唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因載體和轉基因豬及其構建方法

2023-10-04 06:05:14

唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因載體和轉基因豬及其構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因載體及其構建方法，所述表達載體是通過將葡聚糖酶基因、木聚糖酶基因、以及植酸酶基因構建重組的融合基因插入到腮腺組織特異性的轉基因載體中構建得到的；將該載體導入豬的基因組，並採用體細胞核移植技術生產出轉基因豬。本發明針對大麥原料葡聚糖酶，小麥、玉米中木聚糖酶，和植物性飼料中的植酸酶都有水解作用，利用豬唾液腺做為反應器，終生分泌，達到永久代替飼料中這些酶製劑的添加，更好的發揮這些酶的作用；本發明的表達載體具有piggyBac轉座子，極大地提高了轉基因效率，且將普通質粒串聯重組的轉基因整合模式變成了單位點單拷貝整合，更好的模擬生物基因的內環境。
【專利說明】唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因載體和轉基因豬及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明技術屬於基因工程領域，更具體地，本發明涉及一種唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因載體和轉基因豬及其構建方法。
【背景技術】
[0002]葡聚糖屬於植物細胞壁中的結構性非澱粉多糖，是由β_1，3和β_1，4糖苷鍵連接而成的D型葡萄糖聚合體，分子量大約在6500KDa以上，分水溶性和非水溶性兩種，其溶解性受結構中糖苷鍵含量和聚合度的影響，廣泛存在於高等植物細胞壁中，在大麥、小麥、黑麥等禾穀類農作物胚乳細胞壁中含量高，大麥中β_葡聚糖含量約4%-10%。β-葡聚糖酶(β-glucanase)可以水解大麥、小麥和黑麥等穀物中的葡聚糖，催化裂解葡聚糖分子中β_1，3和β_1，4糖苷鍵，降解生成小分子寡糖和葡萄糖。
[0003]木聚糖在植物細胞壁中的含量僅次於纖維素，是半纖維素中含量最豐富的一種，在各種飼料原料特別是麥類、穀物副產品及雜柏中含量較多。木聚糖是由D —木糖主鏈(以β -1，4鍵相連)和L 一阿拉伯糖分枝(a-1，2和a-1，3相連)所組成的聚合物，由於它是由阿拉伯糖和木糖兩種單糖聚合而成，因此也稱阿拉伯木聚糖。聚糖本身難以被單胃動物消化吸收，而且阿拉伯木聚糖形成一種胞衣劑，阻礙植物細胞壁內蛋白質、碳水化合物、脂肪等底物與消化酶結合，同時使消化物的黏稠度提高，阻礙營養物質尤其是脂肪、蛋白質的消化、吸收和利用，降低飼料的轉化效率。聚糖能直接結合消化道中胰蛋白酶、脂肪酶等消化酶，使其活性降低，同時和膽汁鹽、脂類、膽固醇結合，影響脂類在小腸的吸收。阿拉伯木聚糖提高了動物腸道中食糜的黏度，降低了食糜在消化道中的移動速度，促進細菌的大量增殖，使畜禽腹瀉率增加，包括氮和磷在內的排洩物也增加，造成對環境的汙染。木聚糖酶是專一降解木聚糖的酶，屬於水解酶類，可將木聚糖分解為木寡糖。木聚糖酶主要由β -1, 4-D-內切木聚糖酶、β -1, 4-D-外切木糖苷酶和a -L-阿拉伯糖苷酶、a -D-胺基酸醛酸酶等脫支鏈酶構成。
[0004] 植酸是植物性飼料中普遍存在的一種抗營養因子，所有植物性飼料都含有1% -5%的植酸鹽，這些鹽的含磷量佔飼料總含磷量的60% - 80%。由於單胃動物消化道內不含植酸酶，導致其無法或不能很好利用植物性飼料中的磷，植酸磷大部分難以被豬和禽所利用而隨糞便排出體外，汙染環境。另外植酸具有很強的絡合能力，可與許多礦質元素和蛋白質絡合形成穩定的複合物，從而降低了這些營養物質的利用率。植酸酶可使植酸磷降解成肌醇和磷酸，從而減少飼料中磷酸氫鈣等無機磷的添加量，另外，研究結果還發現了植酸酶的潛在營養價值:能夠提高飼料中蛋白質和能量的消化率。植酸酶的應用在一定的程度上能緩解我國磷資源的匱乏、減少磷資源的浪費、降低磷排放所帶來的汙染。
[0005]葡聚糖酶、木聚糖酶、植酸酶是動物飼料添加劑最常用外源酶製劑。在禽畜產品養殖中應用飼用酶製劑既能提高飼料的消化率和利用率，提高畜禽的生產性能，又能減少畜禽排洩物中的氮、磷的排洩量，保護水體和土壤免受汙染，是一類高效、無毒副作用和環保型的「綠色」飼料添加劑。飼料酶製劑添加對提高動物營養利用，降低成本有一定的積極作用，同時也存在不少問題。目前絕大多開發飼料用酶的性質不夠優良，極少酶能在pH、熱穩定性、抗胃蛋白酶，胰蛋白酶等能力方面聚各優點於一身；飼料酶製劑的添加成本限制酶製劑使用，為了不增加養殖成本，每噸飼料酶製劑成本都不超過100元(楊培龍等，2009)。此外，這些外源消化酶動物自身不能分泌，一直以來都是先利用微生物發酵獲得相應的酶，在人工添加飼料中，添加到飼料中的添加劑容易受飼料制粒、膨化、貯存等因素影響，其活力及其穩定性方面常受各種因素影響，導致酶製劑添加在實際生產中效果不明顯，且需要不斷添加，效果不理想，成本高。
[0006]轉基因技術為該問題的解決提供了技術支持。轉基因動物技術一般是利用基因工程手段構建轉基因載體，藉助大腸桿菌等微生物在其體內大量複製，進而獲取大量目的DNA片段，然後通過原核注射、胞眾內精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)或者篩選轉基因細胞結合體細胞克隆等技術獲得轉基因動物。轉基因載體藉助電穿孔、脂質體或者病毒導入動物細胞，然後經過藥物篩選即可獲得轉基因細胞，進行體細胞克隆的技術也是目前獲得轉基因豬最常用方法。但是這些方法都存在各種缺點和不足。如轉基因動物製備效率低；轉入的外源基因在動物體內遺傳、表達不穩定等。傳統的轉基因載體片段往往以多拷貝串聯方式(concatamer)、被動地、隨機整合到基因組一個或多個位點，不但效率低下，還導致轉入基因遺傳和表達不穩定(Garrick et al, 1998 ；Scrable et al,1999)。轉基因環保豬的研究還涉及到多基因共表達、載體過大(>15kbp)等問題，傳統轉基因載體更難獲得穩定遺傳的轉基因細胞系。病毒載體雖整合效率高，但其承載能力有限和可能存在的安全問題限制其進一步應用。
[0007]隨著我國養豬業的快速發展，養豬生產正面臨飼料成本不斷攀升壓力和養殖環保的挑戰。提高豬對飼料營養元素吸收和沉積、降低養豬場廢物中氮磷等主要汙染物排放刻不容緩。
[0008]環保型轉基因動物生產原理是利用現有轉基因技術和方法通過組織特異表達轉基因載體，把外源消化酶基因及其組織特異表達的調控元件轉運並整合到動物基因組中，這些外源消化酶基因在其組織特異啟動子調控下，實現在特定動物器官組織中持續表達和分泌外源消化酶，這些分泌的消化酶在動物特定分泌器官中與動物自身消化酶一起直接分泌到動物消化道，去消化動物自身消化酶不能消化的抗營養因子。目前比較成功的案例是通過原核注射獲得轉大腸桿菌植酸酶基因豬Serguei P.Golovan (2001),中國農大轉植酸酶豬(2006)，然而由於飼料抗營養因子成分複雜，種類多，如非澱粉多糖中:玉米木聚糖、麥類植物中的葡聚糖，木聚糖、大豆中的甘露聚糖，這些環境友好型豬僅能滿足植酸磷的分解，吸收，對其他影響動物營養消化吸收非澱粉多糖(葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖等)抗營養因子無效，還達不到節糧減排的目的。且這些轉基因豬`都是採用傳統隨機整合技術製備，轉入基因片段常以串聯多拷貝重複，轉基因穩定性降低；隨機整合，轉基因位點不易鑑定。
[0009]腮腺蛋白是腮腺中表達豐度最高的蛋白。腮腺蛋白基因定位在小鼠2號染色體上，在基因組中該基因以單拷貝形式存在，且主要在腮腺特異表達，還有研究顯示其在唾液腺的頜下腺和舌下腺也有低表達。研究顯示該基因主要是由腮腺蛋白基因的上遊調控區(11.5Kb)和下遊序列(約2.5~3kb)(即腮腺蛋白啟動子PSP)調控的，但其調控基因僅在唾液腺中調控表達，在全身其他組織器官不表達。唾液腺表達外源蛋白的轉基因動物原理就是藉助腮腺蛋白啟動子可以把目的蛋白(酶或者藥物)在腮腺、舍下腺以及下頜下腺等唾液腺體經表達後直接分泌到動物唾液中，經口腔進入動物消化道，來發揮其功能。

【發明內容】

[0010]基於此，為了克服上述現有技術的缺陷，本發明提供了一種唾液腺組織特異性表達外源蛋白(自身分泌葡聚糖酶-木聚糖酶-植酸酶等多種酶)的轉基因載體和轉基因豬及其構建方法，從而提高動物對飼料營養利用率，達到減磷，氮排放目的，實現節糧減排環保型轉基因動物的研究和生產。 [0011]為了實現上述發明目的，本發明採取了以下技術方案:
[0012]一種唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因載體的構建方法，包括以下步驟:
[0013](I)、利用E2A、P2A和T2A的2A多肽序列將SEQ ID NO:1所示的葡聚糖酶基因Bgl7、SEQ ID N0:2所示的葡聚糖酶基因Egl314、SEQ ID NO:3所示的木聚糖酶基因XynB、以及SEQ ID N0:4所示的植酸酶基因APPA構建重組β-葡聚糖酶基因-木聚糖酶基因-植酸酶基因融合基因 Bgl7-E2A-Egl314-flag-P2A-XynB-T2A-APPA-HA ；
[0014](2)、分別以質粒 pcDNA3.1 (+)和 pT2AL200R175-CAGGS_EGFP 為模板，SEQ ID NO: 5和SEQ ID N0:6、及SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8為引物進行第一次PCR擴增，獲得帶有若干重疊序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5-3 μ L混合後作為模板進行第二次PCR擴增，純化得到neo-EGFP融合基因；用EcoR I和Xba I雙酶切pcDNA3.1 (+)和neo-EGFP融合基因，純化回收酶切產物，連接，構建得到pcDNA-Neo-T2A-EGFP載體；
[0015](3)、以質粒 pPB-UbC-EGFP-neo 為模板，分別以 SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO: 10、及 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 作為引物，進行 PCR 擴增得到 Not 1-5-PB-Not I，Xho 1-3-PB-Xho I，分別採用Not I和Xho I酶切後，連接在載體pPSPBGPneo-XynB上，得到載體 pPSPBGPneo-PB-XynB ；
[0016](4)、以步驟(2)得到的pcDNA-neo-T2A-EGFP載體為模板，用長片段PCR體系，SEQID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 作為引物進行 PCR擴增得到 infusion-CMV-neo-T2A_EGFP 片段，切膠純化；用Cla I和Bgl II雙酶切步驟⑵得到的載體pPSPBGPneo-PB-XynB，對目的片段切膠純化；將infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段重組到pPSPBGPNeo-PB-XynB載體的兩個 1xp 位點中間，得到 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 載體；
[0017](5)、以步驟(4)得到的 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 載體為模板，SEQ IDNO: 15和SEQ ID NO: 16作為引物，進行PCR擴增，得到載體中的pPB-lox—neoEGFP—loxp片段，並添加AgeI限制性內切酶位點，純化，得到新載體骨架；
[0018](6)、以小鼠腮腺蛋白基因上遊調控區的PCR擴增片段為模板，SEQ ID N0:17和SEQID勵:18為引物，擴增得到小鼠腮腺蛋白上遊調控區的下遊400%?片段，將400%?片段與新載體骨架pPB-lox-neoEGFP-loxp中的重組序列進行重組，得到中間載體I ;
[0019](7)、以小鼠腮腺蛋白基因上遊調控區的PCR擴增片段為模板，以SEQ ID N0:19和SEQ ID N0:20為引物，擴增得到小鼠腮腺蛋白上遊調控區的下遊4706bp片段；將其重組到步驟(6)的中間載體I的StuI位點，即為中間載體2 ；
[0020](8)、以小鼠腮腺蛋白基因上遊調控區的PCR擴增片段為模板，以SEQ ID N0:21和SEQ ID NO: 22為引物，利用AgeI位點，擴增得到小鼠腮腺蛋白上遊調控區的下遊3956bp片段；將其重組到步驟(7)的中間載體2上，得到載體pPB-MusPSP-neo-EGFP ；
[0021](9)、將步驟⑴得到的葡聚糖酶基因-木聚糖酶基因-植酸酶基因融合基因Bgl7-E2A-Egl314-flag-P2A-XynB-T2A-APPA-HA 用 in-fusion 重組酶(Clontech 公司)重組步驟(8)得到的載體pPB-MusPSP-neo-EGFP的ASCI位點，唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因載體
[0022]pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp，序列號為 SEQ ID NO:35。
[0023]在其中一個實施例中，步驟(1)中所述融合基因BgEgXyAp的構建方法包括以下步驟:
[0024](I)、以 SEQ ID NO: 27, SEQ ID N0:28 為引物，SEQ ID NO: 36 為模板擴增 Bgl7_E2A ;
[0025](2)、以 SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 為引物，SEQ ID NO:36 為模板擴增E2A-Egl314 ；
[0026](3)、利用重疊延伸PCR，以SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 30為引物，以摩爾比為1:1混合的 Bgl7-E2A 和 E2A-Egl314 為模板，獲得 Bgl7-E2A_Egl314-f lag ；
[0027](1)-(3)中 PCR 擴增的反應程序為:98°C Imin ；98°C IOs ；60°C 5s ；72°C Imin; 35個循環；72°C 2min。
[0028](4)、以 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32 為引物，以插入 XYNB 基因片段的 pcDNA3.1載體為模板，擴增得到P2A-XynB-T2A ；
[0029](5)、以 SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 為引物，以插入 APPA 基因片段到 pcDNA3.1載體為模板，擴增得到T2A-APPA-HA ；
[0030](6)、以 SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:34 為引物，以摩爾比為 1:1:1 的Bgl7-E2A-Egl314-flag、P2A-XynB_T2A、T2A-APPA-HA 混合作為模板，擴增獲得融合基因BgEgXyAp ；
[0031](4)-(6)中 PCR 擴增的反應程序為:98°C Imin ；98°C IOs ；60°C 5s ；72°C 2min;35個循環；72°C 2min。
[0032]在其中一個實施例中，所述步驟(6)-(8)中的小鼠腮腺蛋白基因上遊調控區的PCR擴增片段的克隆方法為:以FVB小鼠基因組DNA為模板，SEQ ID N0:23和SEQ ID NO:24為引物，KOD-FX聚合酶進行第一次PCR擴增；以第一次擴增的產物為模板，SEQ ID N0:25和SEQ ID NO: 26為引物，進行第二次PCR擴增，即得。
[0033]在其中一個實施例中，所述步驟(6)-⑶中第一次PCR擴增的反應程序為:94 0C 2min ；98 °C IOs,74 °C 13min,5cycles ；98 °C 10s,72 °C 13min, 5cycles ；98 °C 10s,70°C 13min,5cycles ；98°C 10s, 68°C 13min, 30cycles ；68°C 7min ;所述第二次 PCR 擴增的反應程序為-MV 2min ；98°C 10s, 68°C 13min, 30cycles ；68°C 7min。
[0034]在其中一個實施例中，步驟⑵中所述第一次PCR的反應程序為:98°C 2min ；98 °C 10s, 68 °C 50s, 35 個循環；72°C IOmin ;第二次 PCR 反應程序:98 °C 2min ；98°C 10s,68°C lmin40s，35 個循環；72°C IOmin0
[0035]在其中一個實施例中，步驟(3)中所述PCR的反應程序為:94°C 30s ；55°C 30s, 35個循環；72°C 30s, 72 ° C 3min，30個循環；步驟(4)中所述PCR的反應程序為:98°C 2min ；98 °C 10s, 68 °C 4min，35個循環；72°C IOmin ;步驟(5)-(8)中所述PCR的反應程序為:98°C Imin ；98°C IOs ；60°C 5s ；72°C 2min;35 個循環；72°C 2min。[0036]本發明還提供了上述構建方法構建得到的唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因載體pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp,序列號為SEQ ID NO:35,可以自身表達葡聚糖酶-木聚糖酶-植酸酶等多種酶。
[0037]本發明還提供了一種唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因豬的構建方法，包括以下步驟:
[0038](I)、將上述的轉基因載體pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp與轉座酶質粒PCMV-mpb混合轉染豬胎兒成纖維細胞系，篩選可穩定表達載體的單克隆轉基因細胞系；
[0039](2)、將獲得的單克隆轉基因細胞系作為核供體細胞，注射到卵母細胞中，構建重構胚胎，採用常規育種技術進行培育，即可得到多基因共表達的轉基因豬。
[0040]在其中一個實施例中，所述轉基因載體pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp與轉座酶質粒PCMV-mpb的摩爾數比為1:1。
[0041]在其中一個實施例中，所述可穩定表達載體的單克隆轉基因細胞系的篩選步驟為:將轉染後的細胞鋪板36小時後，按照1:6傳代，首先在細胞篩選培養基中添加G418300ug/ml，對轉染後的細胞篩選5天後，再改用200ug/ml濃度繼續篩選10天，接著改為80ug/ml維持篩選，同時在15%FBS肽牛血清培養基中添加2.5_5ng/mL BFGF，得到帶綠色螢光的細胞團，待細胞團長成片後，小心刮去周圍沒螢光細胞，用0.05%胰酶消化傳代，傳至2-3代後，再檢測綠色螢光表達。挑選綠色螢光表達亮，細胞形態正常的細胞，即單克隆轉基因細胞系；所述細胞篩選培養基的配方為:42.5°/￡lutaMAXTM、42.5%高糖DMEM、15%FBS。
[0042]本發明還提供了上述構建方法構建得到的唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因豬，可以自身表達葡聚糖酶-木聚糖酶-植酸酶等多種酶。
[0043]本發明通過將豬密碼子優化的重組雙葡聚糖酶基因(Bgl7/egl314，來源Bisporasp.MEY-l/Bacillus licheniformis EGW039)，豬密碼子優化的酸性木聚糖酶基因(XYNB，來源黑麴黴)，豬密碼子優化的植酸`酶基因(APPA，來源大腸桿菌)。分別去除其自身信號肽序列，人工添加豬腮腺蛋白信號肽序列(PSP signal piptide)，構建具有在腮腺組織分泌功能的重組酶。然後藉助T2A、P2A、E2A等2A序列短肽，將4個基因融合到一起，得到融合基因BgEgXyAp。將其置於FVB小鼠調控上遊區下遊(即載體pPB-MusPSP-neo-EGFP的ASCI位點)，構建成 pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp 轉基因載體。
[0044]通過將pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp轉基因載體和轉座酶混合，共轉染豬胎兒成纖維細胞，經藥物篩選，獲得轉基因細胞系。將獲得的體細胞作為核供體細胞，注射到卵母細胞中，構建重構胚胎，經體外過夜培養，將其移至到同期發情處理的受體母豬輸卵管內。受體母豬經妊娠和分娩，並進行轉基因豬突光檢測，反向PCR, southern bloting,轉基因豬唾液酶活檢測。
[0045]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
[0046]1、本發明從育種手段著手，一次性轉移按照豬密碼子優化的葡聚糖酶基因(Bgl7/Egl314)，木聚糖酶(XynB)，植酸酶(AppA)4個耐酸基因。針對麥類原料葡聚糖酶，玉米木聚糖酶，和植物性飼料中的植酸酶都有水解作用，文獻顯示Bgl7對羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)也有一定降解能力。利用豬唾液腺做為反應器，終生分泌，達到永久代替飼料中這些酶製劑的添加，更好的發揮這些酶的作用；
[0047]2、在轉基因技術上，本發明採用piggybac系統，解決轉基因效率問題，轉基因整合模式上由頭尾串聯多拷貝重組，變成了單位點單拷貝整合，更好的模擬生物基因的內環境，實現轉基因動物快速鑑定和整合位點檢測。本發明轉基因豬，在其唾液腺中可以共表達重組葡聚糖酶、木聚糖酶、植酸酶3種酶，轉入基因既可以水解植酸酶，又可以水解。目前主要飼料原料中非澱粉多糖等抗營養因子，比文獻中提到轉植酸酶轉基因豬，更有優勢，實現了多基因共表達技術，提高大片段基因轉移效率問題。
[0048]3、本發明構建得到的轉基因豬還攜帶EGFP綠色螢光標記，便於檢測，其1xp重組位點，也可以方便後期刪除。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1為本發明實施例1中Bgl7，Egl314，XYNB, APPA及融合基因BgEgXyAp在哺乳動物細胞的酶活測定結果圖；
[0050]圖2為本發明實施例1中融合基因[0051 ] Bgl7-E2A-Eg1314_flag-P2A_XynB-
[0052]T2A-APPA-HA (BgEgXyAp)的重組構建示意圖；
[0053]圖3為實施例1中克隆得到的MusPSP的PCR圖譜，其中A為MusPSP上遊調控區克隆(-11503bp ~+1390bp) ；B 為 MusPSP 上遊調控區克隆(_11325bp ~+980bp)；
[0054]圖4為實施例1中Neo-T2A-EGFP的酶切鑑定電泳圖，其中1、2、3分別代表T2A-EGFP (765bp)，neo-T2A (835bp)，neo-T2A_EGFP (1600bp)；
[0055]圖5為實施例1中pcDNA-Neo-T2A-EGFP的酶切鑑定電泳圖，其中1、2代表pcDNA-Neo-T2A-EGFP的目的條帶1590bp，3代表1和2的質粒對照；
[0056]圖6為實施例1中pPSPBGPneo-PB-XynB載體的酶切鑑定電泳圖，其中M代表Marker2000 ;1、2 為 pPSPBGPneo-PB-XynB 質粒對照，3、4 分別代表該質粒 Xho I 和 Not I 的酶切結果；
[0057]圖7為實施例1中pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB載體的酶切鑑定電泳圖，其中M 代表 DL DNA15000Marker ;泳帶 I 代表 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB_XynB 載體質粒對照，2、3代表1的酶切結果，箭頭所指為目的條帶2935bp ；
[0058]圖8為實施例1中小鼠腮腺蛋白上遊調控區(MusPSP)克隆的構建示意圖；
[0059]圖9為實施例1中MusPSP調控區片段l(_3143bp~+865bp)克隆質粒AscI, NotI酶切鑑定圖譜；其中帶1，2，3，4，5為不同克隆酶切鑑定，箭頭指示目的帶；
[0060]圖10為實施例1中MusPSP調控區片段2 (_7849bp~-3143)Agel、stul酶切鑑定圖譜；其中帶1，2，3為不同克隆株酶切鑑定；
[0061]圖11為實施例1中MusPSP調控區片段3 (_11805pb~_7849bp)AgeI酶切鑑定圖譜；其中帶1，2，3，4為不同克隆酶切鑑定；
[0062]圖12為實施例1中構建得到的PPB-MusPSP-neoEGFP-BgEgXyAp轉基因載體的ASCI酶切鑑定圖譜；其中M代表DL markerl5000，帶1，2，3，4不同克隆的酶切鑑定；
[0063]圖13為實施例1中構建得到的PPB-MusPSP-neoEGFP-BgEgXyAp轉基因表達載體的結構圖譜；
[0064]圖14為實施例2中構建得到的轉基因豬的螢光檢測圖；
[0065]圖15為本發明實施例2的轉基因豬的PCR檢測圖譜，其中Lanel_12號依次為 M:DL2000Marker ;P:質粒陽性對照(positive) ;W:水；N:野生型豬(nagative) DNA ;lane5-12:轉基因豬DNA樣品；
[0066]圖16為本發明實施例2的轉基因豬H)代的Southern Bloting檢測圖譜，其中，M:地高辛標記的Marker ;6C、10C4C分別為6、10、4個拷貝的陽性對照；607為陰性豬對照；605和707為轉基因陽性豬；
[0067]圖17為本發明實施例2的轉基因豬605和707整合位點測序分析圖；
[0068]圖18為實施例3中對轉基因豬的唾液中葡聚糖酶,木聚糖酶,植酸酶酶活力的測定圖。
【具體實施方式】
[0069]以下結合附圖和具體實施例來詳細說明本發明。
[0070]如無特殊說明，以下實施例中所使用的試劑均來源於市售，操作方法均為現有常規操作方法。
[0071]實施例1轉基因表達載體pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp的構建
[0072]包括以下步驟:
[0073]1、目的基因的獲得
[0074]根據文獻報導，篩選一系列在原核或者低等真核生物(酵母系統)高酶活的耐酸的葡聚糖酶基因(cel4T(脂環酸芽孢桿菌)、beta-l,3(4)_glucanase(擬青黴屬)、Bisporasp.MEY-1 源 Bgl7A、地衣芽抱桿菌源 egl314、Citrobacter freundii 來源的 C-APPA> 以及大腸桿菌來源的AppA、黑麴黴源的XYNB，將這些基因去除相應的自身信號肽序列，加上豬腮腺蛋白信號肽成熟肽序列，並根據豬密碼子優化後經行人工合成。然後在哺乳動物表達系統豬腎PK15細胞表達，篩選能夠在豬細胞分泌出具有高酶活力的基因，本發明篩選出適合在哺乳動物系統分泌表達豬密碼子優化後的葡聚糖酶基因Bgl7 (SEQ ID NO:1)和 Egl314(SEQ ID N0:2)，木聚糖酶基因(XynB、SEQ ID N0:3)，植酸酶基因(APPA、SEQ IDNO:4)。
[0075]2、融合基因的構建
[0076]利用E2A\P2A\T2A等2A多肽序列將這些基因構建重組β -葡聚糖酶基因_木聚糖酶基因-植酸酶基因融合基因(Bgl7-E2A-Egl314-flag-P2A-XynB-T2A-APPA-HA)，並在其Egl314基因後添加flag-標籤、在APPA基因後添加HA-標籤便於後期對表達蛋白檢測，構建的融合基因縮寫為BgEgXyAp。Bgl7，Egl314，XYNB, APPA及融合基因BgEgXyAp在哺乳動物細胞的酶活測定結果如圖1所示。圖1顯示經豬密碼子優化和哺乳動物細胞表達篩選獲得4種可在哺乳動物系統表達具有生物學功能的酶基因Bgl7，Egl314，XYNB, APPA，將4個基因經添加檢測標籤和融合重組後得到BgEgXyAp，具有4個酶的生物功能。
[0077]請參閱圖2，為β -葡聚糖酶基因-木聚糖酶基因-植酸酶基因融合基因Bgl7_E2A-Eg1314-fIag-P2A-XynB-T2A-APPA-HA(BgEgXyAp)的重組構建示意圖，包括以下步驟:
[0078](1)、以 N-3G-1F(SEQ ID NO: 27)，Bgl7_E2A_R(SEQ ID NO:28)作為弓丨物，PUC-Bgl7-a3-egl314-flag (SEQ ID NO: 36，委託南京金斯瑞人工合成)為模板擴增Bgl7-E2A (片段 I)；
[0079](2)、以 E2A-Eg-1F(SEQ ID NO:29)，E2A_2R(SEQ ID NO:30)作為引物，PUC-Bgl7-a3-egl314-flag (SEQ ID N0:36，委託南京金斯瑞人工合成)為模板擴增E2A-Egl314(片段 2)；
[0080](3)、利用重疊延伸 PCR，以 N-3G-1F(SEQ ID N0:27)，E2A_2R(SEQ ID NO:30)為引物，以混合Bgl7-E2A (片段I)和E2A-Egl314(片段2)為擴增模板(片段1:片段2=1:1)，獲得 Bgl7-E2A-Egl314-flag ；
[0081]以上(I)-(3)中PCR 擴增的反應程序為:98 V Imin ；98 V IOs ；60 V 5s ；72°C Imin; 35 個循環；72°C 2min。
[0082](4)、以 N-XYB3-3F(SEQ ID NO: 31)，N_XYB3_4R(SEQ ID NO: 32)為引物，以pCD-XYNB(基本方法:將XYNB基因片段插入到pcDNA3.1 (invtrogen)載體的EcoRI和XhoI位點)為模板，擴增得到P2A-XynB-T2A ；
[0083](5)、以 N-APPA-5F (SEQ ID NO: 33)，N-APPA-6R (SEQ ID NO: 34)，以 pCD-APPA (基本方法:將APPA基因片段插入到pcDNA3.1 (invtrogen)載體的EcoRI和XhoI位點)為模板，擴增得到T2A-APPA-HA ；
[0084](6)、以 N-3G-1F(SEQ ID NO: 27)，N_APPA_6R(SEQ ID NO: 34)，以 PCR 擴增產物:Bgl7-E2A-Egl314-flag (步驟 3)、P2A_XynB_T2A (步驟 4)、T2A-APPA-HA (步驟 5)按摩爾比1:1:1混合後取I~5ul進行擴增。獲得β -葡聚糖酶基因-木聚糖酶基因-植酸酶基因融合基因 Bgl7-E2A-Egl314-flag-P2A-XynB-T2A-APPA-HA(BgEgXyAp)。
[0085]以上(4)-(6)中PCR 擴增的反應程序為:98 V Imin ；98 V IOs ；60 V 5s ；72°C 2min;35 個循環；72°C 2min。
[0086]
【權利要求】
1.一種唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因載體的構建方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)利用E2A、P2A和T2A的2A多肽序列將SEQID NO:1所示的葡聚糖酶基因Bgl7、SEQ ID N0:2所示的葡聚糖酶基因Egl314、SEQ ID NO: 3所示的木聚糖酶基因XynB、以及SEQ ID NO: 4所示的植酸酶基因APPA構建重組β-葡聚糖酶基因-木聚糖酶基因-植酸酶基因融合基因BgEgXyAp ；
(2)、分別以質粒pcDNA3.1(+)和 pT2AL200R175-CAGGS-EGFP 為模板，SEQ ID NO:5 和SEQ ID Ν0:6、及SEQ ID Ν0:7和SEQ ID NO:8為引物進行第一次PCR擴增，獲得帶有若干重疊序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5_3 μ L混合後作為模板進行第二次PCR擴增，純化得到neo-EGFP融合基因；用EcoR I和Xba I雙酶切pcDNA3.1 (+)和neo-EGFP融合基因，純化回收酶切產物，連接，構建得到pcDNA-Neo-T2A-EGFP載體； ⑶、以質粒 pPB-UbC-EGFP-neo 為模板，分別以 SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10、及 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 作為引物，進行 PCR 擴增得到 Not 1-5-PB-Not I，Xho 1-3-PB-Xho I，分別採用Not I和Xho I酶切後，連接在載體pPSPBGPneo-XynB上，得到載體 pPSPBGPneo-PB-XynB ； (4)、以步驟(2)得到的pcDNA-neo-T2A-EGFP載體為模板，用長片段PCR體系，SEQIDNO: 13 和 SEQ ID NO: 14 作為引物進行 PCR 擴增得到 infusion-CMV-neo-T2A_EGFP 片段，切膠純化；用Cla I和Bgl II雙酶切步驟(2)得到的載體pPSPBGPneo-PB-XynB，對目的片段切膠純化；將infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段重組到pPSPBGPNeo-PB-XynB載體的兩個1xp 位點中間，得到 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 載體； (5)、以步驟(4)得到的pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 載體為模板，SEQ ID NO: 15 和SEQ ID勵:16作為引物，進行？0?擴增，得到載體中的？?8-1(?-1^(^6---1(--片段，並添加AgeI限制性內切酶位點，純化，得到新載體骨架； (6)、以小鼠腮腺蛋白基因上遊調控區的PCR擴增片段為模板，SEQID NO: 17和SEQ IDNO: 18為引物，擴增得到小鼠腮腺蛋白上遊調控區的下遊4009bp片段，將4009bp片段與新載體骨架pPB-lox-neoEGFP-loxp中的重組序列進行重組，得到中間載體I ; (7)、以小鼠腮腺蛋白基因上遊調控區的PCR擴增片段為模板，以SEQID NO: 19和SEQID N0:20為引物，擴增得到小鼠腮腺蛋白上遊調控區的下遊4706bp片段；將其重組到步驟(6)的中間載體I的StuI位點，即為中間載體2 ； (8)、以小鼠腮腺蛋白基因上遊調控區的PCR擴增片段為模板，以SEQID N0:21和SEQID NO:22為引物，利用AgeI位點，擴增得到小鼠腮腺蛋白上遊調控區的下遊3956bp片段；將其重組到步驟(7)的中間載體2上，得到載體pPB-MusPSP-neo-EGFP ; (9)、將步驟(1)得到的β-葡聚糖酶基因-木聚糖酶基因-植酸酶基因融合基因BgEgXyAp用in-fusion重組酶重組到步驟(8)得到的載體pPB-MusPSP-neo-EGFP的ASCI位點，即得序列號為SEQ ID NO: 35的四基因共表達的表達載體pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp。
2.根據權利要求1所述的唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因載體的構建方法，其特徵在於，步驟(1)中所述融合基因BgEgXyAp的構建方法包括以下步驟:
(I)、以 SEQ ID NO:27, SEQ ID N0:28 為引物，SEQ ID NO: 36 為模板擴增 Bgl7_E2A ;(2)、以SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30 為引物，SEQ ID NO: 36 為模板擴增 E2A_Egl314 ; (3)、利用重疊延伸PCR，以SEQID NO: 27,SEQ ID NO: 30為引物，以摩爾比為1:1混合的 Bgl7-E2A 和 E2A-Egl314 為模板，獲得 Bgl7-E2A_Egl314-f lag ；
(1)-(3)中 PCR 擴增的反應程序為:98°C Imin ；98°C IOs ；60°C 5s ；72°C lmin;35 個循環；72°C 2min。 (4)、以SEQID NO: 31、SEQ ID NO: 32為引物，以插入XYNB基因片段的pcDNA3.1載體為模板，擴增得到P2A-XynB-T2A ； (5)、以SEQID NO: 33、SEQ ID NO: 34為引物，以插入APPA基因片段到pcDNA3.1載體為模板，擴增得到T2A-APPA-HA ； (6)、以SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:34 為引物，以摩爾比為 1:1:1 的Bgl7-E2A-Egl314-flag、P2A-XynB_T2A、T2A-APPA-HA 混合作為模板，擴增獲得融合基因BgEgXyAp ；
(4)-(6)中 PCR 擴增的反應程序為:98°C Imin ；98°C IOs ；60°C 5s ；72°C 2min;35 個循環；72°C 2min。
3.根據權利要求1或2所述的唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因載體的構建方法，其特徵在於，所述步驟(6)-(8)中的小鼠腮腺蛋白基因上遊調控區的PCR擴增方法為:以FVB小鼠基因組DNA為模板，SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24為引物，KOD-FX聚合酶進行第一次PCR擴增；以第一次擴增的產物為模板，SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:26為引物，進行第二次PCR擴增，即得；所述第一次PCR擴增的反應程序為:94°C 2min ；98°C 10s，74 °C 13min,5cycles ；98 °C 10s,72 °C 13min, 5cycles ；98 °C 10s,70 °C 13min,5cycles ；98°C 10s, 68°C 13min, 30cycles ；68°C 7min ;所述第二次PCR擴增的反應程序為:94°C 2min ；98°C 10s, 68°C 13min, 30cycles ；68°C 7min。
4.根據權利要求1或2所述的唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因載體的構建方法，其特徵在於，步驟(2)中所述第一次PCR的反應程序為:98°C 2min ；98°C 10s，68°C 50s，35 個循環；72°C IOmin ;第二次 PCR 反應程序:98°C 2min ；98°C 10s, 68°C lmin40s，35 個循環；72°C IOmin。
5.根據權利要求1或2所述的唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因載體的構建方法，其特徵在於，步驟⑶中所述PCR的反應程序為:94°C 30s ；55°C 30s，35個循環；72°C 30s, 72°C 3min，30 個循環；步驟(4)中所述 PCR 的反應程序為:98°C 2min ；98°C 10s，68°C 4min，35個循環；72°C IOmin ;步驟(5)-(8)中所述PCR的反應程序為:98 °C Imin ；98°C IOs ；60°C 5s ；72°C 2min;35 個循環；72°C 2min。
6.權利要求1-5任一項所述的構建方法構建得到的唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因載體 pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp，序列號為 SEQ ID NO: 35。
7.一種唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因豬的構建方法，其特徵在於，包括以下步驟:
(1)、將權利要求6所述的轉基因載體pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp與轉座酶質粒PCMV-mpb混合轉染豬胎兒成纖維細胞系，篩選可穩定表達載體的單克隆轉基因細胞系； (2)、將獲得的單克隆轉基因細胞系作為核供體細胞，注射到卵母細胞中，構建重構胚胎，採用常規育種技術進行培育，即可得到唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因豬。
8.根據權利要求7所述的唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因豬的構建方法，其特徵在於，所述轉基因載體pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp與轉座酶質粒PCMV_mpb的摩爾數比為1:1。
9.根據權利要求7所述的唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因豬的構建方法，其特徵在於，所述可穩定表達載體的單克隆轉基因細胞系的篩選步驟為: 將轉染後的細胞鋪板36小時後，按照1:6傳代，首先在細胞篩選培養基中添加G418300ug/ml，對轉染後的細胞篩選5天後，再改用200ug/ml濃度繼續篩選10天，接著改為80ug/ml維持篩選，同時在15%FBS肽牛血清培養基中添加2.5_5ng/mL BFGF,得到帶綠色螢光的細胞團，待細胞團長成片後，小心刮去周圍沒螢光細胞，用0.05%胰酶消化傳代，傳至2-3代後，再檢測綠色螢光表達。挑選綠色螢光表達亮，細胞形態正常的細胞，即單克隆轉基因細胞系； 所述細胞篩選培養基的配方為:42.5%GlutaMAX?、42.5%高糖DMEM、15%FBS。
10.權利要求7-9任一項所述的構建方法構建得到的唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因豬。
【文檔編號】A01K67/027GK103695451SQ201310343271
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年8月7日 優先權日:2013年8月7日
【發明者】張獻偉, 吳珍芳, 賀曉燕, 劉德武, 李紫聰 申請人:吳珍芳, 李紫聰