的組合作為指標性成分進行含量測定。本方法重複性高，穩定性好，操作方法簡便，且科學、有據，可有效的控制複方消炎利膽製劑的質量。文檔編號A61P1/00GK101361793SQ200810198869公開日2009年2月11日申請日期2008年9月27日優先權日2008年9月27日發明者姚新生,昊高,峰趙,李晨陽,王國才,焦偉華,龍張,飛賀,毅戴,姚志紅,周光雄,葉文才申請人:暨南大學