一種山羊CSN1S1基因插入/缺失的檢測方法及其應用與流程

2023-10-20 08:03:42

本發明屬於生物技術與家畜育種領域，涉及基因插入/缺失(indel)的檢測，特別涉及快速、準確檢測山羊csn1s1基因nc_030813.1:g.6654-6664位11-bp插入/缺失(indel)多態性的方法及其應用。

背景技術：

動物育種技術主要包括以表型和表型值為基礎的常規育種技術和以dna多態為基礎的分子育種技術。作為分子育種技術體系的重要組成部分，分子標記輔助選擇(marker-assistedselection，mas)育種技術首先檢測重要基因的dna多態性，然後分析dna多態與遺傳性狀之間的相關性，最後再根據與遺傳性狀顯著相關的dna標記進行性狀選擇。作為現代分子生物學技術發展過程中孕育而生的新技術，mas育種技術可以在dna水平上快速準確地分析個體的遺傳組成，通過有性雜交將目的基因轉移到需要改良的親本中，將目標基因型的鑑定與傳統育種相結合，從而實現對基因型的直接選擇，提高育種目標的定向性，在克服表型鑑定的困難、早期選擇、進行無損害的性狀評價和選擇及提高回交育種效率等方面具有優越性。

在mas育種技術體系中，尋找重要功能基因、篩查重要基因遺傳變異位點，並分析重要功能基因遺傳變異位點與生長性能的相關性，是標記輔助選擇(mas)技術應用的前提和關鍵。插入/缺失(insertion/deletion,indel)多態性是一種新型分子標記，它是指dna序列上核苷酸片段的插入或缺失而引起dna序列的改變，造成包括人類在內的物種之間染色體基因組的多樣性，其片段長度在1-50bp之間。利用indel分析個體基因組可以更好地解釋個體的表型差異，因此從dna水平上對小片段核苷酸的差異進行indel檢測在動物分子育種的mas體系中具有重要意義。

插入/缺失(indel)是dna或蛋白質序列水平上發生頻率僅次於殘基替換的進化改變，indel多態性是人類基因組中一種特殊類型的二等位基因遺傳標記，表現為基因組中插入或缺失了不同大小的小片段dna。indel大致分成以下5大類：(1)單鹼基對的插入/缺失；(2)單一鹼基的插入/缺失；(3)重複單元為2～15個鹼基的多鹼基對插入/缺失；(4)轉座子插入/缺失；(5)任意dna序列的插入/缺失多態性。隨著比較基因組學的深入研究，indel為理論研究和遺傳育種應用研究提供了大量的生物信息，其作為新一代的遺傳學鑑定標記，兼具snp的優點。與snp相比，均是源於單突變事件，其突變頻率較低，約為10-8，相對比較穩定：在結構上屬於二等位基因多態性，等位基因都固定且已知，能夠通過很小的擴增子進行擴增(<50bp)，提高了擴增被高度降解dna的成功率。作為一種重要的遺傳標記，indel的研究最早聚焦在分子生物學及生物醫學領域。遍布於整個基因組的indel發生頻率僅次於snp位居第二，其中約三分之一位於已知的基因區域內，還有一些位於決定基因功能的關鍵性區域如啟動子區和外顯子區。分子生物學家最早將其用於基因表型相關的研究，希望通過將人類性狀、疾病症狀或是易感性進行聯繫，從而達到基因診斷和治療的目的。2005年schnabel等人結合ssr標記和indel標記對控制奶牛產奶量進行了研究，並成功進行了精細定位，同時提出indel和snp的形成機制可能不同，但其進化史是相似的。indel的研究多集中在人類和各種農作物(如水稻和玉米等)的基因組研究中，在畜禽上則集中在對雞生長性狀的研究，在反芻動物上研究和應用甚少。由此，對反芻家畜的功能性基因的indel標記研究亟待開拓和深入。

隨著經濟發展和人們生活水平的提高，社會對山羊產品的需求不斷加強，但由於近年來羊肉、羊奶、羊絨等羊產品嚴重短缺，所以山羊育種專家期望儘快培育出更早、更好、更快地獲得山羊產品的優良品種。在高產、優質和高效的山羊育種目標上，如何提高產羔數一直是關注熱點，不僅依靠傳統育種手段，還需要依靠分子育種技術。即首先在dna水平上篩查和檢測與山羊生長發育性狀密切相關的dna標記，然後進行基因多態性的檢測，最後是進行基因多態性與產羔性狀的關聯分析，從而實現mas和早期診斷選擇。

哺乳動物泌乳期乳腺合成分泌大量蛋白質，酪蛋白(caseins)佔乳蛋白總量80％(mercierandvilotte,1993)，包含αs1酪蛋白(csn1s1)、β酪蛋白(csn2)、αs2酪蛋白(csn1s2)以及κ酪蛋白(csn3)(ollieretal.,2008；nilsenetal.,2009)。酪蛋白在乳腺中廣泛表達，含有幾乎全部必需胺基酸，在腸鈣吸收、炎症反應(hatorietal.,2008)和免疫調控(biceretal.,2009)等方面有重要作用，近幾年發現，不同基因型的csn1s1基因與酪蛋白含量、脂肪含量、乳凝固時間、凝固硬度以及乳固體含量顯著相關(calvoetal.,2013；mastrangeloetal.,2013；mestawetetal.,2013；skeieetal.,2014)。最近又有研究表明其在生長性狀上又可影響牛犢的體重(taitetal.,2016)。

目前，對csn1s1基因的研究主要集中在與泌乳及乳成分相關性狀的研究上，對csn1s1基因遺傳變異與繁殖性狀相關性的研究匱乏。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種山羊csn1s1基因插入/缺失的檢測方法及其應用，即利用pcr擴增方法檢測山羊csn1s1基因的插入/缺失(indel)多態性，從而加快良種選育速度。

為達到上述目的，本發明採用了以下技術方案：

一種山羊csn1s1基因插入/缺失多態性的檢測方法，包括以下步驟：

以待測山羊全基因組dna為模板，以引物對p1為引物，pcr擴增山羊csn1s1基因部分片段(內含子)；再對pcr擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定山羊csn1s1基因上的插入/缺失多態性；

所述引物對p1包括用於pcr擴增山羊csn1s1基因上11-bp插入/缺失多態位點的上、下遊引物：

上遊引物：5』-gctggaagcagttcgtca-3』；

下遊引物：5』-gggttgatagccttgtatgtt-3』。

所述山羊csn1s1基因上的插入/缺失多態性是指nc_030813.1:g.6654-6664位11-bp插入/缺失多態性。

所述pcr擴增的反應程序為：95℃預變性5min；94℃變性30s，60.5℃復性30s，72℃延伸25s，35個循環；72℃延伸10min。

所述的瓊脂糖凝膠電泳是質量濃度3.0％的瓊脂糖凝膠電泳。

所述山羊csn1s1基因上的插入/缺失(indel)多態性的瓊脂糖凝膠電泳結果為：插入/插入(ii)基因型表現為170bp的一條帶紋；插入/缺失(id)基因型表現為170bp和159bp以及異源雙鏈條帶共三條帶紋；缺失/缺失(dd)基因型表現為159bp的一條帶紋。

一種山羊csn1s1基因插入/缺失多態性的檢測試劑盒，包括上述引物對p1。

山羊csn1s1基因nc_030813.1:g.6654-6664位存在的11-bp插入/缺失(indel)多態性位點在山羊分子標記輔助選擇育種中應用。

所述插入/缺失(indel)多態性位點的插入/插入(ii)基因型可作為提高山羊母羊第一胎產羔數的dna分子標記。

本發明的有益效果體現在：

本發明根據山羊csn1s1基因nc_030813.1:g.6654-6664位存在11-bp插入/缺失(indel)多態性設計引物，以山羊基因組dna為模板，進行pcr擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳鑑定，能夠簡單、快速、低成本、精確地檢測山羊csn1s1基因第6654-6664位的插入/缺失多態性。

本發明對山羊csn1s1基因第6654-6664位插入/缺失多態性位點進行基因型和基因頻率分析，對上述插入/缺失多態性位點與山羊相關繁殖性狀(第一胎產羔數)進行關聯分析，結果表明該位點能夠作為山羊產羔數(p<0.01)的分子標記，有利於快速建立高產羔數性狀的優良山羊種群，加快良種選育速度。

附圖說明

圖1為引物對p1擴增山羊csn1s1基因產物的3％瓊脂糖凝膠電泳結果；m表示marker，a表示異源雙鏈條帶。

圖2為山羊csn1s1基因pcr擴增產物測序圖；(a)ii基因型，(b)dd基因型，方框標出的部分為11-bp缺失序列：nc_030813.1:g.6654-6664deltttccgtaatg。

圖3為山羊csn1s1基因11-bpindel序列分析圖；圖中上方序列為插入型，下方序列為缺失型，參考序列為ncbi網站上公布的山羊csn1s1基因序列nc_030813.1。

圖4indel基因型(genotypes)與產羔數(littersize)關聯分析圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明做詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。

本發明利用pcr方法對山羊csn1s1基因第6654-6664位點突變可能產生的插入/缺失多態性進行檢測，並將其與山羊相關繁殖性狀(第一胎產羔數)進行關聯分析，驗證其是否可以作為山羊分子育種中輔助選擇的分子標記。

1.實驗藥品與試劑

1.1生化試劑與生物學試劑：①taqdna聚合酶(購自fermantas即mbi公司)；②蛋白酶k(購自華美生物工程公司)；③markeri(購自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2普通試劑：普通試劑從華美生物工程公司購買，為進口分裝產品：檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖、tris、edta、nacl、naoh、kcl、na2hpo4、kh2po4、tris飽和酚、氯仿、異戊醇、無水乙醇、醋酸鈉、十二烷基磺酸鈉(sds)、溴化乙錠(eb)、溴酚藍、二甲基苯氰ff、乙酸、蔗糖、硼酸、瓊脂糖等。

1.3溶液與緩衝液：所有溶液與緩衝液均採用去離子超純水配製。高壓滅菌條件為15bf/in(1.034×105pa)，25min。試劑配製方法均參考sambrook等編著的《分子克隆實驗指南》。

1)提取組織樣dna所用溶液：

除了基因組dna提取時的公用溶液外，還配製以下溶液：①2mol/lnacl：11.688g溶於水，定容至100ml，高壓滅菌。②組織dna提取液(100ml)：lmol/ltris-cl(ph8.0)lml，0.5mol/ledta(ph8.0)20ml，2mol/lnacl5ml，定容至100ml。

2)瓊脂糖電泳分析所用溶液

①0.5×tbe緩衝液：取10×tbe50ml定容至1000ml。②上樣緩衝液：0.25％溴酚藍，0.25％二甲基苯氰ff，以及40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

2.設計山羊csn1s1基因indel引物

在ncbi上檢索山羊csn1s1基因的序列(山羊csn1s1基因參考序列nc_030813.1)，並利用primer5.0設計能夠擴增包含山羊csn1s1基因第6654-6664位區域indel位點的pcr引物對p1，其引物序列如下，參見圖2、圖3：

上遊引物：5』-gctggaagcagttcgtca-3』(18bp，seq.id.no.1)；

下遊引物：5』-gggttgatagccttgtatgtt-3』(21bp，seq.id.no.2)。

上述引物對p1對山羊基因組擴增，能夠擴增包含山羊csn1s1基因(nc_030813.1:g.6654-6664序列)的片段。理論上，當6654與6664位之間的tttccgtaatg(seq.id.no.3)缺失時，pcr產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測之後是159bp大小的帶紋；6654與6664位之間的tttccgtaatg存在時，pcr產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測之後是170bp大小的一條帶紋。6654與6664位之間的tttccgtaatg同時出現插入和缺失時，pcr產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測之後是159bp+170bp兩條帶紋以及一條異源雙鏈條帶。為此，根據理論分析結果，插入/插入(ii)基因型表現為170bp一條帶紋；插入/缺失(id)基因型表現為159bp+170bp及異源雙鏈三條帶紋；缺失/缺失(dd)基因型表現為159bp一條帶紋。

3.pcr擴增待測山羊csn1s1基因片段

3.1山羊耳組織樣品的採集

實驗所用的動物為陝北白絨山羊共計1835個樣本，採自陝西省榆林市狄青塬陝北白絨山羊原種場、佳縣方塌鎮瑞興種羊場、神木縣聚科農牧發展有限公司、定邊縣香草園農牧業科技有限公司和榆林學院羊場；橫山縣橫山鎮、趙石畔鎮、塔灣鎮養殖場；榆林市榆陽區芹河鎮、金雞灘鎮、麻黃梁鎮養殖場。每個個體都具有完整的第一胎產羔數記錄。採用隨機採樣方式採取個體耳組織樣品，70％乙醇保存，冰盒低溫帶回實驗室後置於-80℃凍存。

3.2組織樣品基因組dna的提取與分離

1)取約10mg耳組織樣，放於1.5ml的離心管中，用小剪刀儘量剪碎。

2)加入600μl組織dna提取液，10％sds至終濃度為1％，蛋白酶k至終濃度為100μg/ml，55.0℃消化過夜，最好保證組織樣較均勻地分布在組織dna提取液中。

3)將溶液冷卻至室溫，加入等體積的tris飽和酚，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，至少持續10min以上，12000r/min離心15min。

4)取上清液，加入等體積的tris飽和酚:氯仿(1:1,v/v)，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，至少持續10min以上，12000r/min離心15min。

5)取上清液，加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1,v/v)，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，至少持續10min以上，12000r/min離心15min。

6)取上清液，加入2倍體積的冰冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l乙酸鈉，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，直至液體清亮，出現白色絮狀dna。

7)挑出dna，放進一個1.5ml的離心管中，加入500μl70％乙醇，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，然後12000r/min離心3～5min，小心倒掉乙醇，將管倒置於吸水紙上。

8)再一次向離心管中加入500μl70％乙醇，蓋緊管蓋，緩慢地來回顛倒離心管，然後12000r/min離心3～5min，小心倒掉乙醇，將管倒置於吸水紙上。

9)待乾燥後，加入60μl滅菌超純水，為使其完全溶解，4℃保存過夜，待檢測。

3.3瓊脂糖凝膠電泳檢測dna

1)將凝膠電泳槽洗乾淨，用膠帶紙將兩端封住，插上梳子。

2)稱取1.2g的瓊脂糖，轉入三角瓶中，加入0.5×tbe40ml使其懸浮，微波爐中火加熱，待沸騰2次拿出，待其冷卻至不燙手時加入終濃度為0.5μg/ml的eb。

3)混勻後(約60℃)，立即將瓊脂糖溶液到入槽內。如出現氣泡，立即用移液器移出。

4)完全冷卻凝固(約25～40min)後，拔掉梳子，去掉兩端膠帶紙。

5)向電泳槽中加入1×tbe緩衝液，使液面高出膠面2～5mm。

6)取基因組dna樣品2～4μl，加2μl上樣緩衝液後混勻，統一上樣(注意槍頭的順序應前後對應)，並將dnamarker加在一邊。

7)80v電壓電泳2h。

8)在紫外分析儀上觀察，如果有rna則需要純化，如果有明顯降解，需重新提取相應樣品的dna。

3.4dna的純化

1)500μl的dna溶液中加入10％sds使其終濃度為0.1％，加入蛋白酶k至終濃度達到100μg/ml。

2)55℃保溫10h左右。

3)苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1,v/v/v)和等體積氯仿分別抽提一次。

4)12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中。

5)加入1/10體積3mol/l醋酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇沉澱dna。

6)倒掉液體，70％乙醇洗滌後涼幹，加入60μl滅菌超純水溶解，4℃待檢測。

3.5分光光度法檢測基因組dna

用紫外光光度計測定dna樣品在260nm、280nm處的od值。計算dna含量和od260/od280的比值。如od260/od280比值小於1.6，說明樣品中含有較多的蛋白質或酚，則應進行純化；若比值大於1.8，則應該考慮去除rna。

dna濃度(ng/μl)＝50×od260值×稀釋倍數

dna檢測完畢後，取出一定的量稀釋至50ng/μl(模板dna)，存於-20℃備用，其餘的存放於-80℃。

3.6pcr擴增

pcr反應體系採用混合加樣法，即根據每一個反應體系所需的各種組分的數量和1次反應所需的pcr反應的個數，算出各種反應組分的總量，加入到1個1.5ml離心管中，充分混勻後瞬時離心，再分裝到每個0.2mlpcr管中，然後加入模板dna，再瞬時離心後進行pcr擴增；pcr反應體系包括2×taqpcrsupermix(包括taqdna聚合酶、dntps和反應緩衝液，濃度為2×)12.5μl；上遊引物1.0μl；下遊引物1.0μl(上、下遊引物濃度為10pmol/μl)；基因組dna(濃度為50ng/μl山羊基因組dna)1.0μl；去離子水9.5μl；共25μl體積的pcr擴增體系。

3.7pcr反應的程序

pcr擴增反應程序為：

1)95℃預變性5min；

2)94℃變性30s，60.5℃復性30s，72℃延伸25s，共35個循環；

3)之後，72℃延伸10min；10℃保存擴增產物。

4.擴增pcr產物後瓊脂糖凝膠電泳檢測分析

瓊脂糖凝膠電泳檢測分3步：

1)製作3.0％的瓊脂糖凝膠，點樣後120v電壓電泳1.0-1.2h，電泳結束後eb染色；

2)待分子量不同的dna片段分離清晰時，在bio-radgeldoc2000凝膠成像系統成像；

3)根據瓊脂糖凝膠電泳結果分析indel多態性；

用bio-radgeldoc2000凝膠成像系統照相分析，判斷indel的多態性：

參見圖1，山羊基因組的csn1s1基因的第6654-6664位點的indel的多態性的瓊脂糖凝膠電泳結果為ii基因型表現為170bp一條帶紋；id基因型表現為159bp+170bp及異源雙鏈三條帶紋；dd基因型表現為159bp一條帶紋。

5.山羊csn1s1基因indel位點的頻率統計分析

1)基因和基因型頻率

基因型頻率是指一個群體中某一性狀的某種基因型個體數佔總個體數的比率。pnn＝nnn/n，其中pnn代表某一位點的nn基因型頻率；nnn表示群體中具有nn基因型的個體數；n為檢測群體的總數量。

基因頻率是指一個群體中某一基因數對其等位基因總數的相對比率。計算的公式可以寫成：pn＝(2nnn+nna1+nna2+nna3+nna4+……+nnam)/2n

式中，pn表示等位基因n頻率，nnn表示群體中具有nn基因型的個體數量，nnai表示群體中具有nai基因型個體數量，a1－am為等位基因n的m個互不相同的復等位基因。

山羊csn1s1基因插入/缺失多態性位點中的等位基因型頻率及等位基因頻率如表1所示。

表1.山羊csn1s1基因第6654-6664位indel基因頻率分布表

6.山羊csn1s1基因indel位點基因效應的關聯分析

基因型數據：pcr擴增後瓊脂糖凝膠電泳識別的基因型；

生產數據：陝北白絨山羊初產羔數。

關聯分析模型：利用spss(18.0)軟體來分析品種，不同因素與生長性狀相關性。首先要對所得數據描述性的統計分析，來確定是不是存在離群值。然後根據數據的特性，利用方差分析、多元線性模型或者t分析進而來分析基因型的效應。在數據處理的過程中，考慮到個體的效應，基因之間的互作以及基因型的效應，採用固定的模型來進行相關分析。此外，根據實際條件來進行取捨，完整模型如下所示：y＝μ+g+e，其中，y：個體表型記錄；u：總體均值；g：標記基因型效應；e：隨機誤差。

結果表明：第一胎產單羔和產雙羔的山羊個體csn1s1基因不同基因型頻率分布之間存在顯著差異(χ2＝65.042,p<0.001)，表明csn1s1基因不同基因型對山羊第一胎產羔數性狀有顯著差異；第一胎產單羔和產雙羔的山羊個體csn1s1基因不同等位基因頻率分布之間存在顯著差異(χ2＝74.654,p<0.001)，表明csn1s1基因不同等位基因對山羊第一胎產羔數性狀有顯著差異。

由表2和圖4可以看出，在對1835隻陝北白絨山羊的產羔性狀研究中，cs1ns1基因的插入/缺失多態性對其產羔數有極顯著影響(p<0.01)，ii基因型個體性狀優於id和dd基因型個體；id基因型個體性狀優於dd基因型個體。結論：ii基因型可以作為山羊繁殖性狀(產羔數)的遺傳標記。

表2.山羊csn1s1基因11bpindel不同基因型與第一胎產羔數之間的相關性分析

總之，本發明建立了一種山羊csn1s1基因插入/缺失多態性的檢測方法，為山羊繁殖性狀的標記輔助選擇(mas)應用提供理論和實踐支撐。

西北農林科技大學

一種山羊csn1s1基因插入/缺失的檢測方法及其應用

3

1

18

dna

人工合成

1

gctggaagcagttcgtca18

2

21

dna

人工合成

2

gggttgatagccttgtatgtt21

3

11

dna

capraaegagrushircus

3

tttccgtaatg11