一種CHO-S細胞半固體培養基及其配製方法與應用與流程
2023-10-28 14:07:47 3
本發明涉及一種適合CHO-S細胞生長的半固體培養基及其配製方法與應用，屬於CHO-S細胞株開發領域。
背景技術：
抗體的靶向特異性及高表達量在臨床中具有重要意義，因此如何比競爭對手更快一步尋找到能夠穩定並大量分泌正確抗體的細胞系就顯得尤為重要。對此，傳統的細胞篩選採用有限稀釋法或細胞分選法，工作量大耗時長，通常篩選1000個細胞需要8周，而最終才能獲得一個好的克隆；且在挑克隆的時候容易對細胞造成機械傷害，導致克隆的成活率下降。現在企業常使用半固體培基法進行單克隆篩選。細胞生長在半固體培養基中，形成單克隆細胞團，同時將抗體分泌在細胞團周圍，半固體培養基中含有螢光標記的二抗，能與抗體Fc片段特異性結合，當用一定波長的光進行激發時就能發出螢光。使用圖像分析軟體能夠對單克隆細胞團的大小、螢光強度進行測定，從而篩選出生長旺盛、表達量高的單克隆細胞團。Molecular Device公司開發的Clone Pix system篩選方法(參考《CHO細胞株開發技術策略探討》)有效地避免了人工篩選細胞的弊端，可在短時間內挑選大量克隆，基於螢光檢測技術但無需表達載體自身產生螢光，從而有效地避免了假陽性；細胞處於半固體培養基中，挑選過程柔和，增加了細胞的存活率，因此效率大大提高。
在CHO細胞克隆篩選中，以Clone Pix system篩選方法為例，適合CHO細胞生長的半固體培養基是其中最關鍵環節之一。Molicular Devices公司開發了適合各種細胞生長的半固體培養基，其中適合CHO-S細胞的半固體培養基CloneMedia-CHO-G(Cat：K8740)價格非常昂貴，90mL售價4251元，貨期長，物流成本高，且少有此款產品的替代品，因此有關CHO-S細胞開發的研發成本非常高。除了固定成分外，半固體培養基的配製方法也對細胞生長起重要作用。而CloneMedia-CHO-G半固體培養基的配方和配製方法均為Molicular Devices的商業秘密，不為公眾所知。
因此，有必要開發新的適合CHO-S細胞生長的半固體培養基及其製備方法，以 降低科研成本，增大實驗材料的選擇自由度。
技術實現要素：
為解決上述問題，本發明的一個目的是提供一種CHO-S細胞半固體培養基，該半固體培養基適合於CHO-S細胞生長，可用於細胞克隆篩選階段，能有效替代Molicular Devices公司開發的適合CHO-S細胞的CloneMedia-CHO-G半固體培養基。
本發明的另一個目的是提供一種配製適合CHO-S細胞半固體培養基的方法。
為解決上述問題，本發明的技術方案為：
一方面，本發明提供一種CHO-S細胞半固體培養基，按重量百分比計，所述半固體培養基包含如下組分：2.46％～2.48％CD FortiCHO培養基，2％～3％甲基纖維素。
根據本發明的具體實施方案，本發明的CHO-S細胞半固體培養基由2×CDFortiCHO和2×甲基纖維素溶液按照體積比1:1充分混勻後離心除去肉眼不可見顆粒，收集上層離心液得到。
優選地，上述CD FortiCHO培養基為固體培養基CD FortiCHO AGT Medium Prototype或CD FortiCHO II，這些固體培養基可由gibco公司商購獲得。
優選地，按質量體積比計算，所述甲基纖維素在20℃下、2％時的黏度為25cps～1500cps。
在本發明的一種實施方式中，所述甲基纖維素的平均分子量為17000～63000。
優選地，所述甲基纖維素的含量為2.7％～3.0％。
另一方面，本發明還提供了一種配製所述CHO-S細胞半固體培養基的方法，該方法包括：
a、將體積比為1:1的2×CD FortiCHO培養基和2×甲基纖維素溶液充分混勻；
b、離心除去肉眼不可見顆粒物質，收集上層離心液，即得CHO-S細胞半固體培養基；其中，優選地，所述離心條件為4000rpm～10000rpm，離心30min以上。
根據本發明的具體實施方案，本發明中，所述2×CD FortiCHO培養基是按照以下方法製得的：稱量CD FortiCHO培養基，加入超純水，充分攪拌溶解，0.20μM濾膜過濾除菌得到2×CD FortiCHO培養基。
根據本發明的具體實施方案，本發明中，所述2×甲基纖維素溶液是按照以下方法製得的：稱量甲基纖維素，加入超純水，充分攪拌溶解，高壓滅菌得到2×甲基纖 維素溶液。高壓滅菌條件可為常規培養基滅菌條件，例如可為121℃左右高壓滅菌30min。
半固體培養基的配製方法通常通過肉眼觀察培養基澄清透亮且無固體顆粒物即判斷為攪拌均勻、各組分充分溶解。一般通過延長攪拌時間或加大攪拌力度或通過煮沸等方式保證半固體培養基各組分充分溶解。但通過上述本領域常規方法配製的半固體培養基在實際應用中效果並非最佳，應用效果低於商品化半固體培養基。而在教科書的教導下，本領域普通技術人員通常認為半固體培養基充分攪拌溶解，肉眼觀察澄清即可，更不會進一步探究其微觀形態對應用效果的影響，也未就此檢索到相關的科技文獻或專利文獻報導。
本案發明人偶然將上述半固體培養基置於光學顯微鏡下觀察發現，肉眼觀察無固體顆粒的半固體培養基中仍存在大量細小難溶的固體顆粒物。進一步研究發現，離心可除去這些固體顆粒物，並將離心後的CHO-S細胞半固體培養基用於CHO-S細胞培養。試驗結果表明：離心處理的半固體培養基與未做離心處理的半固體培養基相比，CHO-S細胞生長大，蛋白表達量高，生長狀態相對較好，有益於後續細胞篩選工作。離心處理後的CHO-S細胞半固體培養基用於培養CHO-S細胞，獲得了預料不到的技術效果，超出了本領域技術人員的預期。
所述離心條件的判斷標準為在光學顯微鏡下觀察所述半固體培養基無細小固體顆粒物(即，在光學顯微鏡下觀察無可見的固體顆粒物)。優選地，本發明推薦離心條件為4000rpm～10000rpm，離心30min以上。本領域技術人員可以根據具體實驗條件、離心機轉子大小選擇更具體的轉速和離心時間。優選地，離心操作最好是在低溫下進行，比如4℃低溫離心。特別是含有CD FortiCHO培養基的離心操作儘量4℃低溫操作。
另一方面，本發明還提供了所述CHO-S細胞半固體培養基在培養CHO-S細胞中的應用。具體應用時，培養CHO-S細胞時的培養條件為：5％CO2，36.5℃。優選地，是靜止培養箱培養或120rpm搖瓶培養。試驗結果表明：本發明的CHO-S細胞半固體培養基用於培養CHO-S細胞，CHO-S細胞生長大，蛋白表達量高，生長狀態相對較好，有益於後續細胞篩選工作。
本發明的有益效果：
本發明提供的CHO-S細胞半固體培養基適合CHO-S細胞生長，能夠用於細胞克 隆篩選階段，為科研工作者或企業提供更多選擇；可用於替代Molicular Devices公司的CHO-S細胞半固體培養基CloneMedia-CHO-G，進而降低進口產品過長的供貨期對科研工作的影響，降低企業對該產品的依賴性；90mL CloneMedia-CHO-G的售價為4251元人民幣，而配製相同體積的本發明所述半固體培養基的成本約為130元人民幣，因此，採用本發明所述的半固體培養基替代Molicular Devices公司的CHO-S細胞半固體培養基CloneMedia-CHO-G可大幅降低研發生產成本；通過本發明提供的配製CHO-S細胞半固體培養基的方法配製的CHO-S細胞半固體培養基用於細胞培養，細胞生長大，蛋白表達量高，生長狀態好，取得了預料不到的效果，超出了本領域普通技術人員的預期；本發明提供的配製方法操作簡單，可行性強，結合大容量離心機，可批量配製半固體培養基以滿足研發生產需求。
附圖說明
圖1為自配CHO-S細胞半固體培養基未離心50倍放大圖，培養基配方見實施例1。
圖2為自配CHO-S細胞半固體培養基離心50倍放大圖，培養基配方見實施例1。
圖3為自配CHO-S細胞半固體培養基未離心50倍放大圖，培養基配方見實施例2。
圖4為自配CHO-S細胞半固體培養基離心50倍放大圖，培養基配方見實施例2。
圖5為自配CHO-S細胞半固體培養基(未離心)克隆第六天生長狀態白光圖，50倍放大，培養基配方見實施例1。
圖6為自配CHO-S細胞半固體培養基(未離心)克隆第六天生長狀態螢光圖，50倍放大，培養基配方見實施例1。
圖7為自配CHO-S細胞半固體培養基(離心)克隆第六天生長狀態白光圖，50倍放大，培養基配方見實施例1。
圖8為自配CHO-S細胞半固體培養基(離心)克隆第六天生長狀態螢光圖，50倍放大，培養基配方見實施例1。
圖9為自配CHO-S細胞半固體培養基(離心)克隆第六天生長狀態白光圖，50倍放大，培養基配方見實施例2。
圖10為自配CHO-S細胞半固體培養基(離心)克隆第六天生長狀態螢光圖，50 倍放大，培養基配方見實施例2。
圖11為自配CHO-S細胞半固體培養基(離心)克隆第六天生長狀態白光圖，50倍放大，培養基配方見實施例4。
圖12為自配CHO-S細胞半固體培養基(離心)克隆第六天生長狀態螢光圖，50倍放大，培養基配方見實施例4。
圖13為自配CHO-S細胞半固體培養基(離心)克隆第六天生長狀態白光圖，50倍放大，培養基配方見實施例6。
圖14為自配CHO-S細胞半固體培養基(離心)克隆第六天生長狀態螢光圖，50倍放大，培養基配方見實施例6。
圖15為商業CHO-S細胞半固體培養基CloneMedia-CHO-G克隆第六天生長狀態白光圖，50倍放大。
圖16為商業CHO-S細胞半固體培養基CloneMedia-CHO-G克隆第六天生長狀態螢光圖，50倍放大。
具體實施方式
下面通過具體實施例進一步詳細說明本發明的技術方案及其特點和應用中所具有的技術效果，但本發明並不因此而受到任何限制。
實施例1、CHO-S細胞半固體培養基配方
材料：
CD FortiCHO AGT Medium Prototype，供應商Gibco，貨號A14286EF；
甲基纖維素，供應商Sigma，貨號M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為400cPs。
按照重量百分比計：2.46％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，2％甲基纖維素。
實施例2、CHO-S細胞半固體培養基配方
CD FortiCHO AGT Medium Prototype，供應商Gibco，貨號A14286EF；
甲基纖維素，供應商Sigma，貨號M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為400cPs。
按照重量百分比計：2.46％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，3％甲基纖維素。
實施例3、CHO-S細胞半固體培養基配方
CD FortiCHO AGT Medium Prototype，供應商Gibco，貨號A14286EF；
甲基纖維素，供應商Sigma，貨號M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為400cPs。
按照重量百分比計：2.46％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，2.7％甲基纖維素。
實施例4、CHO-S細胞半固體培養基配方
CD FortiCHO II粉末，供應商Gibco，貨號A24363SA；
甲基纖維素，供應商Sigma，貨號M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為400cPs。
按照重量百分比計：2.48％CD FortiCHO II，2％甲基纖維素。
實施例5、CHO-S細胞半固體培養基配方
CD FortiCHO II粉末，供應商Gibco，貨號A24363SA；
甲基纖維素，供應商Sigma，貨號M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為400cPs。
按照重量百分比計：2.48％CD FortiCHO II，2.7％甲基纖維素。
實施例6、CHO-S細胞半固體培養基配方
CD FortiCHO II粉末，供應商Gibco，貨號A24363SA；
甲基纖維素，供應商Sigma，貨號M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為400cPs。
按照重量百分比計：2.48％CD FortiCHO II，3％甲基纖維素。
實施例7、CHO-S細胞半固體培養基配方
CD FortiCHO AGT Medium Prototype，供應商Gibco，貨號A14286EF；
甲基纖維素，供應商Sigma，貨號M6385-500G，平均分子量17000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為25cPs。
按照重量百分比計：2.46％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，3％甲基纖維素。
實施例8、CHO-S細胞半固體培養基配方
CD FortiCHO AGT Medium Prototype，供應商Gibco，貨號A14286EF；
甲基纖維素，供應商Sigma，貨號M0387-500G，平均分子量63000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為1500cPs。
按照重量百分比計：2.46％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，2％甲基纖維素。
實施例9、CHO-S細胞半固體培養基配方
CD FortiCHO II粉末，供應商Gibco，貨號A24363SA；
甲基纖維素，供應商Sigma，貨號M6385-500G，平均分子量17000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為25cPs。
按照重量百分比計：2.48％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，3％甲基纖維素。
實施例10、CHO-S細胞半固體培養基配方
CD FortiCHO II粉末，供應商Gibco，貨號A24363SA；
甲基纖維素，供應商Sigma，貨號M0387-500G，平均分子量63000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為1500cPs。
按照重量百分比計：2.48％CD FortiCHO II，2％甲基纖維素。
實施例11、CHO-S細胞半固體培養基的配製方法
CHO-S細胞半固體培養基按照如下步驟配製：
(1)2×CD FortiCHO培養基準備：準確稱量CD FortiCHO AGT Medium Prototype或CD FortiCHO II固體培養基，加入超純水，400rpm磁力攪拌器攪拌30min使充分溶解，然後用0.20μM濾膜(sartolab-P20plus，cat：18056)過濾除菌得到2×CDFortiCHO培養基，4℃冰箱保存備用。
(2)2×甲基纖維素溶液準備：準確稱量甲基纖維素加入純化水，400rpm磁力攪拌器皿充分攪拌60min使溶解，121.3℃高壓滅菌20分鐘，待降為室溫後，放入4℃冰箱保存30分鐘以上備用。
(3)在生物安全櫃中將已經配製好的2×CD FortiCHO培養基和2×甲基纖維素溶液按照1:1的體積比混合，4℃600rpm磁力攪拌器攪拌過夜。
(4)將步驟(3)所得半固體培養基分裝在50mL無菌離心管內，4000rpm離心30min至上清液在顯微鏡下50倍放大觀察無細小難溶固體顆粒物，丟棄離心管最底層固體培養基(約5mL)，收集上層半固體培養基，-20℃冰箱保存備用。
實施例12、CHO-S細胞半固體培養基(離心與未離心)與商業CHO-S細胞半固體培養基CloneMedia-CHO-G培養CHO-S細胞生長狀態比對
試驗材料：
(1)實施例1 CHO-S細胞半固體培養基，按照實施例11所述步驟1-4配製，得到離心自配CHO-S細胞半固體培養基。
(2)實施例1 CHO-S細胞半固體培養基，按照實施例11所述步驟1-3配製，得到未離心自配CHO-S細胞半固體培養基。
(3)實施例2 CHO-S細胞半固體培養基，按照實施例11所述步驟1-4配製，得到離心自配CHO-S細胞半固體培養基。
(4)實施例4 CHO-S細胞半固體培養基，按照實施例11所述步驟1-4配製，得到離心自配CHO-S細胞半固體培養基。
(5)實施例6 CHO-S細胞半固體培養基，按照實施例11所述步驟1-4配製，得到離心自配CHO-S細胞半固體培養基。
(6)商業CHO-S細胞半固體培養基CloneMedia-CHO-G，Molicular Devices，Cat：K8740。
(7)CHO-S宿主細胞，上海津曼特生物科技有限公司，表達IgG。
試驗方法：
將本發明提供的CHO-S細胞半固體培養基(離心與未離心)與Molicular Devices商業CHO-S細胞半固體培養基用CHO-S宿主細胞進行鋪板，比較二者的細胞生長和IgG蛋白表達量。
配製的半固體培養基和商業培養基從-20℃冰箱分別取出，放在4℃冰箱過夜，溶解完全。如果鋪一塊6-well plate，細胞房超淨工作檯裡，在50ml無菌離心管中，加入15ml半固體培養基，再加入0.6ml L-Glutamine(Gibco，200mM，cat：25030-081)，接著加入150μl的CloneDetect(Molicular Devices，cat：K8200)，然後將其充分混合，再加入3000～12000個細胞(也就是500～2000個細胞每個孔)，再次混合均勻，取2ml混合物到每個孔中(避免汽包產生，並且平鋪)。最後放入恆溫培養箱(36.5℃，5％CO2)培養6天。
試驗結果：見圖1-圖16。
圖1與圖2、圖3與圖4為自配CHO-S細胞半固體培養基離心與未離心液體50 倍放大圖。結果顯示，未離心CHO-S細胞半固體培養中仍存有大量細小難溶固體顆粒物，顆粒物實際粒徑約10-50μm。
從未離心與離心的CHO-S細胞自配半固體培養基培養CHO-S細胞生長狀態來看(見圖5～圖14)，未離心的CHO-S細胞自配半固體培養基背景雜質多(圖5、圖6)，細胞生長相對較小，IgG蛋白表達量低，生長狀態相對較差；而離心的CHO-S細胞自配半固體培養基背景較為清澈，細胞生長較大，IgG蛋白表達量較高(細胞克隆表達的抗體螢光圖直徑約1-2mM)，生長狀態相對較好(圖7-圖14)。
離心的自配CHO-S細胞半固體培養基(圖7-圖14))與商業CHO-S細胞半固體培養基培養CHO-S細胞生長狀態(圖15、圖16)相比較，離心自配半固體培養基CHO-S細胞克隆生長較為緊湊，螢光強度和大小部分克隆表現較強。
上述試驗結果表明本發明提供的離心自配CHO-S細胞半固體培養基應用效果基本達到甚至優於Molicular Devices商業半固體培養基；本發明提供的半固體培養基配製方法有利於提高其應用性能。
實施例13、離心自配CHO-S細胞半固體培養基與商業CHO-S細胞半固體培養基CloneMedia-CHO-G Fed-batch培養CHO-S細胞
試驗方法：將實施例12配製的CHO-S細胞半固體培養基離心液體(培養基配方見實施例1)和商業培養基(同實施例12)從-20℃冰箱分別取出，4℃冰箱過夜溶解。在細胞房超淨工作檯鋪一塊6-well plate：50ml無菌離心管中加入15ml半固體培養基，再加入0.6ml L-Glutamine(Gibco，200mM，cat：25030-081)，接著加入150μl的CloneDetect(Molicular Devices，cat：K8200)，將其充分混合後加入3000～12000個細胞(即500～2000個細胞/孔)，再次混合均勻，取2ml混合物到每個孔中(避免汽包產生，並且平鋪)。最後放入恆溫培養箱(36.5℃，5％CO2)培養6天。挑選克隆到96-well中培養5天，以Elisa titer高低和生長狀態從96-well中挑選出一定克隆到24-well中培養5天，同樣以Elisa titer高低和生長狀態從24-well中挑選出一定克隆到6-well中培養5天，最後仍然以Elisa titer高低和生長狀態從6-well中挑選出較少克隆到搖瓶進行培養，5天左右，將克隆一部分安全凍存，剩下進行Fed-batch培養。
對照組為Fed-batch培養母克隆sub 1。試驗用所有亞克隆均從母克隆sub 1鋪板挑選克隆篩選得到。
Fed-batch培養條件：250ml搖瓶接種50ml，搖床轉速130rpm，36.5℃培養，兩組實驗補料時間和次數均相同，第6天進行降溫。
Fed-batch培養結果見表1-表2。
表1 離心自配CHO-S細胞半固體培養基Fed-batch CHO-S細胞生長曲線
表2 Molicular Devices商業半固體培養基CloneMedia-CHO-G Fed-batch CHO-S細胞生長曲線
離心自配CHO-S細胞半固體培養基篩選出十個克隆，生長最高密度達27×106cells/ml，活率大部分克隆在50％以上(14天)，最高IgG抗體表達滴度達3.19g/L。商業半固體培養基CloneMedia-CHO-G篩選出十個克隆，生長最高密度達28×106cells/ml，活率大部分克隆在50％以上(14天)，最高IgG抗體表達滴度達3.25g/L。
以上試驗數據表明：本發明提供的離心自配CHO-S細胞半固體培養基應用效果基本達到Molicular Devices商業半固體培養基CloneMedia-CHO-G，可以替代其用於日常生產研發；本發明提供的半固體培養基配製方法有利於提高其應用性能。