用於反相色譜的摻雜材料的製作方法

2023-10-08 07:44:54 2

用於反相色譜的摻雜材料的製作方法
【專利摘要】一種用於反相色譜的材料，其包括結合到固體支持物的表面改性非極性基團和帶電基團，所述帶電基團約以0.25-22%的表面改性基團的量存在，或者對於表面改性基團總量為3.6微摩爾/平方米的材料而言參考固體支持物的表面約以0.01-0.8微摩爾/平方米的量存在。可通過下述來評估這種材料和用於活性藥物成分（API)如肽的合適的條件：(a)測定感興趣的API的等電位點(pl)，（b)選擇固相材料穩定的pH範圍，(c)測定pI-pH之差，和（d)如果pI-pH之差是正的，選擇陰離子交換（AIEX)材料，或者，如果pI-pH之差是負的，選擇陽離子交換（CIEX)材料。
【專利說明】用於反相色譜的摻雜材料
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2012年3月28日提交的瑞士專利申請號0439/12的優先權，該文的全部內容通過引用納入本文。

【技術領域】
[0003]本發明涉及用色譜純化活性藥物成分(如肽)領域，具體涉及用於反相色譜的基於娃膠的材料。

【背景技術】
[0004]反相色譜是廣泛使用的肽純化方法。在液相色譜中用作固定相的幾種材料包括支持物或載體，其上連接了官能團。這種材料也稱為結合相。通常使用的載體是矽膠，其可通過合適的矽烷進行適當的表面改性。矽烷和各種表面的化學已進行了充分研究。矽烷和含矽色譜支持材料表面反應的一般討論參見《HPLC柱:理論技術和實踐》(HPLC Columns:Theory Technology, and Practice), U.D.尼優爾(U.D.Neue),威力公司(Wiley-VCH), M約(1997)。矽烷和多孔二氧化矽的反應的其它細節參見《二氧化矽表面的表徵和化學改性》(Characterizat1n and Chemical Modificat1n of the Silica Surface), E.F.範薩特(E.F.Vansant)等,愛斯韋爾公司(Elsevier Science B.V.),紐約(1995)。娃燒和各種材料的反應的更全面的描述參見《矽膠和結合相，它們的製備，性質和在LC中的應用》(SilicaGel and Bonded Phases, Their Product1n, Properties and Use in LC), R.P.ff.斯考特(R.P.ff.Scott),威利父子公司(John Wiley&Sons),紐約(1993)。
[0005]可使用單官能度、雙官能度和三官能度矽烷來製備結合相，得到強度不同的結合層。
[0006]因為平衡反應和空間位阻，不管使用的是單官能度、雙官能度還是三官能度矽烷，都不可能使所有的矽烷醇基團和甲矽烷基化試劑反應。只有甲矽烷基化試劑水平聚合時，才有可能實現幾乎完全的覆蓋。報導了即使使用最活潑的甲矽烷基化反應，只可將不大於50 %的娃燒醇基團轉化成甲娃燒基化衍生物。
[0007]因為使用雙官能度和三官能度矽烷製備的結合相難以重現，大多數市售結合相都基於單官能度娃燒。
[0008]因為仍然存在大量原始矽烷醇基團，除非被屏蔽，否則它們可能與親矽烷醇分析物發生相互作用。減少這種相互作用的常用方法是所謂的封端。這裡使少量的單官能度矽烷(例如，三甲基氯矽烷)與矽膠表面反應，來為矽膠表面提供額外的覆蓋。
[0009]US 7，125，488 B2教導了通過提供極性改性的固定相材料來解決目前存在的問題，所述材料包括無機支持物，例如用提供極性改性的特殊矽烷改性的矽膠。極性改性包括基團如-O-、-C (0) NH-、-OC (0) NH-和-(CH2CH2O) n-。
[0010]最近，高度集中在開發具有雙模化學表面特徵的固定相。反相/離子交換(RP/IEX)混合模式的固定相是已知的，且因為用於保留和分離各種帶電極性化合物，以及更多的非極性的、離子和非離子分析物的多功能性和能力而前景廣闊。根據官能團的排布，可將RP/IEX雙模柱分成四類。一種類型材料是RP和IEX小珠的混合物。另一種類型材料包括以類似量連接到相同小珠的非極性基團和極性基團例如胺和羧酸，第三類型材料包括極性基團封端的非極性鏈，第四種類型的混合模式材料包括嵌入在非極性鏈之內的陰離子或陽離子帶電基團。
[0011]GB 2 074 892 A描述了具有混合表面的材料，其中一種配體選自離子或反相配體，且第二種是親水基團如二醇、二醇前體或醯胺。
[0012]此外，GB 2 431 399 A還揭示了含結合到表面的2種不同甲矽烷基部分的混合表面。這些甲矽烷基部分各自包括2種C1-C6烷基鏈和I種其它基團。在優選地實施方式中，所述其它基團是在甲矽烷基之一上的非極性基團，和在嵌入在另一甲矽烷基上的非極性鏈之內的極性基團。
[0013]還熟知的是基於納米聚合物二氧化矽混合技術的三模式柱。這種柱包括迪奧耐斯公司(D1nex)的Acclaim? Trinity?Pl。這種材料由高純度多孔球形娃膠組成,該娃膠用帶電的(例如，從而具有陽離子交換功能)納米聚合物顆粒塗覆，且用提供RP和IEX性質的有機層改性矽膠的內部孔面積。
[0014]已開發了其它混合模式材料，且用商標Kromasil?(屬於阿克蘇諾貝爾公司(AkzoNobel))表示。據描述，這種一種顆粒-多種樹脂固定相包括50%或25%的不同官能團如極性官能團(CN、NH2、二醇)。儘管在某些情況下，這些相提供更好的分離，但對於大量應用它們仍然不能令人滿意。
[0015]CN 101829551 A揭示了與非極性配體和離子配體結合的色譜材料，其用於從牛奶樣品分離三聚氰胺和分離幾種植物激素。所揭示的陰離子基團密度為33-66%。
[0016]還已知的是因為水平聚合而具有增強配體密度的材料。已發現與僅僅接枝的材料相比，這些材料具有高得多的配體密度。水平聚合的材料首先由費爾班克(Fairbank)和維爾士(Wirth)描述，《表面吸附的水在三氯娃燒水平聚合中的作用》(Role of surface-adsorbed water in the horizontal polymerizat1n oftrichlorosilanes), Journal of Chromatography A, 830(1999)285-291,,並且由李(Li),卡爾(Carr)和伊凡斯(Evans)進一步研究，《用於反相液相色譜的水平聚合結合相的保留和穩定性研究》(Studies of retent1n and stability of a horizontallypolymerized bonded phase for reversed-phase liquid chromatography), Journalof Chromatography A, 868 (2000) 153-167。將該技術應用於不同的配體即非極性和極性配體或者非極性和離子配體的描述參見WO 2011/012019，和韋(Wei)等，《一種基於極性共聚方法的新型反相/強力陰離子交換混合模式固定相，和它在馬兜鈴酸富集中的應用》(A new reversed-phase/strong an1n-exchange mixed-mode stat1nary phasebased on polar—copolymerized approach and its applicat1n in the enrichment ofaristolochic acids), Journal of Chromatography A, 1246 (2012) 129-136。
[0017]這種水平聚合材料的問題在於成功的製備取決於吸附的水，因此必須使用非常複雜的步驟來製備它們，使它們變得昂貴並由此不適於製備性應用。此外，儘管這種材料成功的應用於特殊馬兜鈴酸的分析富集，但它們在製備性應用中是失敗的(韋(Wei)等)。
[0018]因為最尖端的材料要麼就分離質量而言和/或就保留時間而言和/或-特別是期望用於製備性應用時-就它們的製造成本而言是不令人滿意的，所以存在對改進的材料的需求。


【發明內容】

[0019]因此，本發明的總體目標是提供用於反相色譜的固定相材料，其可用於純化或者分離特殊活性藥物成分(API)，特別是適於製備性純化或者分離特殊API。
[0020]本發明的另一目標是提供一種方法，其使得能為通過反相色譜的API純化提供合適的固定相材料和/或合適的洗脫條件。
[0021]現在，為了實施本發明的這些和將在下文中變得更加明顯的其它目的，用於反相色譜的材料特徵在於，所述材料包括結合到固體支持物的表面改性基團，所述表面改性基團不是水平聚合的且包括非極性未帶電基團和極性基團，其中所述極性基團是帶電基團，所述帶電基團是帶正電的或帶負電的，且所述帶電基團約以0.25-22%的表面改性基團的量存在，或者對於表面改性基團(即非極性未帶電基團和帶電基團)總量為3.6微摩爾/平方米的材料而言參考固體支持物的表面約以0.01-0.8微摩爾/平方米的量存在。
[0022]通過標準技術如元素分析來測定表面改性基團的總量，且可通過離子滴定來測定帶電基團的量。
[0023]還將根據本發明的用於反相色譜的材料稱為摻雜材料、或者用於反相色譜的摻雜材料或者摻雜的反相材料，因為其包括少量(摻雜)的帶電基團，帶電基團的量最多為22%，優選地最多為20%或15%或10%。
[0024]當非極性基團和帶電基團的總表面覆蓋率不太高，即沒有使用水平聚合獲得的那麼高時，摻雜效果似乎最佳。假定使用水平聚合獲得的高表面覆蓋率可能是在韋(Wei)等報導的製備性分離實驗中的不良結果的原因。
[0025]本文所用術語API指具有非極性基團和帶電基團的分子，特別是肽，優選地為最多具有約50胺基酸(aa)的肽。
[0026]因為固體支持物本身是基本上屏蔽的，所以可使用用於色譜目的的任意固體支持物。但是，優選地是矽膠，因為表面上的矽烷醇基團允許通過與例如矽烷反應方便地連接改性基團。合適的矽烷是例如單官能度矽烷如單氯取代的矽烷或者三官能度矽烷如三甲氧基矽烷。目前，三甲氧基矽烷是優選的，因為它們最多能與3個相鄰的矽烷醇基團反應，由此屏蔽矽烷醇基團並同時強化改性取代基的錨定。此外，已證明即使使用三官能度矽烷，表面也被足量的取代基/表面改性基團覆蓋。此外，到目前為止，沒有觀察到用於三官能度矽烷的最新技術中報導的重現性問題。
[0027]合適的矽膠是高純度矽膠，其孔隙率為50-300埃，優選地約100埃，且粒度為
5-100微米，優選地為10-20微米。
[0028]優選地非極性未帶電基團是直鏈C4-C18烷基基團，特別是CS烷基基團，儘管也可使用烯基和炔基基團。烷基基團是優選的，因為它們具有最大的運動自由度。
[0029]優選地將帶電基團置於更短或長度類似於非極性基團的脂肪鏈上，從而確保帶電基團不主導未帶電的非極性基團。更短的鏈可例如最多短6CH2基團，通常最多短5CH2基團，優選地3-5CH2基團。因此，攜帶帶電基團的烴鏈可為C1-C18鏈。儘管已知將帶電基團嵌入烴鏈之內，目前優選的是末端位置或者在烴鏈的末梢的位置。
[0030]帶電的取代基具有下述效果:排斥相同電荷的胺基酸和吸引相反電荷的胺基酸。雖然帶電取代基的電荷不重要，目前單電荷取代基如-NR3+且R=氫或C1-C2烷基，或者_S03_優於多電荷取代基。少量的單電荷取代基已經具有足夠的效果。
[0031]取決於待純化的API和分離條件，不同的摻雜的反相材料可以是合適的。可通過下述來選定最佳的材料和API純化條件:
[0032](a)測定感興趣的API的等電位點(pi)，
[0033](b)選定固相材料穩定的pH範圍，
[0034](c)測定p1-pH之差和
[0035](d)如果p1-pH之差是正的(pi > pH)，選擇陰離子交換(AIEX)材料，或者
[0036]如果p1-pH之差是負的(pi < pH)，選擇陽離子交換(CIEX)材料。
[0037]因此，本發明還包括
[0038](i)用於反相色譜的材料的應用，所述材料包括結合到固體支持物的表面改性基團，所述表面改性基團包括非極性未帶電基團和極性基團，其中所述極性基團是帶正電基團，具體來說，是如上所定義的用於反相純化API特別是在pi > pH條件下純化蛋白質的帶正電材料，和
[0039](ii)用於反相色譜的材料的應用，所述材料包括結合到固體支持物的表面改性基團，所述表面改性基團包括非極性未帶電基團和極性基團，其中所述極性基團是帶負電基團，具體來說，是如上所定義的用於反相純化API特別是在pi < pH條件下純化蛋白質的帶負電材料。
[0040]測定等電位點包括實驗測定、從胺基酸(aa)序列計算，還包括在文獻或含個體知識的其它來源中搜索各信息。
[0041]應選定pH，使材料的壽命不受影響。對於矽膠而言，pH為3-9是優選的，甚至更優選地pH為4-7。
[0042]如果已選定了材料，可固定所需的保留時間，然後可通過測定緩衝劑的離子濃度和/或通過測定流動相(洗脫系統)的溶劑系統和梯度，來調節洗脫條件。
[0043]可能的洗脫系統包括或者由下述組成:至少一種極性溶劑，優選水如具有特殊pH的水和極性低於水的極性的至少一種其它極性溶劑的組合。這種極性更小的溶劑可例如包括或由下述組成:甲醇、乙醇、異丙醇、四氫呋喃(THF)、乙腈及其組合。在一種優選的實施方式中，使用的是緩衝的水溶液而不僅僅是有特殊pH的水。
[0044]已證明適於不同分離應用的洗脫系統之一是水性緩衝劑和乙腈。可通過常規方法來發現洗脫系統的起始組成和最終組成以及梯度。
[0045]附圖簡要說明
[0046]當考慮下述本發明的詳細描述時，將更好理解本發明，且除了上述目的以外的其它目的將變得明顯。這種描述參考了附圖，其中:
[0047]圖1顯示了反應混合物中的陰離子官能團(_S03_)和連接至矽膠的陰離子官能團之間的相互關係。
[0048]圖2顯示了反應混合物中的陽離子官能團(-NR3+)和連接至矽膠的陽離子官能團之間的相互關係。
[0049]圖3顯示了緩衝劑濃度(圖3a表示300mM醋酸鹽，圖3b表示500mM醋酸鹽，圖3c表示SOOmM醋酸鹽)對帶正電API在不同柱上的保留時間的影響。
[0050]圖4顯示了改性的乙腈梯度對保留時間的影響，其中圖4a顯示了使用相同洗脫條件時具體柱的保留時間，而圖4b顯示了可通過改變初始組成和/或梯度將停留時間匯聚在一起。
[0051]圖5顯示了不同柱材料上和兩種不同pH下，用於分離胰島素/脫醯胺胰島素(胰島素Pl = 5.3)的選擇性。
[0052]圖6顯示了根據實施例5的合成肽I的製備性純化。
[0053]圖7:顯示了根據實施例6的合成肽2的製備性純化。
[0054]圖8:顯示了根據實施例7的合成肽3的製備性純化。
[0055]實施本發明的方式
[0056]根據目前優選的用於表面改性的方法，同時從含非極性基團和極性帶電基團的液體溶液中連接所有的表面改性基團。取決於所用的取代基，已發現反應可能或多或少有利於帶電基團或者非極性基團。因此，必須通過例如離子滴定來測定實際獲得的材料。
[0057]還可在多個步驟中進行反應，即首先連接非極性基團，然後連接帶電基團，反之亦可。但是，在該方法中必須選定反應條件，從而在第一步驟中一些有效的矽烷醇基團不發生反應。在任何情況下，以及在兩(或更多)步驟方法中，必須通過例如離子滴定來測定實際連接的離子基團。
[0058]帶電基團的優選的和/或可獲得的範圍可能隨帶電基團的不同而不同。對於-S03_，常用範圍是0.01微摩爾/平方米-0.04微摩爾/平方米，對於-NR3+,常用範圍是
0.01微摩爾/平方米-0.8微摩爾/平方米，儘管可方便的形成更高的量(參見下文實施例)。但是，已發現-NR3+(例如，R = CH3)摻雜更高的材料不那麼好(見圖3和4)。離子基團量的下限是出於肉眼可見效果必須存在的摻雜離子基團的最小數目。分別通過吸附的強或弱來給出上限。因此，可使用高於表示量的離子基團，但可能會有更差的分離和/或不足的停留時間。
[0059]摻雜的影響是:在API帶正電的(等電位點(p1-pH =正的，或者pi > pH)情況下，其在AIEX材料如-NR3+摻雜材料上的吸附是弱的(排斥)，而在CIEX材料如_S03_摻雜材料上的吸附是強的(吸引)，反之亦然。
[0060]如上所述，非極性基團優選的為至少C4基團，且通常不大於C18基團，目前優選的是C8基團。帶電基團包括任意帶電取代基，優選地包括連接至C1-C8烴的帶電取代基，更優選地包括連接至長度略小於或約等於非極性鏈長度的烴的帶電取代基。因為取代基大於氫的事實，攜帶帶電取代基的基團通常和優選地具有稍微更短的鏈，例如為C3，與非極性基團的CS相比較。無意於通過任意解釋來縮小本發明的範圍，發明人假設通過更短的烴鏈來連接離子基團導致更弱的離子基團屏蔽，並因此導致分析物中分子更低的吸引或排斥。
[0061]現在通過下面的實施例來進一步描述本發明:
[0062]實施例1
[0063]通過根據標準技術，將幾種CIEX和AIEX材料暴露於含C8-化合物辛基三甲氧基矽烷和(0% ),5% , 10% , 15%或50%的帶-SO3-電荷的或者帶-NR3+-電荷的C3-化合物的組合物，來製備它們。
[0064]可通過混合所需量的矽膠、辛基三甲氧基矽烷、N-三甲氧基甲矽烷基丙基-N，N，N-氯化三甲基銨和對-甲苯磺酸(催化劑)，並在甲苯中沸騰回流6小時，來製備-NR3+材料(R =甲基)。
[0065]所需的量如下:
[0066]辛基三甲氧基矽烷的濃度為
[0067](1-χ) *5.6*lCT6mol/m2*S*M*MWt,其中
[0068]X是所需的-NR3+基團的重量百分數，
[0069]S是矽膠的比表面積[m2/g]，
[0070]M是所用矽膠的質量[g]和
[0071]MWt是辛基三甲氧基矽烷的分子量[g/mol]。
[0072]N-三甲氧基甲矽烷基丙基-N，N，N-氯化三甲基銨作為50重量％矽烷在甲醇中的溶液使用，且所用溶液的量為
[0073]x*2g/g*M = x*2*M,其中
[0074]X是如上所述的-NR3+基團的百分數，和
[0075]M是矽膠的質量[g]。
[0076]對-甲苯磺酸(催化劑)的濃度為8.6*10_3g/g的辛基三甲氧基矽烷和N-三甲氧基甲矽烷基丙基-N，N, N-氯化三甲基銨。
[0077]在6小時之後，對材料進行封端，即通過標準技術使未反應的仍然可接近的矽烷醇基團與三甲基氯矽烷反應，並用不同極性的一系列溶劑洗滌。
[0078]通過混合所需量的矽膠、辛基三甲氧基矽烷、巰基丙基三甲氧基矽烷、和對-甲苯磺酸，並在甲苯中沸騰回流6小時來製備_S<V_材料。
[0079]所需的量如下:
[0080]辛基三甲氧基矽烷的濃度為
[0081](1-χ)*5.6*1(Γ6 摩爾/m2*S*M*MWt,其中
[0082]X是所需的-S03_基團的重量百分數，
[0083]S是矽膠的比表面積[m2/g]，
[0084]M是所用矽膠的質量[g]和
[0085]是矽烷的分子量[g/mol]。
[0086]所用疏基丙基二甲氧基娃燒的濃度為
[0087]x*5.6*lCT6mol/m2*S*M*MWt,其中
[0088]X是所需的_S03_基團的重量百分數，
[0089]S是矽膠的比表面積[m2/g]，
[0090]M是所用矽膠的質量[g]和
[0091]麗t是矽烷的分子量[g/mol]。
[0092]對-甲苯磺酸的濃度為8.6*10_3g/g的所用辛基三甲氧基矽烷和巰基丙基三甲氧基矽烷總量。
[0093]然後，使用標準技術對材料進行封端，並用不同極性的一系列溶劑洗滌。
[0094]通過如下所述的氧化巰基基團來形成_S03_基團:將材料置於30體積％丙酮在H2O2 (30重量在水中)中的溶液中，並將溶液在室溫下保持12小時。最後，用水和甲醇洗滌材料。
[0095]通過離子滴定測定的連接的帶電基團的量隨溶液中濃度的函數見圖1(用於陰離子官能團-SO3-)和圖2 (用於陽離子官能團-NR3+)。
[0096]將這樣製備的CIEX柱稱為C5 (5%陰離子基團在溶液中)，ClO (10%陰離子基團在溶液中)，C15 (15%陰離子基團在溶液中)，C50 (50%陰離子基團在溶液中)，和ClOO (100%陰離子基團在溶液中)，中性柱RP (0%離子基團在溶液中)，和AIEX柱A5 (5%陽離子基團在溶液中)，AlO (10%陽離子基團在溶液中)，A15 (15%陽離子基團在溶液中)和A50(50%陽離子基團在溶液中)。連接的帶電基團(通過滴定測定)的量可來源於圖1和2。
[0097]實施例2
[0098]使用不同的柱和所用pH為4.8的醋酸鹽緩衝液的不同的離子強度，但相同的乙腈(AcN)梯度為0.51%體積/分鐘，對pi為11-12的肽(合成肽I)進行分離，起始於約19%AcN。
[0099]從圖3a_3c各自可知，帶正電的肽在_NR3+/C8材料上的吸附較低(排斥)，而在-S03_/C8材料上的吸附較強(吸引)。在相同的條件下測試了幾種柱，且相互比較停留時間。可知，柱A15分別具有幾乎無吸附或者強排斥，而材料C15具有強吸附並因此有長停留時間。A15材料是不可用的，因為感興趣的肽不吸附，而C15材料從經濟角度看也不是太好，因為純化過程太慢，需要大量的溶劑。
[0100]從圖3a到3c的比較可知，具有約I微摩爾/平方米的柱A15不僅保留時間短(小於5分鐘)，還對離子濃度(緩衝液濃度)的改變不起反應。這是該材料不適於預期應用的另一個證據。
[0101]與之相反的是，摻雜更少的材料對改變的反應條件反應非常敏感，使得它們全部成為有價值的反相材料。通過將緩衝液濃度從300mM醋酸鹽增加到800mM醋酸鹽，可將C15上的停留時間從大於30分鐘減少到小於25分鐘。此外，在高緩衝液濃度下，所有柱的停留時間變得更接近，表明鹽(醋酸鹽)屏蔽了電荷，從而摻雜材料的性能類似於未摻雜的RP材料。
[0102]如上所述，只有A15沒有發現效果。無意於通過任意解釋來限制本發明，發明人假設這種意料之外的性能可表明該材料排斥太強以至於所用的緩衝液濃度不足於克服這種排斥。
[0103]實施例3
[0104]在本實施例中，研究了改變的起始濃度和梯度對不同柱的保留時間的影響。為了最小化緩衝鹽的影響，只使用了 10mM醋酸鹽緩衝液。在本實施例中，API也是pi為11-12的合成肽I。
[0105]AcN梯度為0.25體積％ /分鐘。
[0106]在一實驗中，AcN初始濃度是22% AcN(參見圖4a)，在第二實驗中改變AcN初始濃度來確保保留時間tK = 30±3分鐘(圖4b)。
[0107]從圖4a和4b的比較可知，停留時間高度取決於初始AcN濃度。
[0108]對於所有柱而言，得到圖4b所示結果的條件如下文表I所列:
[0109]表1:
[0110]
AcN 梯度 AcN起最終[體梯度時[體積％/分保留時 ^柱始[體積%]積%] 間[分鐘]鍾]_間[分鐘]
C15 31.7__'17.3 61.2__(^25__28.5
ClQ 29.5__45.1 61.2__(L25__29.H
C5 24.2__39.8 61.2__025__32.8
RP 21.9__37, 5 62.4__025__28.0
ASH__30.4 61.3__(L25__T1.2
AlO 10.8__26.-1 61.2__(L25__28.6
A15|| 6.321.9+ 61.30.25死時間
[0111]實施例4
[0112]研究了 pH為4.8和pH為6.8時，不同柱在分離胰島素/脫醯胺胰島素(胰島素pi = 5.3)時的選擇性。結果示於圖5。
[0113]實驗條件是:
[0114]-洗脫劑:240mM醋酸鹽(pH分別為4.8或6.8)且AcN的量確保胰島素的停留時間tE為約32分鐘；和
[0115]-等度洗脫。
[0116]pH為4.8時胰島素/脫醯胺胰島素選擇性為
[0117]-S〈l，在 CIEX 材料上
[0118]-S>1，在 RP 上
[0119]-S ?I，在 CIEX-RP 材料上
[0120]-S? I，在 AIEX-RP 材料上
[0121].從圖5可知，pH為4.8 (...?...)時，_NR3+/C8材料顯示比純C8材料顯示增強得多的選擇性。在更高PH(—■一)下，選擇性增強趨勢相反。因此，排斥材料比吸引材料即_S03 /C8好得多。
[0122]實施例5
[0123]本實施例描述了選擇的合成肽I的純化，其pi為11-12。流動相的pH在肽pi以下，即肽是帶正電的。
[0124]流動相是pH = 4.8, 500mM醋酸鹽緩衝液+乙腈。
[0125]起始濃度和梯度信息見表2:
[0126]表2:
[0127] 柱 AcN起始 AcN最終梯度時間 __[體積%]__[體積%]__[分鐘]_
_CS O 28.6__33__80_
C5__17__33__80_
RP__15^__32^2__80_
A513.9__30__80_
AlO 11.7_26.180_
[0128]結果:從圖6可知，通過使用AIEX-RP材料(AlO)，在固定純度為94%時，可將產率提聞25 。
[0129]實施例6
[0130]本實施例描述了選擇的合成肽2的純化，其pi為9-10。流動相的pH在肽pi以下，即肽是帶正電的。
[0131]流動相是pH = 4.8,120mM醋酸鈉緩衝液+乙腈。
[0132]起始濃度和梯度信息見表3。
[0133]表3:
[0134]
柱 AcN起始 AcN最終梯度時間 __[體積%]__[體積％__[分釷]
CS__2^_6__48.6__80_
RP__21^9__39^3__80_
A5__rL5__35/7__80_
AlO I 14.8_ 32.280_
[0135]結果:從圖7可知，通過使用AIEX-RP材料(AlO)，在固定純度為94%時，可將產率提高7.4%。
[0136]實施例7
[0137]本實施例描述了選擇的合成肽3的純化，其pi為4.5-5.5。流動相的pH在肽pi以上，即肽是帶負電的。
[0138]流動相是pH = 6.5，10mM醋酸銨緩衝液+乙腈。
[0139]起始濃度和梯度信息見表4。
[0140]表4:
[0141] 柱 AcN起始 AcN最終梯度時間 __[體積%]__[體積%][分鐘]
15C 20.2__34/7__60_
1C 20.2__34/7__60_
5C__2(λ7__35^2__60_
RP21.7__36^2__60_
Α5__246__39^__60_
AlO I 28.4_ 42.960_
[0142]結果:從圖8可知，在這種情況下因為API的負電荷，-S037C8材料顯示更好的性能。此外，這裡也是排斥材料更好。通過使用CIEX-RP材料(ClO)，在固定純度為87%時，可將產率提高5.9%。
[0143]結論:
[0144]所有的實驗表明排斥摻雜的材料具有改善的性能。這與為了改善性能必須形成額外的吸附位置的普通觀點是相反的。本發明表明通過形成排斥位置改善材料的性能。
[0145]雖然這裡顯示和描述了本發明的目前優選的實施方式，但應清楚地理解本發明不限於這些，還可在下述權利要求的範圍之內以其它方式多方面地實施和實踐本發明。
【權利要求】
1.一種用於反相色譜的材料，其包括結合到固體支持物的表面改性基團，所述表面改性基團不是水平聚合的，所述表面改性基團包括非極性未帶電基團和極性基團，其特徵在於，所述極性基團是帶電基團，所述帶電基團是帶正電的或帶負電的，且所述帶電基團約以0.25-22%的表面改性基團的量存在，或者對於表面改性基團總量為3.6微摩爾/平方米的材料而言參考固體支持物的表面約以0.01-0.8微摩爾/平方米的量存在。
2.如權利要求1所述的材料，其特徵在於，所述非極性未帶電基團是直鏈C4-C18烷基基團，優選地是CS基團，且所述帶電基團是脂肪族C1-C18基團例如C3基團的末端取代基。
3.如權利要求1或2所述的材料，其特徵在於，帶電基團的脂肪族基團長度小於或類似於非極性基團的長度，例如將帶電的C3基團和非極性的CS基團組合。
4.如上述權利要求中任一項所述的材料，其特徵在於，帶電基團選自下組:-NR3+，優選地為-NR3+且R是氫或C1C2烷基如甲基，或者_S03_。
5.如上述權利要求中任一項所述的材料，其特徵在於，所述固體支持物是矽膠，優選地是高純度矽膠，其孔隙率為50-300埃，優選地約100埃，且粒度為5-100微米，優選地為10-20微米。
6.一種用於反相色譜分離活性藥物成分(API)優選為肽的方法，所述方法包括通過下述來評估合適的反相材料，特別是權利要求1-5中任一項所述的反相材料，和評估API純化條件: (a)測定感興趣的API的等電位點(pi)， (b)選定固相材料穩定的pH範圍， (c)測定p1-pH之差,和 (d)如果p1-pH之差是正的(pi> pH)，選擇陰離子交換(AIEX)材料，或者 如果p1-pH之差是負的(pi < pH)，選擇陽離子交換(CIEX)材料。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述方法還包含以下步驟 (e)通過調節洗脫條件來評估所需的保留時間。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述洗脫條件包括測定緩衝劑的離子濃度。
9.如權利要求7或8所述的方法，其特徵在於，所述洗脫條件包括測定洗脫系統、初始洗脫劑組成和梯度。
10.如權利要求6-9中任一項所述的方法，其特徵在於，洗脫劑是水性緩衝劑和乙腈。
11.如權利要求6-10中任一項所述的方法，其特徵在於將pH選擇為3-9，優選地為4-7。
12.用於反相色譜的材料的應用，所述材料包括結合到固體支持物的表面改性基團，所述表面改性基團包括非極性未帶電基團和極性基團，其特徵在於，所述極性基團是帶正電基團，特別是權利要求1-5中任一項所述的用於在pi > PH條件下反相純化蛋白質的帶正電材料。
13.用於反相色譜的材料的應用，所述材料包括結合到固體支持物的表面改性基團，所述表面改性基團包括非極性未帶電基團和極性基團，其特徵在於，所述極性基團是帶負電基團，特別是權利要求1-5中任一項所述的用於在pi < pH條件下反相純化API的帶負電材料。
14.一種用來製備如權利要求1-5中任一項所述的用於反相色譜的材料的方法，所述方法包括從含非極性基團和極性帶電基團的液體溶液同時連接所有的表面改性基團，並任選地測定連接的非極性基團和離子基團的量。
15.一種用來製備如權利要求1-5中任一項所述的用於反相色譜的材料的方法，所述方法包括連接非極性基團的第一步和隨後連接帶電基團的第二步，或者包括連接帶電基團的第一步和隨後連接非極性基團的第二步，其特徵在於，進行第一步從而一些有效矽烷醇基團不反應，且其中任選地測定實際連接的離子基團。
【文檔編號】B01J20/288GK104220158SQ201380016645
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年3月21日 優先權日:2012年3月28日
【發明者】N·弗雷, M·艾德曼, D·格塔茲, M·莫爾比代利, S·伯納迪, R·卡拉夫 申請人:奇奧凱姆股份公司