用模式生物斑馬魚篩選誘導心肌細胞形成的藥物的方法
2023-10-29 00:54:52
專利名稱：用模式生物斑馬魚篩選誘導心肌細胞形成的藥物的方法
用模式生物斑馬魚篩選誘導心肌細胞形成的藥物的方法技術領域
本發明屬於醫藥技術領域，具體涉及一種候選藥物的高內涵篩選方法，尤其涉及以心臟轉基因斑馬魚為模型，篩選促進心肌細胞形成的藥物前體(小分子化合物)的方法。
背景技術：
心血管疾病是危害人類健康的最常見疾病，其發病率和死亡率已經超過惡性腫瘤位居第一位。儘管現代醫學不斷取得進步，但對心肌梗死和心力衰竭等缺血性心臟病的治療仍然面臨巨大挑戰，發展能夠在心肌梗死區激發心肌細胞形成和再生以增加心肌細胞數量的治療方法，在臨床上具有巨大的醫療前景和經濟效益。發現新的能夠誘導外源或內源的成年心臟幹細胞分化成心肌細胞的生物試劑和小分子物質對於心臟的損傷修復有治療意義。因此建立一種有效的篩選促進心肌細胞形成的小分子化合物的方法具有重要意義。
斑馬魚是一種非常好的模式生物，斑馬魚全身透明的特性有助於觀察其表型的改變，是國內外研究藥物的有效工具。建立帶有綠色或者紅色螢光的轉基因斑馬魚品系，易於觀察不同化合物對其表型的影響。成體斑馬魚長3-4釐米，一次交配能夠獲得100-200枚胚胎，每周產卵一次，其餵養和維持的費用較低，所需空間場地不大，適於室內大規模繁殖。 目前，斑馬魚主要用於遺傳發育方面，利用其作為研究對象篩選能夠促進心肌細胞形成的小分子化合物的方法還沒有相關報導。發明內容
本發明目的是提供一種操作方便，成本低，實驗結果可靠準確，快速篩選誘導心肌細胞形成的小分子化合物的方法。
本發明提供的篩選誘導心肌細胞形成的小分子化合物的方法，採用模式生物轉基因斑馬魚，具體步驟如下1、對從藥物庫中取出的各種不同結構的小分子化合物，用DMSO (二甲亞碸)作為助溶劑，配成ImM的儲存液；在表型篩選時，將每種化合物用胚胎培養液稀釋成1_30μΜ。
2、使心臟轉基因斑馬魚Tg(CmlC2:EGFP)純合體進行交配，獲得胚胎，培養至50% 外包期(受精後5小時)；然後將胚胎轉移至培養板(如96孔板)中，每孔置入適量胚胎(如 3枚胚胎)，同時加入不同小分子化合物的胚胎培養液，在20-30°C胚胎培養箱進行培養；其中，DMSO作為空白對照組；在胚胎發育不同階段(例如培養至M小時，48小時，72小時等不同階段)，對胚胎心臟大小和心臟形態進行仔細的檢查，並且通過細胞核標記的轉基因斑馬 iTg(CmlC2:DSRed-nUC)進行心肌細胞計數；最後對實驗結果進行初步判定，分析各個小分子化合物對心肌細胞形成的影響。
3、檢查胚胎的整體形態(比如背腹體軸和前後體軸等)及其它器官(包括大腦，眼睛，脊索和體節等)是否受到影響；通過觀察結果分析判定各個小分子化合物是否對胚胎其它器官有毒性作用。
根據上述兩個篩選標準，能夠獲得促進心肌細胞形成的藥物分子，而這些藥物分子對胚胎和其它器官則沒有毒性作用或者毒性較小；本發明提供的用模式生物斑馬魚篩選促進心肌細胞形成的小分子化合物的新方法和現有技術比較有以下優點可操作性強，實驗準確性高，化合物初篩的成功率高，同時活體內觀察，化合物組織特異性強，可直接觀察化合物的毒副作用，提高候選藥物篩選的效率。
圖1為體內篩選鑑定影響心臟發育的小分子化合物篩選過程示意圖。
圖2為心肌小分子化合物對心臟形成的影響。其中，A為心肌小分子化合物對心肌細胞的數量的影響；B心肌小分子化合物對不同發育時期心肌細胞形成發育影響的示意圖；C為心肌小分子化合物對不同發育時期心肌細胞數量的影響。
具體實施方式
根據下述實施例，可以更好的理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施所描述的具體的化合物的來源，濃度，斑馬魚的選擇及其結果僅適用於說明本發明，而不應當也不會限制權力要求書中所詳細描述的本發明。
1.選擇合適的化合物庫或合成新的化合物本實例化合物的來源，從美國範德比特大學(Vanderbilt University)化學生物所的高通量藥物篩選庫中獲取4000個不同結構的化合物，用DMSO將每種小分子化合物均配製成ImM的儲存液。
2.選擇觀察目的相關的轉基因斑馬魚品系本實例目的是觀察促進心肌細胞形成的小分子化合物，因此選擇帶有心肌標記基因的斑馬魚Tg(cmlc2:EGFP)品系(國際斑馬魚資源中心可購買)和Tg(cmlc2:DsRed-nuc)品系 (國際斑馬魚資源中心可購買)。
3.不同化合物濃度的選擇，選擇最佳濃度化合物本實例化合物庫中所選擇的濃度是ΙΟμΜ，因此在化合物處理胚胎前，先將每種化合物用胚胎培養液稀釋100倍成為ΙΟμΜ。
4.魚卵的選擇將用心臟標記的轉基因斑馬魚Tg(CmlC2:EGFP)純合體進行交配獲得胚胎，培養至50% 外包期(受精後5小時)。
5.化合物的處理過程將50%外包期(受精後5小時)的胚胎轉移至96孔板中，每孔中置入3枚胚胎，同時加入不同小分子化合物的胚胎培養液，在觀.5°C胚胎培養箱進行培養，其中DMSO作為空白對照組。具體過程如示意圖1。
6.觀察胚胎分別發育至M小時，48小時，72小時對胚胎心臟大小，心臟形態及心臟收縮性進行仔細的檢查，並且通過細胞核標記的轉基因斑馬魚Tg(CmlC2:DSRed-nuC)進行心肌細胞計數(圖2)。此外，還仔細檢查了胚胎的整體形態(比如背腹體軸和前後體軸等)及其它器官，包括大腦，眼睛，脊索和體節等是否受到影響。最後通過這些觀察結果來初步判定小分子化合物是否特異性的誘導心肌細胞的形成，以及這些小分子化合物是否對胚胎及其它器官有毒性作用。
以上所述僅是本發明的一個實例，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，例如化合物對其它臟器表型的影響等，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範疇。
權利要求
1. 一種用模式生物斑馬魚篩選誘導心肌細胞形成的藥物的方法，其特徵在於，具體步驟為(1)、對從藥物庫中取出的各種不同結構的小分子化合物，用二甲亞碸作為助溶劑，配成IrnM的儲存液；在表型篩選時，將每種化合物用胚胎培養液稀釋成1-30μΜ ；(2)、使心臟轉基因斑馬魚Tg(CmlC2:EGFP)純合體進行交配，獲得胚胎，培養至50%外包期；然後將胚胎轉移至培養板中，每孔置入適量胚胎，同時加入不同小分子化合物的胚胎培養液，在20-30°C胚胎培養箱進行培養；其中，二甲亞碸作為空白對照組；在胚胎發育的不同階段，對胚胎心臟大小和心臟形態進行仔細的檢查，並且通過細胞核標記的轉基因斑馬iTg(CmlC2:DSRed-nUC)進行心肌細胞計數；最後對實驗結果進行初步判定，分析各個小分子化合物對心肌細胞形成的影響；(3)、檢查胚胎的整體形態，及其它器官包括大腦，眼睛，脊索和體節等是否受到影響； 通過觀察結果分析判定各個小分子化合物是否對胚胎其它器官有毒性作用。
全文摘要
本發明屬於醫藥技術領域，具體為用模式生物斑馬魚篩選誘導心肌細胞形成的藥物的方法。本發明首先將25-30對Tg(cmlc2:EGFP)轉基因斑馬魚純合體進行交配獲得胚胎，然後將胚胎轉移到培養板中，每孔中加入適量已發育至50%外包期的斑馬魚胚胎，用含有1-30μM小分子化合物的胚胎培養液放置於培養箱進行培養；然後對胚胎心臟大小、心臟形態和心肌細胞數目進行仔細檢查；此外，還檢查胚胎的整體形態(比如背腹體軸和前後體軸等)及其它器官形成是否受到影響。最後通過這些實驗結果來初步判定這些小分子化合物是否促進心肌細胞的形成而不影響其它器官的發育。通過這種方法所篩選出來的新藥特異性強，毒副作用低。
文檔編號C12Q1/02GK102520130SQ201110403099
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者鍾濤 申請人:復旦大學