東革阿里提取物、寬纓酮及其製備方法和應用與流程
2023-10-08 11:30:29 2
本發明屬於醫藥技術領域，涉及東革阿里提取物及其製備方法、寬纓酮及其製備方法，還涉及寬纓酮、東革阿里提取物及其含有它們的組合物在製備抗腫瘤、抗痛風和高尿酸血症的藥物、保健食品、功能性食品、食品中的應用。
背景技術：
東革阿里(Eurycoma longifolia Jack.)，又名Tongkat Ali，苦木科Eurycoma屬植物，野生灌木，生長於赤道附近原始熱帶雨林潮溼砂質土壤中，主要分布於馬來西亞、印度尼西亞、泰國、越南、寮國、柬埔寨等東南亞國家。其提取物(尤其是根)在治療男性性功能障礙等疾病中具有顯著療效；此外，其還具有解熱、提升體力、減輕疲勞、殺菌、抗潰瘍以及抗高血壓、降血糖等功效。儘管東革阿里具有極大的藥用價值，但時至今日國內外仍無任何有關其抗痛風、抗腫瘤的相關報導，極大的限制了其應用。
寬纓酮(eurycomanone)，東革阿里主要成分，可通過增加小鼠的睪酮和精子形成來提高小鼠的生育率，但影響機制並不完全清楚。該化合物在痛風、腫瘤等疾病領域的活性報導尚為空白，其結構及波譜數據(DMSO-d6)如下：
寬纓酮結構式
技術實現要素：
本發明的目的是提供東革阿里活性提取物及其製備方法，寬纓酮及其製備方法，還涉及及它們的組合物在製備抗痛風、抗高尿酸血症、抗腫瘤的藥物、保健品、功能性食品、食品中的應用。
本發明提供的東革阿里提取物，是通過以下方法製備得到，
取乾燥東革阿里(Eurycoma longifolia Jack.)藥材，經水或醇提取，將提取液濃縮，回收溶劑，乾燥，得東革阿里總提取物。
總提物進一步經大孔樹脂色譜法分離純化，得到東革阿里精提取物；或將上述總提物分散於水中，用等體積的有機溶劑萃取，回收溶劑，得到東革阿里精提取物。
其中，所述提取的醇為5-95％的乙醇水或甲醇水溶液，優選為35-95％乙醇水或甲醇水溶液，提取方式為加熱回流、連續加熱回流(沙氏提取法)、超聲提取。
所述的水可以為中性水或酸性水，方式為超聲提取、浸漬法、滲漉法、煎煮法。
所述的東革阿里藥材包括其根、根皮、莖、莖皮、葉、花和果實。
所述提取的取次數為2-3次，提取時間為0.5-4小時。
所述濃縮方式為常壓蒸餾和減壓蒸餾，乾燥方式為常溫加熱乾燥和減壓乾燥。
所述大孔吸附樹脂分離純化，為依次用水，體積比例為20-30％乙醇-水、40-95％的乙醇-水洗脫，富集40-95％的乙醇-水洗脫液。所述步驟中，回收濃縮方式為常壓蒸餾和減壓蒸餾。
所述萃取採用的有機溶劑包括氯仿(或二氯甲烷)、乙酸乙酯、正丁醇的一種、兩種或者三種。
本發明提供的寬纓酮，是通過以下方法製備得到，
上述東革阿里提取物，經矽膠柱色譜，採用溶劑梯度洗脫，製備寬纓酮。必要時(含有少量雜質或色素等)可經過重結晶處理得到精製的高純度目標化合物寬纓酮。
所述梯度洗脫的溶劑為體積比25:1-10:1的二氯甲烷(或氯仿)-甲醇，優選體積比20:1-12.5:1的二氯甲烷(或氯仿)-甲醇系統；或體積比12:1-3:1的石油醚(或正己烷)-丙酮，優選體積比10:1-5:1石油醚(或正己烷)-丙酮系統洗脫；即可分離得到寬纓酮。
若製備目標化合物含有少量雜質或色素等，所述重結晶選用的溶劑為正己烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、水，或上述溶劑中任意兩種的混合溶劑，其比例為體積比0:1-1:0，重結晶後得到精製的高純度(98％以上)的寬纓酮。
上述東革阿里總提取物、精提取物、寬纓酮、或它們與藥物、食 品、功能性食品和保健品等中可接受的賦形劑、輔料等組成的組合物，可用於製備抗腫瘤、抗痛風和抗高尿酸血症的藥物、保健品、功能性食品、以及食品的應用。
具體實施方式
下面的實施例將對本發明予以進一步的說明，但並不因此而限制本發明。
實施例1
東革阿里根4kg，粉碎後用12倍，10倍和8倍的35％醇80℃下加熱提取三次，(第一次3小時，第二次2小時，第三次2小時)過濾，合併濾液，回收溶劑得提取物，收率為12％。
實施例2
東革阿里根皮4kg，粉碎後用12倍，10倍和8倍的50％醇室溫下溫浸提取三次，(第一次4小時，第二次4小時，第三次3小時)過濾，合併濾液，回收溶劑得提取物，收率為11％。
實施例3
東革阿里莖4kg，粉碎後用12倍，10倍和8倍的60％醇80℃下加熱提取三次，(第一次4小時，第二次3小時，第三次3小時)過濾，合併濾液，回收溶劑得提取物，收率為15％。
實施例4
東革阿里莖皮4kg，粉碎後用12倍，10倍和8倍的80％醇80℃下加熱回流提取三次，(第一次4小時，第二次3小時，第三次3小時)過濾，合併濾液，回收溶劑得提取物，收率為12％。
實施例5
東革阿里根4kg，粉碎後用12倍，10倍和8倍的95％醇80℃下加熱回流提取三次，(第一次4小時，第二次3小時，第三次3小時)過濾，合併濾液，回收溶劑得提取物，收率為11％。
實施例6
東革阿里根4kg，粉碎後用12倍，10倍和8倍的中性水80℃下煎煮法提取三次，(第一次4小時，第二次3小時，第三次3小時)過濾，合併濾液，回收溶劑得提取物，收率為12％。
實施例7
東革阿里根4kg，粉碎後用15倍的酸性水，採用滲漉法提取，過濾，合併濾液，調節pH值中性，回收溶劑得提取物，收率為10％。
實施例8
取東革阿里水提取物分散於水中，分別用等體積的氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶劑，得到乙酸乙酯萃取物，乾燥後得東革阿里精提取物，收率為5％。
實施例9
取東革阿里醇提取物分散於水中，分別用等體積的氯仿、正丁醇萃取，回收溶劑，得到正丁醇萃取物，乾燥後得東革阿里精提取物，收率為8％。
實施例10
取東革阿里水提取物，經HPD100型大孔吸附樹脂色，依次用水，體積比例為30％乙醇/水、65％的乙醇-水洗脫，65％的乙醇/水洗脫液 濃縮乾燥，得到東革阿里精提取物，收率為5％。
實施例11
取東革阿里水提取物，經D101型大孔吸附樹脂色，依次用水，體積比例為30％乙醇/水、95％的乙醇-水洗脫，95％的乙醇/水洗脫液濃縮乾燥，得到東革阿里精提取物，收率為4％。
實施例12
取東革阿里水提取物，經AB-8型大孔吸附樹脂色，依次用水，體積比例為20％乙醇/水、40％的乙醇-水洗脫，40％的乙醇/水洗脫液濃縮乾燥，得到東革阿里精提取物，收率為8％。
實施例13
取東革阿里醇提取物，經HPD100型大孔吸附樹脂色，依次用水，體積比例為30％乙醇/水、90％的乙醇-水洗脫，90％的乙醇/水洗脫液濃縮乾燥，得到東革阿里精提取物，收率為8％。
實施例14
取東革阿里總提取物乙酸乙酯萃取所得精提取物，經矽膠柱色譜，採用石油醚-丙酮混合溶劑10:1-5:1梯度洗脫，其中從6:1洗脫部位，分離得到寬纓酮，純度為98.5％。
實施例15
取東革阿里總提取物正丁醇萃取所得精提取物，經矽膠柱色譜，採用氯仿-甲醇混合溶劑20:1-12.5:1梯度洗脫，其中15:1洗脫物經過氯仿-甲醇重結晶處理，分離得到寬纓酮，純度為99.0％。
實施例16
取東革阿里總提取物大孔吸附樹脂95％洗脫所得精提取物，經矽膠柱色譜，採用氯仿-甲醇混合溶劑25:1-10:1梯度洗脫，從其中18:1洗脫部位分離得到寬纓酮，純度為98.2％。
實施例17
取東革阿里總提取物大孔吸附樹脂65％洗脫所得精提取物，經矽膠柱色譜，採用氯仿-甲醇混合溶劑25:1-10:1梯度洗脫，其中20:1洗脫物經過二氯甲烷-丙酮重結晶處理，分離得到寬纓酮，純度為98.6％。
實施例18微晶型尿酸鈉(MSU)誘導大鼠痛風性關節炎模型
昆明種大鼠被隨機分為六組，每組包含八隻。組1為空白組，右足關節內注射等體積的生理鹽水；組2為模型組，右足關節內注射0.1mL(10mg)MSU晶體；組3為陽性組，給予吲哚美辛(12.5mg/kg body weight)；組4、5、6(高中低劑量組)分別給予東哥阿里水提得到的東革阿里總取物(10、5.0、2.5g/kg體重)。給藥5天，每天一次。第五天給藥2小時後注射MSU晶體。
測定注射MSU晶體1h、3h、5h的足體積，按下式評估足腫脹程度：
腫脹率＝{(注射MSU晶體後體積/正常體積)-1}×100％。
結果如表所示
**P<0.01 when compared with MSU groups；
*P<0.05 when compared with MSU groups.
由表可知，和空白組相比，模型組足腫脹明顯。而陽性藥組足腫脹得到明顯抑制，東革阿里提取物中低劑量組抑制效果和陽性藥效果相似；高劑量組抑制足腫脹效果優於包括陽性藥在內的其餘各組，抑制效果最好。
實施例19東革阿里提取物和寬纓酮對黃嘌呤氧化酶的抑制作用
實驗分實驗組、實驗對照組、陰性對照組和空白對照組。⑴實驗組中，東革阿里水提所得總提取物、正丁醇萃取得精提取物、乙酸乙酯萃取得精提取物、大孔樹脂95％乙醇-水洗脫所得精提取物，以及寬嬰酮均溶解到PBS溶液中製備成六個濃度的樣品。取100μL其中任一濃度樣品於96孔板，加50μL黃嘌呤氧化酶溶液(0.1U/ml)，37℃孵育15min，加50μL黃嘌呤底物(0.48mM)，37℃孵育5min後，再在295nm紫外測OD值A1，檢測生成的尿酸。⑵實驗對照組取100μL同一樣品於96孔板，加50μL黃嘌呤氧化酶溶液(0.1U/ml)，37℃孵育15min，加50μLPBS溶液，37℃孵育5min後，再在295nm紫外測OD值A2，檢測生成的尿酸。⑶陰性對照組取100μLPBS溶液，加50μL黃嘌呤氧化酶溶液(0.1U/ml)，37℃孵育15min，加50μL黃嘌呤底物(0.48mM)，37℃孵育5min後，在295nm紫外測OD值A3。⑷空白組取100μLPBS溶液，加50μL黃嘌呤氧化酶溶液(0.1U/ml)，37℃孵育15min，加50μLPBS溶液，37℃孵育5min後，在295nm紫外測OD值A4。設置三組平行試驗。 用下面公式計算樣品對黃嘌呤氧化酶的抑制率，並按中效方程計算IC50。
抑制率％＝[1-(A1-A2)/(A3-A4)]*100％
結論：東革阿里四種提取物和寬纓酮對黃嘌呤氧化酶有很好的抑制作用，其IC50分別為1.795mg/mL、1.293mg/mL、0.821mg/mL、0.575mg/mL和0.065mg/mL(或0.427μM)。
實施例20東革阿里提取物及寬纓酮體外抗腫瘤實驗
細胞實驗分實驗組-東革阿里水提取物組、東革阿里大孔吸附樹脂95％乙醇-水製備精提取物組、東革阿里乙酸乙酯精提取物組、東革阿里正丁醇精提取物組、單體化合物寬纓酮組，(分別配置6個濃度)、陽性對照組(5-Fu，終濃度為1.6mg/L)、空白對照組(含同一細胞密度的培養液)。分別取人宮頸癌細胞株(Hela)、肺癌細胞株(A549)、淋巴癌細胞株(ATCC細胞)、肝癌細胞株((Hep-3B))、人臍靜脈上皮細胞株(HUVEC)對數生長期細胞(細胞為5×108L-1)100μL接種於96孔板,37℃飽和溼度,體積分數為0.05的CO2條件下，培養4h，待細胞均已貼壁,實驗組加入100μL不同劑量的受試物，陽性藥組加5-Fu，空白對照組加相同體積的培養液，各設5個復孔。分別在24、48、72h取出96孔板,倒置顯微鏡下觀察後，每孔加5g/L四甲基偶氮唑鹽溶液20μL，37℃繼續孵育4h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加入二甲亞碸150μL，水平振蕩10min， 在酶聯免疫檢測儀上於578nm測定各孔吸光度值，用下面公式計算藥物對腫瘤細胞的抑制率，並按中效方程計算IC50。
抑制率％＝(1-給藥組吸光度值/對照組吸光度值)×100％
結果如下：
東革阿里提取物及寬纓酮對各腫瘤細胞的抑制作用IC50
結論：東革阿里總提取物不同方法得到的精提取物，以及寬纓酮對多種腫瘤細胞均有明顯抑制作用。