雷公藤甲素人工抗原及製備方法和多克隆抗體與流程

2023-10-28 07:11:27 1

本發明涉及免疫學領域，尤其是雷公藤甲素人工抗原及製備方法和多克隆抗體。
背景技術：
：蜂蜜具有抗菌、抗氧化、提高人體免疫力等多種生理功能，是食療並舉的農產品，深受人們的喜愛。蜂蜜質量和安全一直都受到社會各界的高度關注。我國的蜂蜜國家標準《食品安全國家標準蜂蜜》(gb14963-2011)中明確規定蜜蜂採集植物的花蜜、分泌物或蜜露應安全無毒，不得來源於雷公藤、博落回、狼毒有毒蜜源植物。雷公藤分布在我國長江以南及西南地區。蜜蜂在蜜源較少的情況下，會將雷公藤植物作為其蜜源，導致劇毒的雷公藤活性成分進入蜂蜜中。如人們誤食此類有毒蜂蜜，會引起中毒甚至死亡。關於蜂蜜中雷公藤活性成分的檢測方法報導較少，迫切需要開發新型、快速、靈敏的雷公藤活性成分檢測體系。技術實現要素：本發明的發明目的在於：針對上述存在的問題，提供一種雷公藤甲素人工抗原及製備方法和多克隆抗體，其中雷公藤甲素人工抗原和多克隆抗體了構成酶聯免疫檢測體系，對雷公藤甲素進行檢測，具有簡單、快速、靈敏的特點。本發明採用的技術方案如下：一種雷公藤甲素人工抗原，其由雷公藤甲素、對氨基苯甲酸以及載體蛋白偶聯而成。由於雷公藤甲素屬於小分子化合物，不能直接作為抗原免疫動物得到抗體，而與載體蛋白結合後，形成蛋白大分子，因而具有抗原的功能。對氨基苯甲酸其連接橋的作用，保證雷公藤甲素與載體蛋白的穩定連接。本發明較佳的實施例中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。當載體蛋白為牛血清白蛋白時，複合物為免疫抗原，用該抗原能製備雷公藤甲素多克隆抗體。當載體蛋白為卵清蛋白時，由於其比牛血清白蛋白具有更好的免疫原性，可用於篩選單克隆抗體細胞株。一種的雷公藤甲素人工抗原的製備方法，其包括：將對氨基苯甲酸重氮化；將重氮化的對氨基苯甲酸與雷公藤甲素偶聯，形成複合物；將所述複合物與載體蛋白偶聯，即得雷公藤甲素人工抗原。由於雷公藤鹼屬於小分子化合物，不能直接作為抗原免疫動物得到抗體，首先將對氨基苯甲酸重氮化後與雷公藤甲素偶聯，偶聯後引入羧基（—cooh），然後採用混合酸酐法將雷公藤甲素—對氨基苯甲酸與載體蛋白進行偶聯，從而形成穩定的雷公藤甲素—對氨基苯甲酸-載體蛋白複合物，即抗原。本發明較佳的實施例中，將雷公藤甲素—對氨基苯甲酸重氮化包括：將對氨基苯甲酸溶於酸鹽中，得到對氨基苯甲酸溶液，冰浴攪拌下加入nano2，低溫避光攪拌，加入苯胺至溶液變為深黃色。本發明較佳的實施例中，所述鹽酸的濃度為0.8-1.5mol/l，所述對氨基苯甲酸與所述nano2的質量之比為5-7：1。由於採取了上述技術方案，對氨基苯甲酸被重氮化，為其物雷公藤甲素的偶聯提供結構基礎。本發明較佳的實施例中，將重氮化的對氨基苯甲酸與雷公藤甲素偶聯包括：將雷公藤甲素全完溶於水中得到雷公藤甲素溶液，所述雷公藤甲素溶液與重氮化的對氨基苯甲酸混合，調節ph8-9，攪拌1-3h，離心取上清，分別加入催化量的三丁胺和氯甲酸異丁酯，低溫攪拌20-30min。本發明較佳的實施例中，所述雷公藤甲素與所述對氨基苯甲酸的質量之比為3-5:4-6。由於採取了上述技術方案，重氮化的對氨基苯甲酸與雷公藤甲素穩定偶聯，並在複合物中引入羧基，為複合物與載體蛋白的偶聯提供結構基礎。本發明較佳的實施例中，將所述複合物與載體蛋白偶聯包括：將牛血清白蛋白溶於pbs，得到牛血清白蛋白溶液，往所述牛血清白蛋白溶液中加入二甲基甲醯胺。本發明較佳的實施例中，所述牛血清白蛋白與所述雷公藤甲素的質量之比為15-20:1。由於採取了上述技術方案，複合物與牛血清白蛋白偶聯，形成穩定的雷公藤甲素—對氨基苯甲酸-牛血清白蛋白免疫抗原。一種雷公藤甲素多克隆抗體，其由上述的雷公藤甲素人工抗原免疫動物，並獲取動物的血清而得。需要說明的是，所述動物可以是小鼠，羊，兔，但絕不僅限與上述動物。綜上所述，由於採用了上述技術方案，本發明的有益效果是：將小分子化合物雷公藤甲素與載體蛋白偶聯，使其成為抗原，具有免疫原性，並用該抗原免疫動物得到雷公藤甲素多克隆抗體，抗原抗體結合構成酶聯免疫檢測體系，實現對雷公藤甲素的快速檢測，具有方便、靈敏度高的特點。附圖說明本發明將通過例子並參照附圖的方式說明，其中：圖1是各物質的紫外分光光度計檢測鑑定圖。圖2是偶聯牛血清白蛋白的sds-page檢測圖。圖3是多克隆抗體的westernblot分析圖。具體實施方式本說明書中公開的所有特徵，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特徵和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。本說明書（包括任何附加權利要求、摘要）中公開的任一特徵，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類似目的的替代特徵加以替換。即，除非特別敘述，每個特徵只是一系列等效或類似特徵中的一個例子而已。實施例1本實施例提供一種雷公藤甲素人工抗原及其製備方法。本方法中使用牛血清白蛋白作為載體蛋白，製備在一種免疫抗原。具體地：s1：稱取對氨基苯甲酸24mg，溶於3ml1mol/lhcl中，完全溶解後得到對氨基苯甲酸溶液，置於冰水浴中攪拌至內外溫度平衡。s2：稱取nano24mg，加水完全溶解後加入對氨基苯甲酸溶液，4℃下避光攪拌10min。s3：加入催化量的苯胺（2μl）至溶液變為深黃色，得到重氮化的對氨基苯甲酸溶液，保存備用。s4：稱取雷公藤甲素19.2mg，溶於3ml超純水中，超聲5min至完全溶解後，與重氮化的對氨基苯甲酸溶液混合，得到混合液。s5：調節混合液ph至8.5，磁力攪拌2h，離心取第一上清液。s6：向第一上清液中加入5μl三丁胺，3.8μl氯甲酸異丁酯，4℃下磁力攪拌25min，得到複合物。s7：稱取326.4mgbsa，溶解於5mlpbs（磷酸鹽緩衝液）中，完全溶解後冰水浴、磁力攪拌下加入5mldmf，得到bsa溶液。s8：將複合物加入bsa溶液，4℃下磁力攪拌過夜，離心取第二上清液。s9：第二上清液用0.01mol/lph7.4pbs透析一周，第1天每4h換介質一次，第2-4天沒8h換介質一次，然後每天換介質一次。s10：透析完成，取透析液，經冷凍乾燥後得到雷公藤甲素人工抗原，-20℃保存備用。實施例2本實施例提供一種雷公藤甲素人工抗原及其製備方法。本方法中使用牛血清白蛋白作為載體蛋白，製備在一種免疫抗原。具體地：s1：稱取對氨基苯甲酸22.5mg，溶於3ml0.8mol/lhcl中，完全溶解後得到對氨基苯甲酸溶液，置於冰水浴中攪拌至內外溫度平衡。s2：稱取nano24.5mg，加水完全溶解後加入對氨基苯甲酸溶液，4℃下避光攪拌10min。s3：加入催化量的苯胺（2μl）至溶液變為深黃色，得到重氮化的對氨基苯甲酸溶液，保存備用。s4：稱取雷公藤甲素11.25mg，溶於3ml超純水中，超聲5min至完全溶解後，與重氮化的對氨基苯甲酸溶液混合，得到混合液。s5：調節混合液ph至8，磁力攪拌1h，離心取第一上清液。s6：向第一上清液中加入5μl三丁胺，3.8μl氯甲酸異丁酯，4℃下磁力攪拌30min，得到複合物。s7：稱取225mgbsa，溶解於5mlpbs（磷酸鹽緩衝液）中，完全溶解後冰水浴、磁力攪拌下加入5mldmf，得到bsa溶液。s8：將複合物加入bsa溶液，4℃下磁力攪拌過夜，離心取第二上清液。s9：第二上清液用0.01mol/lph7.4pbs透析一周，第1天每4h換介質一次，第2-4天沒8h換介質一次，然後每天換介質一次。s10：透析完成，取透析液，經冷凍乾燥後得到雷公藤甲素人工抗原，-20℃保存備用。實施例3本實施例提供一種雷公藤甲素人工抗原及其製備方法。本方法中使用牛血清白蛋白作為載體蛋白，製備在一種免疫抗原。具體地：s1：稱取對氨基苯甲酸25.5mg，溶於3ml1.5mol/lhcl中，完全溶解後得到對氨基苯甲酸溶液，置於冰水浴中攪拌至內外溫度平衡。s2：稱取nano23.65mg，加水完全溶解後加入對氨基苯甲酸溶液，4℃下避光攪拌10min。s3：加入催化量的苯胺（2μl）至溶液變為深黃色，得到重氮化的對氨基苯甲酸溶液，保存備用。s4：稱取雷公藤甲素31.88mg，溶於3ml超純水中，超聲5min至完全溶解後，與重氮化的對氨基苯甲酸溶液混合，得到混合液。s5：調節混合液ph至9，磁力攪拌3h，離心取第一上清液。s6：向第一上清液中加入5μl三丁胺，3.8μl氯甲酸異丁酯，4℃下磁力攪拌25min，得到複合物。s7：稱取478mgbsa，溶解於5mlpbs（磷酸鹽緩衝液）中，完全溶解後冰水浴、磁力攪拌下加入5mldmf，得到bsa溶液。s8：將複合物加入bsa溶液，4℃下磁力攪拌過夜，離心取第二上清液。s9：第二上清液用0.01mol/lph7.4pbs透析一周，第1天每4h換介質一次，第2-4天沒8h換介質一次，然後每天換介質一次。s10：透析完成，取透析液，經冷凍乾燥後得到雷公藤甲素人工抗原，-20℃保存備用。實施例4本實施例提供一種雷公藤甲素人工抗原及其製備方法。本方法中使用卵清蛋白作為載體蛋白，製備在一種包被抗原。具體地：s1：稱取對氨基苯甲酸24mg，溶於3ml1.2mol/lhcl中，完全溶解後得到對氨基苯甲酸溶液，置於冰水浴中攪拌至內外溫度平衡。s2：稱取nano24mg，加水完全溶解後加入對氨基苯甲酸溶液，4℃下避光攪拌10min。s3：加入少量苯胺（2μl）至溶液變為深黃色，得到重氮化的對氨基苯甲酸溶液，保存備用。s4：稱取雷公藤甲素24mg，溶於3ml超純水中，超聲5min至完全溶解後，與重氮化的對氨基苯甲酸溶液混合，得到混合液。s5：調節混合液ph至8.5，磁力攪拌2h，離心取第一上清液。s6：向第一上清液中加入5μl三丁胺，3.8μl氯甲酸異丁酯，4℃下磁力攪拌27min，得到複合物。s7：稱取432mg卵清蛋白，溶解於5mlpbs（磷酸鹽緩衝液）中，完全溶解後冰水浴、磁力攪拌下加入5mldmf，得到卵清蛋白溶液。s8：將複合物加入bsa溶液，4℃下磁力攪拌過夜，離心取第二上清液。s9：第二上清液用0.01mol/lph7.4pbs透析一周，第1天每4h換介質一次，第2-4天沒8h換介質一次，然後每天換介質一次。s10：透析完成，取透析液，經冷凍乾燥後得到雷公藤甲素人工抗原，-20℃保存備用。實施例5本實施例提供免疫抗原的鑑定，其目的是確定雷公藤甲素與牛血清白蛋白成功偶聯。受試抗原為實施例1提供的免疫抗原。其包括：實驗方法：1.紫外掃描鑑定分別稱取雷公藤甲素、對氨基苯甲酸、牛血清白蛋白以及實施例1提供的免疫抗原，配製成5mg/ml的溶液，在200-600nm波長範圍內進行掃描，分別確定其特徵吸收峰。實驗結果如附圖1所示。圖1中，p表示雷公藤素，bsa表示牛血清白蛋白，paba表示對氨基苯甲酸。由圖1可知，雷公藤甲素在270nm以及345nm左右分別有個吸收峰，bsa在285nm左右有吸收峰，對氨基苯甲酸在270你們左右有吸收峰，雷公藤甲素—對氨基苯甲酸-牛血清白蛋白只在285nm左右有吸收峰，即牛血清白蛋白的吸收峰，說明三者成功偶聯，只出現大分子的吸收峰。2.sds-page凝膠電泳鑑定實驗方法：s1：配製12%分離膠，灌膠後液封，凝固後倒掉液體，並用濾紙吸乾。s2：配製5%濃縮膠，灌膠後插入膠梳，靜止30min。s3：牛血清白蛋白以及實施例1提供的免疫抗原，配製成5mg/ml的溶液，分別與2×sds-樣品緩衝液等體積混合，100℃水浴加熱3-5分鐘得到樣品。s4：將制好的凝膠平板裝進垂直平板電泳槽，下槽放進sds-電極緩衝液。拔出膠梳，取各樣品以及蛋白maker各20μl加入到樣品槽中，加入sds-電極緩衝液，開始電泳。開始時電流為10ma左右；待樣品進入分離膠後，改為20~30ma；當燃料前沿距矽膠框底邊1.5cm時，停止電泳，關閉電源。s5：電泳結束後，取出凝膠。將凝膠浸泡於染色液中，染色4h，然後進行脫色液脫色，數小時換一次脫色液，直至背景無色。實驗結果如圖2所示。圖2中，bsa表示牛血清白蛋白，p+p+b表示雷公藤甲素—對氨基苯甲酸-牛血清白蛋白免疫抗原。p+p+b欄出現與bsa欄條帶相近的條帶，進一步說明雷公藤甲素與牛血清白蛋白成功偶聯。實施例6本實施例提供一種雷公藤甲素多克隆抗體，該雷公藤甲素多克隆抗體有實施例1提供的免疫抗原免疫小鼠而得。並用elisa檢測其效價，westernblot檢測了其特異性。具體地：用免疫抗原免疫8周齡balb/c系小鼠。三免後，將小鼠斷尾採血分離血清，用間接elisa法和間接競爭elisa法篩選血清效價高且特異性強的陽性鼠，得到多克隆抗體。elisa檢測：s1：酶標板中加入適量的純化後的重組蛋白，作為底物。s2：向酶標板每孔中分別加入100-150μl的包被液，置於4℃包被過夜（或37℃2-3小時）。s3：用pbst液清洗3-5次。s4：向酶標板每孔中加入150-200ul的3-5%的bsa稀釋液，37℃下孵育1-2小時。s5：pbst清洗3-5次。s6：加入不同稀釋度的多克隆抗血清（1:500、1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:20000、1:24000、1:36000），每孔150-200μl。s7：對照中加入150-200μl的陰性血清。s8：置於37℃下孵育2-3小時。s9：pbst清洗3-5次。s10：按1:1向酶標板中加入hrp標記的羊抗鼠（1:5000/1：10000）溶液，37℃孵育1-2小時。s11：pbst清洗3-5次。s12：每孔加入100-150μltmb顯色液，37℃避光反應30-45分鐘。s13：每孔加入100-150μl、2mol/lh2so4，終止反應。s14：酶標儀測定d（490nm）值。elisa檢測結果如表1所示：表1多克隆抗體效價的elisa檢測結果陽性血清1:5001:10001:20001:50001:100001:20000陰性血清d（490nm）0.9790.8520.7300.6510.3390.1150.054由表1可知，以陽性血清的od值大於陰性對照od值的2倍為標準，此血清樣本的抗體效價為1:20000。westernblot檢測：實驗方法：s1：將純化後的重組蛋白進行sds-page，電泳結束後取出膠塊浸於膜轉印緩衝液中。s2：剪取與膠塊差不多大小的pvde膜，在甲醇中浸泡1-2分鐘後用超純水洗淨，置於膜轉印緩衝液中。s3：從下到上將膜轉印緩衝液浸泡過得海綿、pvdf膜、page膜、海綿依次疊放在轉膜儀中。s4：接通電源，恆壓轉膜30-35分鐘。s5：將轉印好的pvdf膜置於4-6%的脫脂奶粉封閉液中4℃搖床封閉過夜。s6：棄封閉液，用tbst液室溫搖床清洗pvdf膜3-5次，每次10-15分鐘。s7：用製備的多克隆抗血清室溫搖床孵育pvdf膜3-3.5小時。s8：tbst清洗。s9：用鹼性磷酸酶標記過得羊抗鼠抗體稀釋後室溫孵育pvdf膜約1-2小時。s10：tbst清洗。s11：放入tmb顯色液中顯色、觀察。westernblot檢測結果如圖3所示，圖3中m泳道為marker，1泳道為多克隆抗體，由圖3可知，多克隆抗體特異性良好。本發明並不局限於前述的具體實施方式。本發明擴展到任何在本說明書中披露的新特徵或任何新的組合，以及披露的任一新的方法或過程的步驟或任何新的組合。當前第1頁12