一種具有抗氧化活性的金耳發酵液多糖的製備方法
2023-10-20 14:42:17 1
一種具有抗氧化活性的金耳發酵液多糖的製備方法
【專利摘要】本發明屬生物工程技術應用領域，具體涉及一種具有抗氧化活性的金耳發酵液多糖的製備方法。該多糖為白色或淡黃色粉末，是金耳斜面菌種通過活化，搖瓶液體發酵，乙醇沉澱，脫蛋白，葡聚糖凝膠柱G-100層析、透析後冷凍乾燥得到的。產量為6.6mg/100mL發酵液，用苯酚-硫酸法測得多糖含量為85.85％，可應用於製備具有抗氧化，防衰老功能的保健品。
【專利說明】一種具有抗氧化活性的金耳發酵液多糖的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種具有抗氧化活性的金耳發酵液多糖的製備方法。屬生物工程技術應用領域。
【背景技術】
[0002]金耳為擔子菌綱，銀耳目，銀耳科，銀耳屬的乾燥子實體，主要分布於我國西藏雲南等地，野生資源稀有，古籍文獻記載用於肺熱、痰多、咳嗽、氣喘等症的治療，具有較高的藥用價值。研究表明，金耳深層發酵液中含有人體必需的胺基酸，並且有鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、鋅等礦質元素。是一種集營養、保健、理療於一身的綠色食品。通過熱水浸提獲得的多糖，具有一定的抗氧化活性，可應用於保健品行業。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種具有抗氧化活性的金耳發酵液多糖的製備方法
[0004]本發明的技術方案為:將金耳斜面保藏菌種活化，接種至搖瓶種子液體培養基中培養，待菌絲體分散後將培養好的種子液接入搖瓶發酵液體培養基培養。發酵結束後，抽濾收集發酵液，濃縮後乙醇沉澱，脫蛋白、葡聚糖凝膠柱G-200層析、透析後冷凍乾燥得到金耳發酵液多糖，最後進行體外抗氧化實驗。
[0005]本發明發明的金耳發酵液多糖具有一定的抗氧化活性。可以作為原料應用於保健食品等領域。
[0006]上述技術方案中，搖瓶種子培養基為PDAlL加磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，牛肉膏2g，蛋白腖lg，VBl 10-20mg,pH6.0，發酵培養基為葡萄糖4g/100mL、酵母粉lg/100mL、磷酸二氫鉀 0.3g/100mL、硫酸鎂 0.15g/100mL、VBl l-2mg/100mL, pH6.0，250mL 三角瓶裝培養基IOOmL於28°C，220r / min，振蕩培養10_14d。多糖提取方法為發酵結束後抽濾取發酵液，用旋轉蒸發儀濃縮至原體積的I / 5，加入4倍體積95%乙醇在4°C醇析，沉澱物用蒸餾水復溶後用Sevage法去除游離蛋白，葡聚糖凝膠G-100層析柱純化，蒸餾水透析，冷凍乾燥後得到金耳發酵液多糖。抗氧化試驗將總還原能力，清除羥基自由基、DPPH的能力作為指標。
【具體實施方式】
[0007]下面的實例將具體說明本發明的操作方法，但不能作為對本發明的限定。
[0008]實例一
[0009]1.發酵液製備
[0010]出發菌種為本實驗室金耳斜面保藏菌種；
[0011](I)搖瓶種子培養
[0012]搖瓶種子培養基=PDAlL加磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，牛肉膏2g，蛋白腖lg，VBl10_20mg，pH6.0 ；
[0013]培養方法:從斜面菌種中取3~4塊黃豆大小相同的菌塊，接種於搖瓶種子培養基中，250mL三角瓶裝培養基IOOmL於28°C，220r / min，振蕩培養IOd ;搖瓶中預先裝有經過消毒滅菌的玻璃珠，用於打散菌絲體。
[0014](2)搖瓶發酵培養
[0015]發酵培養基:葡萄糖4g/100mL、酵母粉lg/100mL、磷酸二氫鉀0.3g/100mL、硫酸鎂0.15g/100mL、VBl l_2mg/100mL，ρΗ6.0 ；
[0016]培養方法:將培養好的種子以15%的接種量接入搖瓶發酵培養基中28°C，220r /min，振蕩培養14d ；
[0017](3)發酵液濃縮，醇沉，脫蛋白，凝膠柱層析，透析
[0018]培養後抽濾，取發酵液用旋轉蒸發儀濃縮至原體積的I / 5，加入4倍體積95%乙醇在4°C醇析過夜，離心收集沉澱物，用95%乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌數次。待有機溶劑揮發完畢，將沉澱物用蒸餾水完全溶解，用Sevage法去除游離蛋白，具體為按發酵液I / 5的體積加入氯仿，然後加入氯仿體積I / 5的正丁醇，混合後振蕩20min。蛋白質與氯仿-正丁醇生成凝膠，4000rpm離心20min,收集上清液,反覆操作8次至氯仿-正丁醇層不渾池為止。收集上清液用S^hadexG-1OO凝膠層析對多糖進行純化，流動相為0.1MNaCl,流速
0.5mL / min,每管3mL。以苯酹-硫酸法在490nm處檢測每管的糖濃度,測定該多糖的純度。多糖復溶後裝入透析袋中，紮緊袋口，懸浮於蒸餾水中，透析48h，中間每隔12小時換水一次，然後冷凍乾燥，得多糖樣品，採用苯酚-硫酸法測總糖含量，為85.85%。
[0019]實例二
[0020]將製備得到的金耳發酵液多糖進行抗氧化活性實驗，以蒸餾水為空白對照，以抗壞血酸為陽性對照，數據經SPSS13.0軟體分析。
[0021]1.實驗方法
[0022](I)還原力測定:
[0023]在具塞試管中加入1.0mL不同濃度的金耳發酵液多糖樣品(50_1000ug/mL)、0.2mLPBS(2.0M, pH6.6)和0.25mLl%鐵氰化鉀溶液。置50°C恆溫水浴中反應20min，迅速冷去卩，再加入0.5mL的10% (w / V)三氯乙酸溶液,3000g離心IOmin,取上清液1.5mL,加入0.1mLl %三氯化鐵溶液和3.0mL去離子水，振蕩均勻，靜置5min，在700nm處以蒸餾水為空白測定其吸光值，吸光值越大，說明其還原力越高。
[0024](2)對羥自由基的清除:
[0025]在試管中依次加入1.0mL不同濃度的金耳菌絲體多糖(發酵液多糖)樣品(50-1000ug/mL)，0.9mL 的 FeSO4 (0.15mM)，0.5mL 水楊酸(9mM) 0.5mLH202 (8.8mM)，37°C 反應60min,於51Onm處測得不同多糖濃度下的吸光值Ai ,用水替代多糖樣品時的吸光值Aj,用水代替多糖和H2O2時測得空白對照吸光值Atl.按下式計算羥自由基(.0H)的清除率:.0H清除率(％ ) = [ (A1-Aj) / (A0-Aj) ] X 100
[0026](3)對DPPH.自由基的清除
[0027]樣品管中加入1.0mL不同濃度的多糖溶液(50_1000ug/mL)與3.0mL的0.004%溶於95%乙醇的DPPH溶液，對照管用95%乙醇代替DPPH溶液；空白管用蒸餾水代替多糖溶液。以上三組置於室溫靜置30min後，用0.55mL蒸餾水和3.0mL95%的乙醇調零，於517nm處測定吸光值。
[0028]結果顯示:[0029](I)還原力測定:試驗組和陰性對照組比較，P < 0.01，顯示在還原力方面兩者有高度顯著性差異，表明其具有一定的還原力；各多糖還原能力隨多糖濃度的增加呈現出穩定增長趨勢；試驗組與陽性對照組相比，P < 0.05，表明多糖的還原力不及抗壞血酸。
[0030](2)對羥基自由基的清除:試驗組和陰性對照組比較，P < 0.05，顯示兩者在對羥基自由基的清除方面有顯著性差異，表明金耳發酵液多糖具有一定的清除羥基自由基能力；試驗組不同濃度的多糖之間進行比較時，隨著多糖濃度的增加，對DPPH自由基清除能力均呈現增長的趨勢；試驗組與陽性對照組相比，P < 0.05，表明多糖對羥基自由基的清除能力不及抗壞血酸。
[0031](3)對DPPH的清除能力:試驗組和陰性對照組比較，P < 0.01，顯示兩者在對DPPH的清除能力方面有高度顯著性差異，表明多糖具有一定的清除DPPH能力；試驗組不同濃度的多糖之間進行比較時，隨著多糖濃度的增加，各多糖對羥基自由基清除能力呈穩定的增長；試驗組與陽性對照組相比，P < 0.05，表明多糖對DPPH的清除能力不及抗壞血酸。
【權利要求】
1.一種具有抗氧化活性的金耳發酵液多糖的製備方法，其特徵在於多糖外觀為白色或淡黃色粉末，是將金耳斜面菌種，移至搖瓶種子培養基中培養，將培養好的種子液接入搖瓶發酵培養基培養，發酵結束後，抽濾取發酵液濃縮，乙醇沉澱，脫蛋白，凝膠層析柱純化，透析後冷凍乾燥得到金耳發酵液多糖，多糖含量為85.85 %，最後進行體外抗氧化實驗，顯示該多糖具有一定的抗氧化活性。
2.如權利要求1所述的搖瓶種子培養基和搖瓶發酵液體培養基，其特徵在於兩者的組成分別為=PDAlL加磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，牛肉膏2g，蛋白腖lg, VBl 10-20mg,pH6.0和葡萄糖 4g/100mL、酵母粉 lg/100mL、磷酸二氫鉀 0.3g/100mL、硫酸鎂 0.15g/100mL、VBll-2mg/100mL, pH6.0。
3.如權利要求1所述的在搖瓶種子培養基中培養的方法和在搖瓶發酵培養基中培養的方法，其特徵在於前者為28°C，220r / min，振蕩培養10d，後者為28°C，220r / min，振蕩培養14d。
4.如權利要求1所述的凝膠層析柱純化，其特徵在於用的是葡聚糖凝膠G-100填料。
【文檔編號】C12P19/04GK103555787SQ201310491992
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月16日 優先權日:2013年10月16日
【發明者】鄧超, 付海田, 陳敬華 申請人:江南大學