一種中壓高聚物反相色譜分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法
2023-10-08 07:56:34
專利名稱：一種中壓高聚物反相色譜分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法
技術領域：
本發明涉及兒茶素的分離提純方法，尤其涉及一種中壓高聚物反相色譜分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法。
背景技術：
表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是茶多酚中最有效的活性成分，屬於兒茶素，是兒茶素中含量最高的組分，具有強抗氧化性，在醫藥保健上具有抗腫瘤、抗衰老、降血脂、防止動脈粥樣硬化、增強免疫等功能作用；在食品工業上可作抗氧化、抑菌、保鮮、祛臭劑；在日化產品上作特殊功能的保質劑、護膚劑。因此其在醫藥、食品、日化工業中有廣泛用途 和應用前景。目前，兒茶素單體的分離純化方法主要有吸附樹脂層析、葡聚糖凝膠SephadexLH-20柱層析、高速逆流色譜、矽膠柱層析和高效液相製備色譜等。兒茶素的分離純化不乏其他方法，也常常採用兩種或多種方法結合。但在實際應用中不得不考慮溶劑毒性、成本和分離效率的問題。吸附樹脂和葡聚糖凝膠層析分離性能較差，需結合HPLC等分離方法；葡聚糖凝膠價格昂貴；高速逆流色譜和高效液相製備色譜製備量小，分離效率低，所需能耗高。黃永東等使用B型三帶模擬移動床技術，以C18鍵合矽膠為固定相，乙醇與水(20 : 80，v/v)為流動相，採用Varicol工藝能得到純度為91. 33%的ECG，回收率為91. 41% [黃永東，江和源，江用文，等·傳統SMB、Varicol和Partial-discard工藝分離純化ECG和EGCG的比較研究[J]·茶葉科學,2011,31 (3) =201-210]，但上述兩種方法分別存在C18鍵合矽膠價格昂貴，有機溶劑用量大，分離平臺(逆流色譜儀，移動床)裝載量小等缺點。這些不足制約了其在兒茶素分離中的應用。因此，需要一種分離性能更好、分離效率更高、成本更低的方法。
發明內容
本發明的目的在於提供一種分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，該方法分離效率高、分離成本低且分離過程不使用毒性有機溶劑。為實現上述目的，本發明採取如下技術方案採用一定濃度的經酸化的乙醇水溶液作為流動相溶解茶多酚原料，微濾膜過濾後上CCTRI-I單分散高聚物反相色譜柱，該色譜柱適用的PH值變化範圍大，化學穩定性好，極易清洗，且再生容易，流動相洗脫後的餾分分段收集，納濾膜濃縮至一定濃度，濃縮物置真空冷凍乾燥機乾燥可得高純度兒茶素單體EGCG產品。具體包括如下步驟(I)將乙醇水溶液用有機酸進行酸化，得到酸化的乙醇水溶液；(2)酸化的乙醇水溶液作為流動相溶解茶多酚原料，得到混合溶液；(3)將步驟⑵得到的混合溶液經孔徑小於I. O μ m的微濾膜過濾；
(4)將步驟(3)所得濾液經超聲脫氣，靜置；(5)利用CCTRI-I單分散高聚物反相色譜柱對步驟(4)得到的濾液進行色譜分離；(6)色譜分離後，EGCG含量低於97%的餾分重新進行步驟(5)，EGCG含量高於97%的餾分經納濾膜濃縮至質量濃度為6% 20% ;
(7)將步驟(6)得到的濃縮物進行冷凍乾燥。作為優選，所述的茶多酚原料中EGCG的含量不低於40%。茶多酚易溶於溫水或含水乙醇中，且茶多酚在弱酸性條件下穩定，因此，本發明選用經酸化的乙醇水溶液作為流動相，乙醇的化學穩定性好，不與茶多酚發生化學反應，且粘度較低，利於色譜分離，作為優選，所述酸化的乙醇水溶液中乙醇的質量濃度為15% 65%。作為優選，用於酸化乙醇的有機酸為檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸中的一種或任意幾種任意比例的混合物，這些有機酸不與茶多酚中的成分發生反應，保證了茶多酚的穩定性。作為優選，所述酸化的乙醇水溶液的pH值為3. O 5. O。兼顧茶多酚的溶解性及色譜分離的能力，所述步驟(2)中混合溶液中茶多酚原料的質量濃度為15% 40%。高聚物色譜填料適用的pH值變化範圍很寬，在較寬的pH值範圍內可保持較好的化學穩定，且表面疏水，適合於生物分子的反相分離，因此，本發明選用CCTRI-I單分散高聚物反相色譜對茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的分離提純，該色譜柱極易清洗、再生容易、價格便宜、使用壽命長、極具成本優勢、便於工業化連續生產。色譜分離時，色譜柱的柱長、柱內徑對色譜柱的分離能力有較大的影響，通常情況，柱管增長，可改善分離能力，柱管短則組分餾出的快些；柱內徑小分離效果好，柱內徑大處理量大，但柱內徑過大，將導致單體不能均勻地分布在色譜柱中。此外，色譜填料的孔徑大小、表面積及性狀對填料的分離性能也有很大的影響，粒徑均一、呈球形、剛性強、耐壓性好的色譜填料有相對較好的柱效，因此對於目標分離物質，選擇優化的孔徑結構的色譜填料可以增加上樣量，提高分離效率和純度。因此優選，所述CCTRI-I單分散高聚物反相色譜柱柱長為26 68cm，柱直徑為I. 2 13. 6cm, CCTRI-I單分散高聚物反相色譜柱填料粒徑為5 50 μ m，柱壓為2 lOMPa。進行色譜分離時，即使待分離樣品和流動相已做過前處理，也仍難以避免色譜柱受到汙染，因此需用洗柱劑對柱子進行清洗；在色譜柱使用一段時間後，柱效將會下降，必須進行再生處理；CCTRI-1單分散高聚物反相色譜柱經連續製備20次以上需進行清洗與再生。另外，反相色譜柱在經過出廠測試後在儲存或運輸過程中可能會幹掉，因此在分離提純待分離樣品之前最好使用流動相平衡色譜柱；本發明中，優選所述CCTRI-I單分散高聚物反相色譜柱採用的洗柱劑為50% 70%乙醇，用量為5 IOBV ;再生劑為70% 100%丙酮，用量為10 15BV ;平衡劑為20% 50%乙醇，用量為8 15BV。色譜分離過程中，除了色譜柱自身的規格對分離效果的影響外，進樣的速度也會直接影響分離效果，進樣速度過快，會造成分離效果差，嚴重時會使色譜柱超載，因此優選，所述步驟(5)中進行色譜分離時，流動相的流速為5 900mL/min。
所述步驟(6)中的納濾膜的分子截留量為200 2000Da，主要用於除去色素、水及一些小分子物質，實現EGCG的有效濃縮。納濾分離過程的優勢為膜組件耐高濃度乙醇，分離過程無化學反應，無需加熱，無相變，不會破壞目標產物的生物活性，且操作壓力低，能耗低。本發明採用中壓高聚物反相製備色譜分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，該方法提供了一種能連續進樣、分離性能好、分離效率高的分離技術，與現有技術相比，具有以下優勢(I)整個生產過程所用的溶劑為較低濃度的乙醇溶液，無毒且可循環利用，低碳環保，有效避免使用有機溶劑帶來的安全問題。(2)所用的高聚物填料粒徑高度均一，表面無極性，不含鍵合的烷基官能團和殘留的矽羥基，不易產生不可逆的非特性吸附作用，能有效地保持樣品的生物活性，且分離快速(一次分離時間為三小時左右)，得率高達85%，可代替矽膠基質用於反相分離兒茶素單 體。(3) CCTRI-I單分散高聚物反相色譜柱適用的pH值變化範圍大(pH = I 14)，在強(酸/鹼)離子溶劑中化學穩定性好，極易清洗，再生容易，適用於FDA規定下CIP/SIP要求的清洗方案，使用壽命長，價格便宜，極具成本優勢，便於工業化連續生產。(4)對收集的目標產物採取經納濾膜濃縮至一定濃度，直接置於真空冷凍乾燥機進行乾燥的方法，有效避免常規減壓濃縮溫度的影響，適於熱敏性物質的分離。(5)工藝簡單，操作方便，生產周期短，生產效率高，產品純度高。
圖I為本發明中壓高聚物反相色譜分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的工藝路線圖；圖2為本發明實施例I得到的製備液相色譜圖；圖3為本發明實施例2得到的製備液相色譜圖；圖4為本發明實施例3得到的製備液相色譜圖；圖5為本發明工藝條件下製備的EGCG的HPLC法分析圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明技術方案做進一步詳細說明，以下實施例不構成對本發明的限定。本發明中壓高聚物反相色譜分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的工藝路線如圖I所示。實施例I用質量分數為65%的乙醇水溶液(pH = 3. 0，檸檬酸酸化)作為流動相併配製質量濃度為25%的茶多酚溶液。將溶液過O. 45 μ m的微濾膜，收集濾液。濾液經超聲脫氣(超聲頻率50HZ) 30min,靜置lOmin。溶液上CCTRI-I單分散高聚物反相色譜柱，上樣量3mL，柱長26cm，柱直徑I. 2cm,填料粒徑為10 μ m,柱壓為lOMpa，用流動相進行洗脫，流動相流速為5mL/min，洗脫後的餾分分段收集，EGCG < 97 %的餾分重新上柱分離，將EGCG彡97%的餾分通過納濾膜濃縮至10% 12%濃度，濃縮物置真空冷凍乾燥機(< O. Imbar,-500C )乾燥96h，得白色粉末狀EGCG產品，產品得率為86. 7 %，製備液相色譜圖如圖2所示，經HPLC法檢測，得到的EGCG純度為98. 69 %。實施例2用質量分數為15%的乙醇水溶液(pH = 4. 0，檸檬酸酸化)作為流動相併配製質量濃度為25%的茶多酚溶液。將溶液過O. 45 μ m的微濾膜，收集濾液。濾液經超聲脫氣(超聲頻率50HZ) 30min,靜置lOmin。溶液上CCTRI-I單分散高聚物反相色譜柱，上樣量IOOmL,柱長49cm，柱直徑5cm，填料粒徑為40 μ m,柱壓為5Mpa，用流動相進行洗脫，流動相流速為lOOmL/min,洗脫後的餾分分段收集，EGCG < 97%的餾分重新上柱分離，將EGCG彡97%的餾分通過納濾膜濃縮至10% 12%濃度，濃縮物置真空冷凍乾燥機(< O. Imbar,-500C )乾燥96h，得白色粉末狀EGCG產品，產品得率為90. I%，製備液相色譜圖如圖3所示，經HPLC法檢測，得到的EGCG純度為98. I %。實施例3 用質量分數為40%的乙醇水溶液(pH = 5.0，檸檬酸酸化)作為流動相併配製質量濃度為25%的茶多酚溶液。將溶液過0.45 μ m的微濾膜，收集濾液。濾液經超聲脫氣(超聲頻率50HZ) 30min,靜置lOmin。溶液上CCTRI-I單分散高聚物反相色譜柱，上樣量IOOmL,柱長48cm，柱直徑6. 8cm,填料粒徑為40 μ m,柱壓為2Mpa，用流動相進行洗脫，流動相流速為900mL/min，洗脫後的餾分分段收集，EGCG < 97 %的餾分重新上柱分離，將EGCG ^ 97%的餾分通過納濾膜濃縮至10% 12%濃度，濃縮物置真空冷凍乾燥機(< O. Imbar, -50°C )乾燥96h，得白色粉末狀EGCG產品，產品得率為90. 1%，製備液相色譜圖如圖4所示，經HPLC法檢測，得到的EGCG純度為97. 6%。實施例4將實施例1、2、3得到的白色粉末狀EGCG產品充分混勻，準確稱取50mg樣品於50mL容量瓶中，用體積比為I : I的CH3OH-H2O混合溶液溶解並定容至刻度，過0.22 μ m膜，濾液經超聲脫氣(超聲頻率50HZ) 30min,靜置lOmin，待測。色譜條件為(I)色譜柱Hypersil BDS C18 (416mmX 250mm, 10 μ m)。流動相A為甲醇,流動相B為體積分數為O. I %的乙酸水溶液，梯度程序為20% A相保持10min，40min內由20% A相一40% A相，40% A相保持40min。檢測波長278nm ;流速lmL/min ;柱溫35°C。經HPLC法檢測，EGCG純度為98. 9%, HPLC色譜圖如圖5所示。
權利要求
1.一種中壓高聚物反相色譜分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，其特徵在於，包括如下步驟 (1)將乙醇水溶液用有機酸進行酸化，得到酸化的乙醇水溶液； (2)酸化的乙醇水溶液作為流動相溶解茶多酚原料，得到混合溶液； (3)將步驟(2)得到的混合溶液經孔徑小於I.O μ m的微濾膜過濾； (4)將步驟(3)所得濾液經超聲脫氣，靜置； (5)利用CCTRI-I單分散高聚物反相色譜柱對步驟(4)得到的濾液進行色譜分離； (6)色譜分離後，EGCG含量低於97%的餾分重新進行步驟(5)，EGCG含量高於97%的餾分經納濾膜濃縮至質量濃度為6% 20% ; (7)將步驟(6)得到的濃縮物進行冷凍乾燥。
2.根據權利要求I所述的中壓高聚物反相色譜分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，其特徵在於，所述的茶多酚原料中的EGCG的含量不低於40%。
3.根據權利要求I所述的中壓高聚物反相色譜分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，其特徵在於，所述酸化的乙醇水溶液中乙醇的質量濃度為15% 65%。
4.根據權利要求I所述的中壓高聚物反相色譜分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，其特徵在於，用於酸化乙醇的有機酸為檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸中的一種或幾種任意比例的混合物。
5.根據權利要求I所述的中壓高聚物反相色譜分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，其特徵在於，所述酸化的乙醇水溶液的PH值為3. O 5. O。
6.根據權利要求I所述的中壓高聚物反相色譜分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，其特徵在於，所述步驟(2)中混合溶液中茶多酚原料的質量濃度為15% 40%。
7.根據權利要求I所述的中壓高聚物反相色譜分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，其特徵在於，所述CCTRI-I單分散高聚物反相色譜柱柱長為26 68cm，柱直徑為I.2 13. 6cm, CCTRI-I單分散高聚物反相色譜柱填料粒徑為5 50 μ m，柱壓為2 lOMPa。
8.根據權利要求I或7所述的中壓高聚物反相色譜分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，其特徵在於，所述CCTRI-I單分散高聚物反相色譜柱採用的洗柱劑為50% 70%乙醇，用量為5 IOBV ;再生劑為70% 100%丙酮，用量為10 15BV ;平衡劑為20% 50%乙醇，用量為8 15BV。
9.根據權利要求I所述的中壓高聚物反相色譜分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，其特徵在於，所述步驟(5)中進行色譜分離時,流動相的流速為5 900mL/min。
全文摘要
本發明公開了一種中壓高聚物反相色譜分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，採用一定濃度的經酸化的乙醇水溶液作為流動相溶解茶多酚原料，微濾膜過濾後上CCTRI-1單分散高聚物反相色譜柱，流動相洗脫，洗脫後的餾分分段收集，納濾膜濃縮至一定濃度，濃縮物置真空冷凍乾燥機乾燥可得高純度兒茶素單體EGCG產品。本發明工藝簡單，操作方便，生產周期短，分離效率高，產品純度高，分離提純過程所用的溶劑為乙醇溶液，無毒且可循環利用，低碳環保，有效避免使用有機溶劑帶來的安全問題。
文檔編號C07D311/62GK102964329SQ20121051636
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者李大偉, 朱躍進, 張士康, 張海華, 俞璐婷, 黃贇贇 申請人:中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究所