對氨苄西林具有抗性的質地化乳酸菌菌株的製作方法

2023-10-04 10:52:19 5

對氨苄西林具有抗性的質地化乳酸菌菌株的製作方法
【專利摘要】本發明涉及乳酸菌的突變體，所述突變體對抗生素氨苄西林(ampicillin)具有抗性並且被發現當在乳中生長時產生增加的質地，同時維持親本菌株的其它生長性質。此外，本發明涉及包含所述突變體的組合物，並且涉及利用所述對氨苄西林具有抗性的乳酸菌發酵的乳製品。DSMZ 192422007.03.29DSMZ 240212010.09.22DSMZ 258522012.04.03
【專利說明】對氨苄西林具有抗性的質地化乳酸菌菌株

【技術領域】
[0001] 本發明涉及例如德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)等乳酸菌的突變體，所述突變 體對抗生素氨苄西林（ampicillin)具有抗性，並且被發現當在乳中生長時產生增加的質 地，同時維持親本菌株的其它生長性質。此外，本發明涉及包含所述突變體的培養物，例如 起子培養物，並且涉及利用所述培養物發酵的乳製品。

【背景技術】
[0002] 食品工業使用多種細菌、尤其是乳酸菌以改進食品的味道和質地，而且延長這些 食品的貯存期。在乳業的情況下，廣泛使用乳酸菌以引起乳的酸化（通過發酵），而且對並 入它們的產品進行質地化。
[0003] 在食品工業中使用的乳酸菌中，可以提到鏈球菌屬（Streptococcus)、乳球菌 屬（Lactococcus)、乳桿菌屬（Lactobacillus)、明串珠菌屬（Leuconostoc)、小球菌屬 (Pediococcus)和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium)。嗜熱鏈球菌種的乳酸菌廣泛地單獨或與 例如德氏乳桿菌保加利亞亞種等其它細菌組合用於生產食品、尤其是發酵產品。它們尤其 用於配製用以生產發酵乳、例如酸乳的發酵物。它們中的某些在改善發酵產品的質地方面 具有顯著作用。這一特性與多糖的生產密切相關。
[0004] 酸乳的現行趨勢是實現淡味和高質地。現在，這是通過使用產生淡味的培養物並 且添加增稠劑或蛋白質以產生所需稠度實現的。酸乳生產者想要能夠在不添加增稠劑的情 況下製造具有這些性質的酸乳。這將幫助他們降低成本並得到更清潔的標記。一種實現這 一目的的非常有吸引力的方式是具有產生高水平質地的起子培養物。
[0005] 為了滿足工業要求，必需提供乳酸菌、尤其是德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈 球菌的新穎質地化菌株，用於對食品進行質地化。尤其需要可與嗜熱鏈球菌的新穎質地化 菌株一起使用的德氏乳桿菌保加利亞亞種的新穎質地化菌株。
[0006] 本發明的發明人先前已研發出用於鑑定例如德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈 球菌等改進的乳酸菌的新穎選擇方法，所述改進的乳酸菌在用於對用於發酵乳產品的乳基 質進行發酵時產生高質地。
[0007] 國際（PCT)專利申請號W0 2012/052557中所描述的方法涉及，本發明人已鑑定出 乳酸菌對D-環絲氨酸和功能等效抗生素的抗性與改進的質地化性質之間令人驚訝的相關 聯繫。
[0008] D-環絲氨酸（D-4-氨基-異'囉丨唑燒酮（D-4-amino-isoxasolidone))是抑制丙氨 酸外消旋酶、D-丙氨醯基-D-丙氨酸連接酶、D-丙氨醯基-丙氨酸合酶和D-丙氨酸通透 酶從而引起細胞溶解的抗生素。D-丙氨酸外消旋酶對於D-丙氨酸的產生至關重要，所述 D-丙氨酸是細胞壁的肽聚糖層的組成部分。
[0009] 氨苄西林是β-內醯胺類抗生素中的一種抗生素並且可有效抵抗許多革蘭氏陽 性（gram-positive)細菌，包括多數乳酸菌。氨節西林是DD-轉肽酶型酶（EC 3. 4. 16. 4) 的競爭性抑制劑。氨苄西林對DD-轉肽酶的抑制阻止形成為形成細菌細胞壁所需的肽鍵並 且最終導致細胞溶解。
[0010] 雖然已經描述了許多不同細菌的對氨苄西林具有抗性的突變體，但就本發明人所 知，現有技術中並沒有描述或提出本文中關於對氨苄西林的抗性與改進的質地化性質之間 的任何相關聯繫。


【發明內容】

[0011] 本發明的發明人已驚訝地發現了一組對氨苄西林具有抗性的乳酸菌突變體在用 於對乳進行發酵時，生成高的剪切應力和/或凝膠硬度。
[0012] 本發明人已研發了用於獲得對抗生素氨苄西林和/或抑制酶DD-轉肽酶的另一抗 生素具有抗性的所述質地化乳酸菌菌株的方法。
[0013] 本文所述的用於獲得乳酸菌菌株的方法包括以下兩個步驟：
[0014] 首先篩選和選擇對氨苄西林具有抗性的乳酸菌菌株，可將其稱作顯著高於通常存 在於天然/野生型乳酸菌中的對氨苄西林的抗性；和
[0015] 從步驟（i)中鑑定的對氨苄西林具有抗性的菌株池來篩選和選擇具有改進的質 地化性質的乳酸菌菌株。
[0016] 如本文中的實施例2中所示的，本發明人發現，從對氨苄西林具有抗性的乳酸菌 菌株池篩選/選擇具有改進的質地化性質的乳酸菌菌株是相對快速的。其原因基本上是本 發明人已鑑定了非常高百分比的對氨苄西林具有抗性的乳酸菌菌株（在步驟（i)中選擇 的）也具有改進的質地化性質。
[0017] 因此，所述首先篩選和選擇對氨苄西林的抗性可被看作能夠快速且有效地篩選和 選擇具有改進的質地化性質的乳酸菌菌株的一種預先步驟。
[0018] 對於本領域技術人員來說顯而易見的是，本文所述的篩選和選擇方法的顯著優點 是能夠相對快速且有效地篩選和選擇具有改進的質地化性質的乳酸菌菌株。
[0019] 例如，如果已經有了在用於製備發酵乳產品時具有關於例如低後酸化的商業相關 性質的乳酸菌菌株，那麼可以使用這一菌株作為用於誘變的起始細胞，然後相對快速地選 擇並獲得具有改進的質地化性質、同時仍維持關於例如低後酸化的良好性質的新穎乳酸菌 菌株。
[0020] 如本文中的實施例2中所示的，約25%的首先選擇的對氨苄西林具有抗性的菌株 還產生顯著更高的質地，如通過至少50秒的28ml酸化乳從25ml聚苯乙烯移液管的流出時 間所確定的。
[0021] 認為不使用如本文所述的新穎的篩選和選擇方法，將不可能（或將耗用非常長的 時間）鑑定產生這樣長的流出時間的乳酸菌菌株。
[0022] 不受限於理論，本文令人驚訝地鑑定的氨苄西林抗性與改進的質地化性質間的聯 系的理論解釋可能是所述對氨苄西林具有抗性的乳酸細胞產生更多的所謂的細胞外多糖 (EPS)。那麼其在理論上可能是所述EPS可在細胞周圍產生一種保護，S卩，這些EPS保護細 胞使氨苄西林不進入細胞中並且由此產生增加的氨苄西林抗性。不受限於理論，其還可能 是EPS的產生增加使利用對氨苄西林具有抗性的乳酸菌發酵的乳的質地增加。
[0023] 如上文所討論的，針對對氨苄西林具有抗性（S卩，抗顯著高於被天然/野生型乳酸 菌耐受的氨苄西林濃度的氨苄西林濃度）來首先選擇本文所鑑定的乳酸菌菌株。
[0024] 根據上文令人驚訝的發現，本發明涉及對氨苄西林和/或抑制酶DD-轉肽酶的另 一抗生素具有抗性的質地化乳酸菌菌株（例如德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌菌 株）和用於獲得所述菌株的方法。此外，本發明涉及包含突變體的培養物，例如起子培養 物，並且涉及利用所述培養物發酵的乳製品，例如發酵乳產品。

【具體實施方式】
[0025] 定義
[0026] 如本文中所使用的，術語"乳酸菌"指發酵糖同時產生酸（包括乳酸作為主要產 生的酸、乙酸和丙酸）的革蘭氏陽性微需氧或厭氧菌。工業上最有用的乳酸菌發現於"乳 桿菌目（Lactobacillales)"，所述乳桿菌目包括乳球菌屬（Lactococcus spp·)、鏈球菌 屬（Streptococcus spp·)、乳桿菌屬（Lactobacillus spp·)、明串球菌屬（Leuconostoc spp.)、片球菌屬（Pediococcus spp.)、短桿菌屬（Brevibacterium spp.)、腸球菌屬 (Enterococcus spp.)和丙酸桿菌屬（Propionibacterium spp·)。另外，屬於嚴格厭氧菌 雙歧桿菌的組（即雙歧桿菌屬（Bifidobacterium spp.))的產乳酸菌一般包括在乳酸菌的 組中。這些經常單獨或與其它乳酸菌組合用作食物培養物。包括乳桿菌種和嗜熱鏈球菌 種的細菌在內的乳酸菌通常以冷凍或凍幹培養物的形式供應給乳品業，以用於批量起子 繁殖（bulk starter propagation)，或以打算直接接種到發酵器皿或桶中的所謂的"直投 式"(Direct Vat Set ;DVS)培養物的形式供應給乳品業，以用於產生乳製品，例如發酵乳產 品。所述培養物一般稱作"起子培養物"或"起子"。
[0027] 術語"乳"應理解為通過給任何哺乳動物（例如奶牛、綿羊、山羊、水牛或駱駝）擠 奶而獲得的乳分泌物。在優選實施方案中，乳是牛乳。術語乳還包括由植物材料製得的蛋 白質/脂肪溶液，例如豆乳。
[0028] 術語"乳基質"可為可根據本發明方法經受發酵的任何生乳材料和/或加工乳材 料。因此，有用的乳基質包括但不限於包含蛋白質的任何乳或乳狀產品的溶液/懸浮液， 所述乳或乳狀產品是例如全脂乳或低脂乳、脫脂乳、酪乳、復原乳粉（reconstituted milk powder)、煉乳（condensed milk)、乳粉（dried milk)、乳清、乳清滲透物、乳糖、由乳糖結晶 獲得的母液、乳清蛋白濃縮物或乳脂。顯然，乳基質可來源於任何哺乳動物，例如是基本上 純的哺乳動物乳或復原乳粉。
[0029] 優選地，乳基質中的至少部分蛋白質是天然存在於乳中的蛋白質，例如酷蛋白或 乳清蛋白。然而，部分蛋白質可為非天然存在於乳中的蛋白質。
[0030] 在發酵之前，乳基質可根據本領域中已知的方法進行均質化和巴氏滅菌 (pasteurized)〇
[0031] 本文所用的"均質化"意指充分混合以獲得可溶的懸浮液或乳液。如果均質化在 發酵之前進行，那麼其目的是將乳脂破碎成較小尺寸以使其不再與乳分離。這可通過在高 壓下迫使乳通過小孔來實現。
[0032] 本文所用的"巴氏滅菌"意指處理乳基質以減少或消除諸如微生物等活生物體的 存在。優選地，巴氏滅菌是通過維持在指定溫度指定時段獲得的。指定溫度通常通過加熱 獲得。可選擇溫度和持續時間以殺死或滅活某些細菌，例如有害細菌。隨後可進行快速冷 卻步驟。
[0033] 本發明方法中的"發酵"意指通過微生物的作用將碳水化合物轉化為醇或酸。優 選地，本發明方法中的發酵包括將乳糖轉化為乳酸。
[0034] 將用於產生發酵乳產品的發酵工藝是眾所周知的，並且本領域技術人員將了解如 何選擇適宜的工藝條件，例如溫度、氧、微生物的量和特性以及處理時間。顯然，應對發酵條 件進行選擇以支持本發明的實現，即，獲得固體形式或液體形式的乳製品（發酵乳產品）。
[0035] 在本上下文中，酸乳起子培養物是包含至少一種德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株和 至少一種嗜熱鏈球菌菌株的細菌培養物。據此，"酸乳"是指可通過對乳接種包含德氏乳杆 菌保加利亞亞種菌株和嗜熱鏈球菌菌株的組合物並進行發酵而獲得的發酵乳產品。
[0036] "質地"或" 口感"意指產品在口中的物理和化學相互作用。
[0037] 用於確定乳的質地的方法包括測量發酵乳的剪切應力（粘度）、凝膠硬度和膠粘 性，其容易獲得且為本領域內已知並且例示於本文中。
[0038] 在本上下文中，術語"剪切應力"、"凝膠硬度"和"膠粘性"決定粘度。
[0039] 粘度（單位是Pa s)定義為剪切應力（Pa) /剪切速率（Ι/s)。
[0040] 剪切應力值在本文中報告為剪切速率=3001/s下的標準。感官實驗已顯示（數 據未顯示），當使用在剪切速率3001/s下測量的粘度時，發現流變學測量與感官粘度/ 口稠 度（mouth thickness)之間的最好相關性。
[0041] 術語"凝膠硬度"或"凝膠堅度"是發酵乳產品在經受壓力時其結構保持時長的量 度並且以1HZ(Pa)測量。
[0042] 本文所用的術語"膠粘性"是指發酵乳產品中形成線和絲和發酵乳產品的粘結性 (cohesiveness)。膠粘性是如 Int. Dairy J. 16(2) ;lll_118(Folkenberg 等人 2006)中所 述定義和測量的。
[0043] 術語"對氨苄西林具有抗性"在本文中意指在培養基中存在該抗生素時，不被殺 死、或相比於得到突變菌株的相應非突變菌株顯著更緩慢地被殺死的特定突變菌株。取決 於培養基中抗生素化合物的濃度，抗性也可反映為突變菌株和非突變菌株的改變的生長性 質。例如，培養基中低濃度的抗生素將防止或顯著地減緩非突變菌株的生長，而突變菌株的 生長不受影響。可用作評估抗性的敏感參考菌株的非突變菌株優選包括菌株CHCC13995。
[0044] 對抗生素氨苄西林具有抗性的乳酸菌菌株在本文中定義為以下乳酸菌菌株，其中 將在適於乳酸菌菌株生長的培養基（例如用於德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株的MRS培養基 和用於嗜熱鏈球菌的含有2% (w/v)乳糖的M17)中在37°C生長20小時後的0D6QQ測量的 生長相比於在不含抗生素氨苄西林的所述培養基中的〇D_測量的生長降低20%的抗生素 氨節西林的量高於400ng/ml。
[0045] 對氨苄西林具有抗性的突變體乳酸菌菌株在本文中進一步定義為：突變體乳酸菌 菌株在E-測試中讀取的最小抑制濃度（MIC)值比得到突變體菌株的親本菌株高至少1個 增量。
[0046] 在本上下文中，術語"突變體"應當理解為藉助例如遺傳改造、輻射和/或化學處 理從本發明菌株（或親本菌株）得到的菌株或可從本發明菌株（或親本菌株）得到的菌株。 突變體還可為自發地發生的突變體。優選地，突變體為功能上等效的突變體，例如與親本菌 株具有基本上相同或改進的性質（例如關於粘度、凝膠硬度和膠粘性）的突變體。所述突 變體是本發明的一部分。尤其地，術語"突變體"是指通過使本發明菌株經受任何常用的誘 變處理（包括用諸如乙烷甲烷磺酸鹽（EMS)或N-甲基-Ν' -硝基-N-硝基胍（NTG)等化學 誘變劑、UV光處理）而獲得的菌株，或自發地發生的突變體。突變體可能已經受若干誘變 處理（單次處理應理解為一個誘變步驟、之後是篩選/選擇步驟），但目前優選地，實施不 超過20次或不超過10次或不超過5次處理（或篩選/選擇步驟）。在目前優選的突變體 中，相比於親本菌株，細菌基因組中小於1 %、小於0. 1 %、小於0. 01 %、小於0. 001 %或甚至 小於0. 0001 %的核苷酸已被另一核苷酸替代、或缺失。
[0047] 在本上下文中，術語"變體"應當理解為在功能上等效於本發明菌株的菌株，例如 具有基本上相同或改進的性質（例如關於粘度、凝膠硬度和膠粘性）的菌株。可使用適當 的篩選技術鑑定的所述變體是本發明的一部分。
[0048] 除非本文另外指明或者上下文明顯矛盾，否則在描述本發明的上下文中（尤其在 下文權利要求書的上下文中）所用術語"a"和"an"和"所述"以及類似指示物應當理解為 涵蓋單數與複數二者。除非另有說明，否則術語"包含"、"具有"、"包括"和"含有"應當理 解為開放性術語（即，意指"包括但不限於"）。除非本文另外指明，否則本文敘述的值的範 圍僅僅打算作為個別地表示此範圍內的每一單獨值的簡化方法，並且每一單獨值都被併入 本說明書中，就如同其在本文中被個別地敘述一樣。除非本文另有說明或上下文明顯矛盾， 否則，本文所描述的所有方法都可按任何適宜的順序進行。除非另外要求，否則，使用本文 所提供的任何和所有示例或示例性用語（例如，"諸如"）僅僅打算用於更好地闡明本發明， 而並不對本發明範圍構成限制。本說明書中的任何用語都不應當理解為表明是任何非實施 本發明必不可少的要求要素。
[0049] 本發明的實施方式和方面
[0050] 如本文所討論的，發現高百分比的對抗生素氨苄西林具有抗性的乳酸菌相比於商 業相關質地化菌株當在乳中生長時，產生增加的質地。
[0051] 本領域技術人員將認識到與氨苄西林具有相同作用模式或相同靶標的其它抗生 素可單獨或與氨苄西林組合用於分離本文所述類型的突變體。因此，本發明還涵蓋所述 其它功能上等效的抗生素（例如其它DD-轉肽酶抑制劑）的用途。所述抗生素包括但 不限於阿莫西林（amoxicillin)、青黴素 G(penicillin G)、普魯卡因青黴素 （procaine penicillin)、節星青黴素 （benzathine penicillin)和青黴素 V。
[0052] 在第一方面，本發明涉及特徵在於以下的乳酸菌菌株：
[0053] (i)所述乳酸菌菌株對抗生素氨苄西林和/或抑制酶DD-轉肽酶的另一抗生素 具有抗性，其被定義為將在適於所述乳酸菌菌株生長的培養基中在37°C生長20小時後的 〇D_測量的生長相比於在不含所述抗生素的所述培養基中的0D_測量的生長降低20%的 所述抗生素的量高於400ng/ml ;並且
[0054] (ii)接種至少104個CFU/ml的所述乳酸菌菌株且在37°C酸化20小時的含有2% (w/v)脫脂乳粉的28ml全脂牛乳從25ml聚苯乙烯移液管的流出時間是至少50秒。
[0055] 優選地，步驟（i)的抗生素是氨苄西林。
[0056] 用於確定點⑴的將0D_測量的生長降低20%的抗生素的量的測定與用於確定 點（ii)的28ml酸化乳從25ml聚苯乙烯移液管的流出時間的測定兩者都是基於已知的商 購標準元件。
[0057] 本領域技術人員將知道適於乳酸菌菌株生長的標準培養基，包括適於德氏乳桿菌 保加利亞亞種菌株生長的MRS培養基和適於嗜熱鏈球菌菌株生長的含有2% (w/v)乳糖的 M17培養基，如本文所例示的。
[0058] 因此，基於本文對於測定的詳細描述（參見例如實施例2)，本領域技術人員能夠 常規地重複這些測定以客觀地確定特定目標乳酸菌菌株是否符合對氨苄西林和/或抑制 DD-轉肽酶的另一抗生素具有抗性（點（i))和是否符合具有改進的質地化性質（點（ii))。
[0059] 在優選實施方案中，乳酸菌菌株選自由德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌組 成的組。在更優選的實施方案中，乳酸菌菌株是德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株。
[0060] 在優選實施方案中，點（i)的將〇D_測量的生長降低20%的抗生素的量高於 500ng/ml，例如高於 600ng/ml，例如高於 700ng/ml。
[0061] 在其它優選實施方案中，點（ii)的流出時間是至少60秒，例如至少70秒，例如至 少80秒，例如至少90秒，例如至少100秒，例如至少110秒。
[0062] 在第二方面，本發明涉及特徵在於以下的乳酸菌菌株：
[0063] (i)所述乳酸菌菌株對抗生素氨苄西林和/或抑制酶DD-轉肽酶的另一抗生素具 有抗性，其被定義為突變體乳酸菌菌株在E-測試中的最小抑制濃度（MIC)比得到所述乳酸 菌菌株的親本菌株的MIC高至少1個增量；並且
[0064] (ii)接種至少104個CFU/ml的突變體乳酸菌菌株且在37°C酸化20小時的含有 2% (w/v)脫脂乳粉的28ml全脂牛乳從25ml聚苯乙烯移液管的流出時間是接種至少104個 CFU/ml的親本菌株且在37°C酸化20小時的含有2% (w/v)脫脂乳粉的28ml全脂牛乳從 25ml聚苯乙烯移液管的流出時間的至少兩倍。
[0065] 優選地，步驟（i)的抗生素是氨苄西林。
[0066] 點⑴的E-測試與用於確定點（ii)的28ml酸化乳從25ml聚苯乙烯移液管的流 出時間的測定兩者都是基於已知的商購標準元件。
[0067] 因此，基於本文對於測定的詳細描述（參見例如實施例1和實施例2)，本領域技術 人員能夠常規地重複這些測定以客觀地確定特定目標乳酸菌菌株是否符合對氨苄西林和/ 或抑制DD-轉肽酶的另一抗生素具有抗性（點（i))和是否符合具有改進的質地化性質（點 (ii))。
[0068] 在優選實施方案中，乳酸菌菌株選自由德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌組 成的組。在更優選的實施方案中，乳酸菌菌株是德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株。
[0069] 在優選實施方案中，點（i)的突變體乳酸菌菌株在E-測試中的MIC比親本菌株的 MIC高至少2個增量，例如至少3個增量，例如至少4個增量，例如至少5個增量。
[0070] 在其它優選實施方案中，點（ii)的流出時間是至少50秒，例如至少60秒，例如至 少70秒，例如至少80秒，例如至少90秒，例如至少100秒，例如至少110秒。
[0071] 本發明的第三方面涉及選自由以保藏號DSM 25852保藏於德國微生物菌種保藏 中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)的德氏乳桿菌保力口 利亞亞種菌株CHCC15466和由其得到的突變體和變體組成的組的乳酸菌菌株。
[0072] 本領域技術人員很清楚，通過使用保藏的菌株作為起始材料，本領域技術人員可 通過常規誘變或再分離技術常規地獲得其保留本文所述的相關特徵和優點的另外的突變 體或衍生物。因此，術語"由其得到的突變體"涉及通過使用保藏的菌株作為起始材料獲 得的突變體菌株並且其中所述突變體保留了保藏的菌株的基本性質，其中所述基本性質是 接種至少104個CFU/ml的乳酸菌菌株且在37°C酸化20小時的含有2% (w/v)脫脂乳粉的 28ml全脂牛乳從25ml聚苯乙烯移液管的流出時間是至少50秒。
[0073] 本發明的第四方面涉及包含104到1014個CFU/g的根據權利要求1到6中任一權 利要求所述的乳酸菌菌株的組合物。
[0074] 在優選實施方案中，所述組合物包含至少一種德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株。優 選地，所述組合物包含至少一種德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株和至少一種嗜熱鏈球菌菌 株。
[0075] 在另一優選實施方案中，所述組合物可用作起子培養物。
[0076] 在再一優選實施方案中，所述組合物呈冷凍形式或凍幹形式或液體形式。
[0077] 根據本發明的乳酸菌菌株（其對氨苄西林和/或抑制DD-轉肽酶的另一抗生素具 有抗性且具有改進的質地化性質）可優選用於製備發酵乳產品。.劑量和施用可根據現有 技術進行。
[0078] 此外，本文中所有用於製備發酵乳產品的其它相關步驟均可根據現有技術進行。 所述所有用於製備發酵乳產品的其它相關步驟均為本領域技術人員所熟知的常規步驟。
[0079] 因此，本發明的第五方面涉及用於製備發酵乳產品的方法，其包括利用根據本發 明的第一方面、第二方面或第三方面的乳酸菌菌株或根據本發明的第四方面的組合物對乳 基質進行發酵。
[0080] 第六方面涉及可通過根據本發明的第四方面的方法獲得的發酵乳產品。
[0081] 第七方面涉及包含根據本發明的第一方面、第二方面或第三方面的乳酸菌菌株或 根據本發明的第四方面的組合物的發酵乳產品。
[0082] 本發明的第八方面涉及根據本發明的第一方面、第二方面或第三方面的乳酸菌菌 株或根據本發明的第四方面的組合物用於製備乳製品的用途。
[0083] 在優選實施方案中，乳製品是發酵乳產品。優選地，發酵乳產品是酸乳。
[0084] 本發明的第九方面涉及用於獲得乳酸菌菌株的方法，所述方法包括：
[0085] a)從乳酸菌菌株池中選擇和分離對抗生素氨苄西林和/或抑制酶DD-轉肽酶的 另一抗生素具有抗性的乳酸菌菌株池，其被定義為將在適於乳酸菌菌株生長的培養基中在 37°C生長20小時後的0D_測量的生長相比於在不含所述抗生素的所述培養基中的生長降 低20%的所述抗生素的量高於400ng/ml ;並且
[0086] b)從步驟a)的對氨苄西林和/或抑制酶DD-轉肽酶具有抗性的另一抗生素的乳 酸菌菌株池中選擇和分離以下乳酸菌菌株，其中接種至少1〇 4個CFU/ml的乳酸菌菌株且在 37°C酸化20小時的含有2% (w/v)脫脂乳粉的28ml全脂牛乳從25ml聚苯乙烯移液管的流 出時間是至少50秒。
[0087] 優選地，所述方法包括：
[0088] a)從乳酸菌菌株池中選擇和分離對抗生素氨苄西林具有抗性的乳酸菌菌株池，其 被定義為將在適於乳酸菌菌株生長的培養基中在37°C生長20小時後的0D_測量的生長相 比於在不含氨苄西林的所述培養基中的生長降低20%的氨苄西林的量高於400ng/ml ;並 且
[0089] b)從步驟a)的對抗生素氨苄西林具有抗性的乳酸菌菌株池中選擇和分離以下乳 酸菌菌株，其中接種至少?ο4個CFU/ml的乳酸菌菌株且在37°C酸化20小時的含有2% (w/ v)脫脂乳粉的28ml全脂牛乳從25ml聚苯乙烯移液管的流出時間是至少50秒。
[0090] 在優選實施方案中，乳酸菌菌株選自由德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌組 成的組。在更優選的實施方案中，乳酸菌菌株是德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株。
[0091] 在優選實施方案中，點（i)的將〇D_測量的生長降低20%的抗生素的量高於 500ng/ml，例如高於 600ng/ml，例如高於 700ng/ml。
[0092] 在其它優選實施方案中，點（ii)的流出時間是至少60秒，例如至少70秒，例如至 少80秒，例如至少90秒，例如至少100秒，例如至少110秒。
[0093] 第十方面涉及用於獲得乳酸菌菌株的方法，所述方法包括：
[0094] a)提供乳酸菌親本菌株；
[0095] b)選擇和分離對抗生素氨苄西林和/或抑制酶DD-轉肽酶的另一抗生素具有抗性 的突變體乳酸菌菌株池，其被定義為突變體乳酸菌菌株在E-測試中的最小抑制濃度（MIC) 比得到突變體乳酸菌菌株的親本菌株的MIC高至少1個增量；並且
[0096] c)從步驟b)的對氨苄西林和/或抑制酶DD-轉肽酶具有抗性的另一抗生素的突 變體乳酸菌菌株池中選擇和分離以下突變體乳酸菌菌株，其中接種至少1〇4個CFU/ml的突 變體乳酸菌菌株且在37°C酸化20小時的含有2% (w/v)脫脂乳粉的28ml全脂牛乳從25ml 聚苯乙烯移液管的流出時間是接種至少104個CFU/ml的親本菌株且在37°C酸化20小時的 含有2% (w/v)脫脂乳粉的28ml全脂牛乳從25ml聚苯乙烯移液管的流出時間的至少兩倍。 [0097] 優選地，所述方法包括：
[0098] a)提供乳酸菌親本菌株；
[0099] b)選擇和分離對抗生素氨苄西林具有抗性的突變體乳酸菌菌株池，其被定義為突 變體乳酸菌菌株在E-測試中的最小抑制濃度（MIC)比得到突變體乳酸菌菌株的親本菌株 的MIC高至少1個增量；並且
[0100] c)從步驟b)的對氨苄西林具有抗性的突變體乳酸菌菌株池中選擇和分離以下突 變體乳酸菌菌株，其中接種至少1〇4個CFU/ml的突變體乳酸菌菌株且在37°C酸化20小時 的含有2% (w/v)脫脂乳粉的28ml全脂牛乳從25ml聚苯乙烯移液管的流出時間是接種至 少104個CFU/ml的親本菌株且在37°C酸化20小時的含有2% (w/v)脫脂乳粉的28ml全 脂牛乳從25ml聚苯乙烯移液管的流出時間的至少兩倍。
[0101] 在優選實施方案中，乳酸菌親本菌株選自由德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球 菌組成的組。在更優選的實施方案中，乳酸菌菌株是德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株。
[0102] 在本發明的甚至更優選的實施方案中，親本菌株是以保藏號DSM24021保藏於德 國微生物菌種保藏中心的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株CHCC13995。
[0103] 在優選實施方案中，點（i)的突變體乳酸菌菌株在E-測試中的MIC比親本菌株的 MIC高至少2個增量，例如至少3個增量，例如至少4個增量，例如至少5個增量。
[0104] 在其它優選實施方案中，接種至少104個CFU/ml的突變體乳酸菌菌株且在37°C酸 化20小時的含有2% (w/v)脫脂乳粉的28ml全脂乳從25ml聚苯乙烯移液管的點（ii)的 流出時間是至少50秒，例如至少60秒，例如至少70秒，例如至少80秒，例如至少90秒，例 如至少100秒，例如至少110秒。
[0105] 在第十一方面中，本發明涉及可通過根據本發明的第八方面或第九方面的方法獲 得的乳酸菌菌株。
[0106] 本發明進一步通過以下非限制性實施例來說明。
[0107] 實施例
[0108] 材料：
[0109] 培養基：對於嗜熱鏈球菌來說，合適培養基包括具有以下組成的已知的M17瓊脂 培養基：
[0110] 瓊脂，12.75g/L
[0111] 抗壞血酸，0. 5g/L
[0112] 酪蛋白腖（胰蛋白酶），2. 5g/L
[0113] 甘油磷酸二鈉五水合物，19g/L
[0114] 硫酸鎂水合物，0. 25g/L
[0115] 肉膏（meat extract)，5g/L
[0116] 肉蛋白腖（meat peptone)(胃蛋白酶），2. 5g/L
[0117] 大豆蛋白腖（木瓜蛋白酶），5g/L
[0118] 酵母提取物，2. 5g/L
[0119] 和具有這一組成的M17肉湯培養基：
[0120] 抗壞血酸，0.5g/L
[0121] 乳糖，5g/L
[0122] 硫酸鎂，0. 25g/L
[0123] 肉膏，5g/L
[0124] 肉蛋白腖（胃蛋白酶），2· 5g/L
[0125] 甘油磷酸鈉，19g/L
[0126] 大豆蛋白腖（木瓜蛋白酶），5g/L
[0127] 胰蛋白腖，2. 5g/L
[0128] 酵母提取物，2. 5g/L
[0129] 最終 ρΗ7· 0±0· 2(25°C )
[0130] 這些培養基通常在添加20g/l的乳糖（2% w/v)後使用。
[0131] 對於德氏乳桿菌保加利亞亞種來說，合適培養基包括已知的MRS培養基。
[0132] MRS瓊脂培養基具有以下組成：
[0133] .Bacto蛋白腖3號丨0 g/1 Bacto牛肉膏 丨〇g/l Bacto酵母提取物 5 g/1 右旋糖 20 g/1 脫水山梨糖醇單油酸酯複合物 1 g/1 狩檬酸銨 2 g/1 乙酸鈉 5 g/1 硫酸鏌 0.1 g/1 硫酸錳 0.05 g/1 磷酸氫二鉀2 g/1 Bacto瓊脂 丨5 g/1
[0134] 並且MRS肉湯培養基具有這一組成：
[0135] Bacto蛋白腖3號丨0 g/1 Bacto牛肉骨 丨〇g/l Bacto酵母提取物 5 g/1 右旋糖 20 g/1 脫水山梨糖醇單油酸酯複合物 1 g/1 狩檬酸銨 2 g/1 乙酸鈉 5 g/1 硫酸鎂 0.1 g/1 硫酸錳 0.05 g/1 嶙酸氫二鉀 2 g/1 最終pH 6.5士0.2 (25。。）
[0136] 如本領域技術人員已知的，M17培養基是被認為適於嗜熱鏈球菌生長的培養基，並 且MRS培養基是被認為適於德氏乳桿菌保加利亞亞種生長的培養基。
[0137] 在本上下文中並且如本領域技術人員所理解的，特定M17和MRS培養基濃縮物可 由不同的供應商供應，並且獨立於特定的供應商，將（在標準的測量不確定度內）得到與本 文相關的目標菌株的相關氨苄西林抗性的本文所述的相同結果。
[0138] 實施例1 :氨苄西林抗性選擇測定
[0139] 所述方法是使用德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株說明的。為了利用嗜熱鏈球菌實施 氨苄西林抗性選擇測定，應當使用添加有2% w/v乳糖的M17培養基代替MRS培養基。
[0140] 將目標德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株接種到10ml MRS肉湯培養基中並且在厭氧 條件下在37°C生長至少20小時。將棉籤浸入培養物中並且用於在MRS瓊脂板（直徑為 90mm)的整個表面上劃線。將用於抗微生物敏感性測試（Antimicrobial Susceptibility Testing)的氨節西林 E-測試條（0.016-256 μ g/ml) (Biomerieux，目錄編號為 501558)置 於瓊脂的頂部上，並且將所述板在厭氧條件下在37°C培育不超過24小時。氨苄西林的最小 抑制濃度（MIC)是將抑制平鋪的菌株的可見生長的最低濃度並且在橢圓抑制區與E-測試 條相交的點處讀取。
[0141] 如本文所討論的具有增加的對氨苄西林的抗性的德氏乳桿菌保加利亞亞種細胞 在本文中被定義為以下德氏乳桿菌保加利亞亞種細胞，其中讀取的MIC值比親本菌株的高 至少1個增量，如E-條上所示的。
[0142] 能夠符合這一增加的對氨苄西林的抗性準則的細胞在本文中被定義為在本實施 例1的氨苄西林抗性測定中對氨苄西林具有抗性的細胞。
[0143] 結論：
[0144] 基於本實施例1的氨苄西林抗性選擇測定-對於特定目標菌株（例如來自相關 商業產品的菌株）-本領域技術人員可常規地測試這一特定目標菌株是否具有本文中的 相關氨苄西林抗性。
[0145] 實施例2 :使用氨苄西林來分離具有改進的流變學性質的德氏乳桿菌保加利亞亞 種突變體
[0146] 菌株：
[0147] 德氏乳桿菌保加利亞亞種CHCC13995
[0148] 德氏乳桿菌保加利亞亞種CHCC15466(CHCC13995的對氨苄西林具有抗性的突變 體）
[0149] 突變體分離：
[0150] 為了分離德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株CHCC13995的對氨苄西林具有抗性的突 變體，將由單菌落生長得到的細胞厭氧地接種到含有以下量中的一個的氨苄西林的l〇ml MRS 肉湯中：0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml* 700ng/ml，並且在37°C生長至少20小時。
[0151] 生長20小時後，測量所有樣品的0D_。
[0152] 通常，相比於在不含氨苄西林（即，具有Ong/ml氨苄西林）的MRS培養基中的生 長，將德氏乳桿菌保加利亞亞種的〇D_測量的厭氧生長降低至少20%的氨苄西林的濃度 高於300ng/ml。對氨節西林的濃度為500ng/ml的培養物進行稀釋，並且將其平鋪於未添加 氨苄西林的MRS瓊脂板上且然後在37°C厭氧地培育至少20小時。然後挑取菌落並且針對 其在存在500ng/ml氨苄西林的微量滴定板中在37°C的厭氧生長進行篩選。通常，25%的所 得菌落被鑑定為氨苄西林存在下的快速生長者。選擇這些用於進一步研究。將所選對氨苄 西林具有抗性的突變體進一步純化並且測試其在乳中生長的能力。在這一研究期間，觀察 到一些突變體在這些條件下產生顯著多於親本菌株的質地。
[0153] 粘度篩選：
[0154] 通過使用簡單的移液管粘度測試進行流變學篩選分析。在這一測試中，通過測量 從加載有28ml酸化乳的25ml聚苯乙烯移液管CCELLSTAR? )的流出時間來預先測試 對氨苄西林具有抗性的突變體的粘度（在真正流變學測試前）：
[0155] 對於每個樣品來說，將添加有2% (w/v)脫脂乳粉的全脂牛乳以至少104個細胞/ ml乳的量接種對氨苄西林具有抗性的突變體，並在37°C酸化20小時。
[0156] 在移液測試前，通過攪拌將酸化乳輕輕地均質化，然後將其加載到25ml聚苯乙烯 移液管中的頂部（28ml)，並且對於每個樣品來說，將從移液管的流出時間測量3次。表1列 出了對於由21個對氨苄西林具有抗性的突變體在37°C發酵20小時的乳的移液管粘度測試 的結果。結果顯示這些突變體中的多數比親本菌株產生更高的粘度。21個對氨苄西林具有 抗性的突變體中的6個得到的流出時間是親本菌株的兩倍，並且約25%的對氨苄西林具有 抗性的突變體得到至少50秒的流出時間。
[0157] 尤其地，突變體18 (amp mut 18)具有高流出時間。將這一突變體衍生物指定為 CHCC15466並且用於實施例3中所述的流變學測試。
[0158]

【權利要求】
1. 一種乳酸菌菌株，其特徵在於： (i) 所述乳酸菌菌株對抗生素氨苄西林具有抗性，其被定義為將在適於所述乳酸菌菌 株生長的培養基中在37°C生長20小時後的0D_測量的生長相比於在不含氨節西林的所述 培養基中的〇D 6(?測量的生長降低20%的氨苄西林的量高於400ng/ml ;並且 (ii) 接種至少1〇4個CFU/ml的所述乳酸菌菌株且在37°C酸化20小時的含有2% (w/ v)脫脂乳粉的28ml全脂牛乳從25ml聚苯乙烯移液管的流出時間是至少50秒。
2. 根據權利要求1所述的乳酸菌菌株，其中點⑴的將所述OD_測量的生長降低20% 的氨節西林的量高於500ng/ml。
3. 根據前述權利要求中任一權利要求所述的乳酸菌菌株，其中點（ii)的所述流出時 間是至少100秒。
4. 一種乳酸菌菌株，其選自由以保藏號DSM 25852保藏於德國微生物菌種保藏中 心的德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)菌株 CHCC15466和通過使用所述保藏的菌株作為起始材料獲得的突變體組成的組，並且其中所 述突變體保留了所述保藏的菌株的基本性質，其中所述基本性質是接種至少1〇 4個CFU/ml 的所述突變體且在37°C酸化20小時的含有2% (w/v)脫脂乳粉的28ml全脂牛乳從25ml 聚苯乙烯移液管的流出時間是至少50秒。
5. -種組合物，其包含104到1014個CFU/g的根據權利要求1到4中任一權利要求所 述的乳酸菌菌株。
6. 根據權利要求7所述的組合物，其包含至少一種德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株。
7. 根據權利要求5和6中任一權利要求所述的組合物，其包含至少一種德氏乳桿菌保 加利亞亞種菌株和至少一種嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)菌株。
8. 根據權利要求5和7中任一權利要求所述的組合物，其呈冷凍形式或凍幹形式或液 體形式。
9. 一種用於製備發酵乳產品的方法，其包括利用根據權利要求1到4中任一權利要求 所述的乳酸菌菌株或根據權利要求5到8中任一權利要求所述的組合物對乳基質進行發 酵。
10. -種發酵乳產品，其可通過根據權利要求9所述的方法獲得。
11. 一種發酵乳產品，其包含根據權利要求1到4中任一權利要求所述的乳酸菌菌株或 根據權利要求5到8中任一權利要求所述的組合物。
12. 根據權利要求1到4中任一權利要求所述的乳酸菌菌株或根據權利要求5到8中 任一權利要求所述的組合物用於製備乳產品的用途。
13. 根據權利要求12所述的用途，其中所述乳產品是發酵乳產品。
14. 一種用於獲得乳酸菌菌株的方法，所述方法包括： a) 從乳酸菌菌株池中選擇和分離對抗生素氨苄西林具有抗性的乳酸菌菌株池，其被定 義為將在適於所述乳酸菌菌株生長的培養基中在37°C生長20小時後的0D_測量的生長相 比於在不含氨苄西林的所述培養基中的生長降低20%的氨苄西林的量高於400ng/ml ;並 且 b) 從步驟a)的對抗生素氨苄西林具有抗性的所述乳酸菌菌株池中選擇和分離以下乳 酸菌菌株，其中接種至少1〇4個CFU/ml的所述乳酸菌菌株且在37°C酸化20小時的含有2% (w/v)脫脂乳粉的28ml全脂牛乳從25ml聚苯乙烯移液管的流出時間是至少50秒。
15. -種乳酸菌菌株，其可通過根據權利要求14所述的方法獲得。
【文檔編號】C12N1/20GK104254604SQ201380021200
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年4月23日 優先權日:2012年4月23日
【發明者】E·約翰森, K·I·索爾恩森, A·基貝尼克 申請人:科.漢森有限公司