幾丁質結合蛋白Bt‑CBP及其編碼基因和製備方法與應用與流程
2023-10-28 06:57:22 1
本發明涉及一種來源於蘇雲金芽胞桿菌的幾丁質結合蛋白及其編碼基因和製備方法和應用，屬於基因工程技術領域。
背景技術：
幾丁質,俗稱甲殼素、甲殼質,是n-乙醯葡萄糖胺(glcnac)的多聚物,在自然界中，幾丁質是含量僅次於纖維素的生物高分子物質。幾丁質的降解主要是通過產幾丁質酶的微生物完成。
微生物幾丁質降解系統主要由內切幾丁質酶、外切幾丁質酶、乙酞己糖胺酶和與幾丁質結合蛋白等組成。其中幾丁質結合蛋白(chitin-bindingproteins，cbp)分散幾丁質糖鏈，內切幾丁質酶隨機切割多糖鏈，生成幾丁質寡糖；外切幾丁質酶沿糖鏈末端降解幾丁質，生成的幾丁二糖在β-n-乙醯己糖胺酶或殼二糖酶作用下生成單糖。其中幾丁質結合蛋白是一類能與幾丁質特異結合的蛋白質,能起到分散幾丁質糖鏈束的作用,對於不溶多糖降解起著決定性的作用，廣泛存在於各種微生物、動物和植物中。
蘇雲金芽胞桿菌(bacillusthuringiensis，簡稱bt)是目前世界上研究最深入、應用最成功的殺蟲細菌，已經廣泛用於農業、林業、貯藏以及衛生等多種害蟲的防治。它除了能產生殺蟲晶體蛋白之外，還能產生包括幾丁質酶、幾丁質結合蛋白在內的多種活性物質。但是目前人們對於蘇雲金芽胞桿菌幾丁質酶和幾丁質結合蛋白的認識還有限,這些因素對於蘇雲金芽胞桿菌及其幾丁質酶、幾丁質結合蛋白的應用造成限制。
技術實現要素：
本發明的目的是要解決蘇雲金芽胞桿菌殺蟲性能好，但抑制真菌病害能力較差的問題，提供一種來源於蘇雲金芽胞桿菌、具有高效抗病原真菌活性且製備方法簡單的幾丁質結合蛋白bt-bcp及其編碼基因和製備方法與應用。
技術方案：
一種幾丁質結合蛋白bt-cbp，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。其胺基酸序列如seqidno.2所示，由463個胺基酸組成。
幾丁質結合蛋白bt-cbp的製備方法，步驟如下：
(1)dna序列擴增：以蘇雲金芽胞桿菌atcc-35866菌株基因組為模板,以up1和dn1為上、下遊引物，用高保真transstartfastpfudnapolymeras進行pcr擴增；所述上遊引物1如seqidno.3所示，下遊引物dn1，如seqidno.4所示。所得擴增片段的序列如no.5所示。
(2)一步法構建大腸桿菌表達質粒：使用全式金的無縫連接試劑盒，將所得擴增片段與ncoi和xhoi酶切後的pet28a(+)線性片段，按5:1的比例混合於pcr管中，50℃反應15～30min，之後將重組產物直接用於轉化大腸桿菌dh5ɑ，通過菌落pcr、酶切篩選鑑定陽性轉化子克隆,得到重組表達質粒pet28(+)bt-cbp；
(3)構建大腸桿菌重組表達菌株：將重組表達質粒pet28(+)bt-cbp轉化至大腸桿菌bl21,挑選陽性轉化子克隆,得到重組表達菌株e.colibt-cbp；
(4)幾丁質結合蛋白bt-cbp的誘導表達：將重組表達菌株e.colibt-cbp接入含30μg/ml卡那黴素的lb培養基中,於37℃過夜培養活化後,然後按1％的接種量接種到含卡那黴素的lb培養基中,當od600達到0.6左右時，加入終濃度為1mm的iptg誘導劑,在25℃，180rpm條件下誘導培養8-12h；
(5)幾丁質結合蛋白bt-cbp的純化：將步驟(4)經誘導的菌液移入乾淨的離心管中，4℃，離心收集菌體,用緩衝液洗滌菌體,再用緩衝液重懸菌體之後置於冰上超聲破碎，破碎後的樣品於4℃下離心，收集上清即為粗蛋白；粗蛋白用鎳柱進行親和層析純化,得到幾丁質結合蛋白。
本發明同時提供了上述幾丁質結合蛋白在增強幾丁質酶酶活性中的應用。
本發明還提供了所述的幾丁質結合蛋白單獨或與幾丁質酶聯合使用，在防治真菌病害中的應用。所述的真菌病害為黃瓜灰黴病菌或尖孢鐮刀菌等真菌病害。
本發明的優點和積極效果：
本發明的積極效果是：
1.本發明首次從蘇雲金芽胞桿菌中克隆出幾丁質蛋白的編碼基因,通過構建原核表達載體獲得了具有高活性的表達產物,製備過程簡單,為幾丁質蛋白的後續研究提供了簡便方法。
2.本發明獲得的幾丁質結合蛋白bt-cbp可以提高几丁質酶btchib的酶活3.6倍。
3.本發明獲得的幾丁質結合蛋白bt-cbp本身對黃瓜灰黴病菌、尖孢鐮刀菌等植物病原真菌具有良好的抑制效果，還能顯著增強chib對黃瓜灰黴的抑制效果，具有良好的生物防治功能,為農業領域、抗真菌藥物研發的提供新的研究方向，具有廣闊應用價值，將產生巨大工業效益和經濟價值。
附圖說明：
圖1重組表達載體pet28a(+)bt-cbp的pcr驗證，1：dnamarker，2：ddh2o負對照，3：bt-cbp。
圖2重組表達載體pet28a(+)bt-cbp的酶切驗證，1：dnamarker，2：ncoi和xhoi雙酶切處理的pet28a(+)bt-cbp。
圖3sds-page檢測純化的bt-cbp蛋白，1：誘導表達後的e.colibl21bt-cbp細胞破碎上清，2：蛋白分子量marker，3：經鎳柱純化的bt-cbp蛋白。
圖4glcnac標準曲線
圖5bt-cbp對bt幾丁質酶chib降解幾丁質的增效作用，bt-cbp：200μlbt-cbp(150μg/ml)，chib：200μlchib(20μg/ml)，chib+bt-cbp：100μlchib(40μg/ml)+100μlbt-cbp(40μg/ml)。
圖6bt-cbp增強bt幾丁質酶chib抑制黃瓜灰黴的作用,1:180μlbt-cbp(150μg/ml)+20μl黃瓜灰黴孢子懸液(1x106孢子/ml),2:180μl20mm的tris-hcl(ph7.2)緩衝液+20μl黃瓜灰黴孢子懸液(1x106孢子/ml),3:180μlchib(20μg/ml)+20μl黃瓜灰黴孢子懸液(1x106孢子/ml),4:90μlbt-cbp(40μg/ml)+90μlchib(40μg/ml)+20μl黃瓜灰黴孢子懸液(1x106孢子/ml)。
具體實施方式：
實施例1、幾丁質結合蛋白bt-cbp的表達與純化
本發明首先以蘇雲金芽胞桿菌atcc-35866的基因組為模板，以up1和dn1為上、下遊引物，用全式金的高保真transstartfastpfudnapolymerase擴增bt-cbp基因序列。然後，使用全式金的無縫連接試劑盒，將擴增後的片段與ncoi和xhoi酶切後的pet-28a(+)線性片段，按5:1的比例混合於pcr管中，一步法構建重組表達質粒。將重組表達質粒轉化至大腸桿菌dh5ɑ，驗證正確後，提取重組表達質粒pet28(+)bt-cbp轉化至大腸桿菌bl21,得到重組表達菌株e.colibt-cbp。經過培養，iptg誘導劑,超聲破碎，離心收集上清即為粗蛋白。粗蛋白用鎳柱進行親和層析純化,得到幾丁質結合蛋白。具體實施方式如下：
(1)bt-cbp基因序列的擴增(見圖2)
本發明首先以蘇雲金芽胞桿菌atcc-35866的基因組為模板，以up1(seqidno.3)和dn1(seqidno.4)為上、下遊引物，用全式金公司的高保真transstartfastpfudnapolymerase擴增bt-cbp基因序列，獲得1411bp的bt-cbp核酸片斷，其序列見(seqidno.5)；
pcr擴增體系如下：
pcr程序：
94℃預變性2min；94℃變性20s，50℃復性20s，72℃延伸1min，每個循環降低1℃，循環5次；然後，94℃變性20s，50℃復性20s，72℃延伸1min，循環25次，共計30個循環；72℃延伸5min。
擴增後片段使用pcr產物純化回收試劑盒進行純化回收，電泳檢測是否有目的條帶及條帶大小，進行下一步實驗或保存於-20℃。
(2)一步法構建大腸桿菌表達質粒
先將質粒pet-28a(+)用限制性內切酶ncoi和xhoi消化成線性片段，酶切體系如下：
37℃反應8h後，用pcr產物純化試劑盒進行回收，電泳檢測酶切結果，進行下一步實驗或保存於-20℃。
使用全式金公司的無縫連接試劑盒，將步驟(1)擴增後片段與ncoi和xhoi酶切後的pet-28a(+)線性片段按5:1的比例混合於pcr管中，反應體系如下：
50℃反應15min。從-80℃冰箱裡取出100μl大腸桿菌dh5α感受態細胞於冰上化凍；在超淨工作檯中向感受態裡加入10μl連接產物，輕輕混勻，冰浴45min；將離心管平穩地放入42℃水浴熱激90s，再立即冰浴3～5min；而後在超淨工作檯中向其中加入2倍體積預冷的lb液體培養基，37℃，180rpm恢復培養60min；6000rpm離心1min，留下約200μl液體將菌體重懸，塗布於含卡那黴素的抗性平板，37℃培養24h以上。最後通過pcr、酶切篩選鑑定陽性轉化子克隆,得到重組表達質粒pet28a(+)bt-cbp(見圖1，2)。
(3)構建大腸桿菌重組表達菌株
重組表達載體質粒轉化至大腸桿菌bl21,挑選陽性轉化子克隆,得到重組表達菌株e.colibt-cbp。
(4)幾丁質結合蛋白bt-cbp的誘導表達和純化
將重組表達菌株e.colibl21bt-cbp接入含30μg/ml卡那黴素的lb培養基中,於37℃過夜培養後,按1％的接種量接種到含卡那黴素的培養基中,當od600達到0.6左右時，加入終濃度為1mm的iptg誘導劑,在25℃，180rpm條件下誘導培養8-12h。
將經誘導的菌液移入乾淨的離心管中，4℃，1000rpm，離心20min，收集菌體,用緩衝液a(50mmnah2po4，300mmnacl，ph8.0)洗滌菌體三次,再用適量的緩衝液a重懸菌體(本實驗為100ml菌液所獲的沉澱用6ml緩衝液a重懸)，再按1％的比例加入100mm的pmsf蛋白酶抑制劑。將離心管置於冰浴中進行超聲波細胞破碎(超聲波條件：功率300w，工作5s，間隔7s，破碎50-100次，具體破碎次數可根據細胞破碎結果調節)。破碎後的樣品4℃，1200rpm，離心30min，收集到的上清即為粗蛋白。
粗蛋白用鎳柱進行親和層析純化,當平衡柱的緩衝液a流盡時，將粗蛋白液加入預處理好的鎳柱中，待結合10min後，調整流速為0.5-1ml/min(1ml柱床體積)，收集流出液，重複2-3次，使his標籤更好地與鎳柱結合。使用緩衝液a洗滌鎳柱4-5次，至a280吸光度達到基線水平；然後用含5mm咪唑的緩衝液a和含10mm咪唑的緩衝液a洗柱各一次，最終用3ml的緩衝液b(50mmnah2po4、300mmnacl、250mm咪唑，ph8.0)洗脫目的蛋白，收集a280蛋白峰洗脫液，超濾除鹽後，即為幾丁質結合蛋白。蛋白濃度測定採用考馬斯亮藍法，蛋白純度檢測採用sds-page法(見圖3)。
實施例2、幾丁質結合蛋白bt-cbp對bt幾丁質酶chib的增效作用
bt幾丁質酶chib的製備：
以蘇雲金芽胞桿菌atcc-35646的基因組為模板，以up2(seqidno.6)和dn2(seqidno.7)為上、下遊引物，用全式金公司的高保真transstartfastpfudnapolymerase擴增bt-chib基因序列，pcr擴增體系和程序與擴增bt-cbp基因的一致。獲得2056bp的bt-chib核酸片斷，其序列見(seqidno.8)。後續一步法構建大腸桿菌表達質粒pet28a(+)bt-chib、構建重組表達菌株e.coli(bt-chib)和重組表達菌株的誘導、破碎以及蛋白的純化都和幾丁質結合蛋白bt-cbp的製備方法一致，所得bt-chib的胺基酸序列見(seqidno.9)。
幾丁質酶活力的測定：
取200μl待試樣品，加入200μl含10％膠體幾丁質的磷酸鹽緩衝液(ph6.0)，50℃水浴1h。加入200μl1％naoh溶液終止反應，混勻後8000rpm離心10min；取上清400μl於新的離心管中，加入等體積的dns試劑溶液，混勻後沸水浴10min；以磷酸鹽緩衝液(ph6.0)作對照，測od535值。
一個酶活力單位定義為50℃、ph6.0條件下反應1min產生1μgn-乙醯-d-氨基葡萄糖(glcnac)所需要的酶量。酶活力測定結果均為3次以上實驗結果的平均值。
glcnac標準曲線的製作：
配置glcnac濃度為100～1000μg/ml的標準濃度樣本，取200μl標準濃度樣本，加入200μl含10％膠體幾丁質的磷酸鹽緩衝液(ph6.0)，50℃水浴1h。加入200μl1％naoh溶液終止反應，混勻後8000rpm離心10min；取上清400μl於新的離心管中，加入等體積的dns試劑溶液，混勻後沸水浴10min；以磷酸鹽緩衝液(ph6.0)作對照，測od535值，繪製標準曲線，見圖4。
經過幾丁質酶活測定，發現幾丁質結合蛋白bt-cbp(150μg/ml)也無明顯的酶活。但幾丁質結合蛋白bt-cbp就能顯著增強bt內切幾丁質酶chib的酶活，使chib的酶活提高了3.6倍。(見圖5)。
實施例3、幾丁質結合蛋白bt-cbp抗真菌作用
製備真菌孢子懸浮液：將供試的黃瓜灰黴菌botrytiscinerea,尖孢鐮刀菌fusariumoxysporum,小麥赤黴菌fusariumgraminearum,蘋果輪紋病菌physalosporapiricola接種於pda平板,28℃培養2～3d，用3～4ml無菌水將孢子洗下，真菌孢子懸液通過0.45μm孔徑濾膜除去菌絲，調整孢子濃度為1x105孢子/ml。
孢子萌發的檢測：將1000μg/ml/、800μg/ml、600μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml和50μg/ml的bt-cbp分別與孢子懸液等體積混合，對照組為蒸餾水與孢子懸液等體積混合。加入凹玻片中，用蓋玻片密封后，置於28℃，培養48h，用顯微鏡放大200倍，觀察10個不同的視野中孢子萌發的情況。計算半抑制濃度(ic50)，計算結果均為三次試驗取平均值。
結果表明幾丁質結合蛋白bt-cbp對黃瓜灰黴菌和尖孢鐮刀菌有較好的抑制作用，具有潛在的生物防治功能。(見表1)。
表1bt-cbp對4種真菌孢子萌發的半抑制濃度(ic50)
實施例4、幾丁質結合蛋白bt-cbp增強chib抑制黃瓜灰黴菌
將滅菌的牛津杯在酒精燈外焰加熱3-4s，趁熱放置在pda固體平板上。待牛津杯冷卻後，向其內加入1x106孢子/ml的黃瓜灰黴孢子懸浮液各20μl。然後在其中一個牛津杯中加入150μg/ml的幾丁質結合蛋白bt-cbp180μl，另一個中加入20μg/ml幾丁質酶chib180μl，第3個中加入40μg/ml的幾丁質結合蛋白bt-cbp90μl和40μg/ml幾丁質酶chib90μl。負對照為20μl的黃瓜灰黴孢子懸浮液中加入20mm的tris-hcl(ph7.2)緩衝液180μl，將平板置於25℃的恆溫培養箱內，培養3d後，觀察真菌生長情況。結果可見，幾丁質結合蛋白bt-cbp顯著增強chib抑制黃瓜灰黴菌的能力，見圖6。
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南開大學
幾丁質結合蛋白bt-cbp及其編碼基因和製備方法與應用
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