N-羥基琥珀醯亞胺用於改善綴合物的穩定性的用途

2023-10-09 08:17:44 2

N-羥基琥珀醯亞胺用於改善綴合物的穩定性的用途
【專利摘要】本發明提供了用於在外源NHS存在的情況下產生具有改善的穩定性的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的方法。在一些實施方案中，本發明的方法包括添加一定摩爾比的相對於在修飾反應過程中作為雙官能接頭的水解/氨解的結果產生的NHS量的外源NHS。
【專利說明】N-羥基琥珀醯亞胺用於改善綴合物的穩定性的用途
[0001] 交叉參考相關申請
[0002] 本專利申請要求2011年12月13提交的美國臨時專利申請No. 61/570, 139的利 益，將所述美國臨時專利申請通過引用併入本文。
[0003] 發明背景
[0004] 對癌症和其它疾病的治療是有用的抗體-藥物綴合物通常由三個不同的元件組 成：細胞結合劑、接頭和細胞毒素劑。常用製劑方法之一包括修飾步驟，其中將細胞結合劑 與雙官能接頭反應以形成共價地連接於具有反應性基團的接頭的細胞結合劑；純化步驟， 其中將修飾抗體從修飾反應的組分純化出來；綴合步驟，其中將修飾細胞結合劑與細胞毒 素劑反應以從接頭（使用反應性基團）至細胞毒素劑形成共價化學價；和第二純化步驟，其 中將綴合物從綴合反應的其它組分純化出來。
[0005] 儘管在製備抗體-藥物綴合物上取得了進展，但目前的方法受到幾個因素限制。 例如，雙官能交聯劑對抗體的結合在本領域中目前使用的條件下是異質的，這導致包含穩 定的醯胺鍵和不穩定的酯鍵的綴合物。據認為綴合物中不穩定酯鍵的存在導致藥物從綴合 物釋放和綴合物的不穩定性。
[0006] 最近的臨床試驗已顯示抗體-藥物綴合物在治療許多不同類型的癌症中的有前 景的作用。因此，存在對改進的製備更穩定的並且比由目前的方法產生的抗體-藥物綴合 物更純的抗體-藥物綴合物的方法的需要。本發明提供了這樣的方法。本發明的這些和其 它有利方面以及另外的發明特徵根據本文中提供的本發明的描述將變得顯然。
[0007] 發明概述
[0008] 本發明提供了用於在外源N-羥基琥珀醯亞胺（NHS)存在的情況下製造具有改善 的穩定性的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的方法。
[0009] 發明詳述
[0010] 本領域技術人員將理解，包含化學地偶聯於細胞毒素劑的抗體的綴合物（"抗 體-細胞毒素劑綴合物"）通常如下進行製備：利用雙官能交聯試劑（通常利用交聯試劑上 的N-羥基琥珀醯亞胺（NHS)反應基團）修飾抗體，純化具有連接於其的接頭的抗體，將細 胞毒素劑綴合於具有連接於其的接頭的抗體，和純化抗體-細胞毒素劑綴合物。本發明通 過使穩定地鍵合於細胞結合劑的接頭的量減少至最少和使導致綴合物不穩定性的不期望 的副反應降至最低來改進這樣的方法。
[0011] 作為雙官能接頭（例如，SPP、STOB、SMCC)的水解/氨解的結果，在修飾反應過程 中產生少量NHS。NHS目前被本領域技術人員當作修飾反應的不期望的（或至少中性）副 產物。因此，目前的方法通常包括在添加細胞毒素劑之前純化修飾抗體，這導致在綴合反應 之前NHS的除去。
[0012] 令人驚訝地發現，在外源NHS存在的情況下製備抗體-細胞毒素劑綴合物導致綴 合物的穩定性的顯著增加，如通過游離類美登素的釋放測量的。因此，本發明提供了用於在 外源NHS存在的情況下製造具有改善的穩定性的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的方法。
[0013] 本發明提供了用於製備細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括添 加外源NHS。如本文中所用，"外源NHS"是指在方法過程中從外部來源添加的NHS，並且不 是指在修飾反應過程中作為雙官能接頭的水解/氨解的結果產生的NHS。
[0014] 在一個實施方案中，本發明提供了用於製備細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的 方法,所述方法包括添加約0. ImM至約300mM的外源NHS。例如，本發明的方法包括添加 約 0· ImM、約 0· 2mM、約 0· 3mM、約 0· 4mM、約 0· 5mM、約 0· 6mM、約 0· 7mM、約 0· 8mM、約 0· 9mM、 約 L OmM、約 L ImM、約 L 3mM、約 L 5mM、約 L 7mM、約 L 9mM、約 2. OmM、約 2. ImM、約 2. 3mM、 約 2. 5mM、約 2. 7mM、約 2. 9mM、約 3. OmM、約 3. ImM、約 3. 3mM、約 3. 5mM、約 3. 7mM、約 3. 9mM、 約 4. OmM、約 4. ImM、約 4. 3mM、約 4. 5mM、約 4. 7mM、約 4. 9mM、約 5. OmM、約 5. ImM、約 5. 3mM、 約 5. 5mM、約 5. 7mM、約 5. 9mM、約 6. OmM、約 6. ImM、約 6. 3mM、約 6. 5mM、約 6. 7mM、約 6. 9mM、 約 7. OmM、約 7. ImM、約 7. 3mM、約 7. 5mM、約 7. 7mM、約 7. 9mM、約 8. OmM、約 8. ImM、約 8. 3mM、 約 8. 5mM、約 8. 7mM、約 8. 9mM、約 9. OmM、約 9. ImM、約 9. 3mM、約 9. 5mM、約 9. 7mM、約 9. 9mM、 約 10mM、約 llmM、約 12mM、約 13mM、約 14mM、約 15mM、約 16mM、約 17mM、約 18mM、約 19mM、 約 20mM、約 25mM、約 30mM、約 35mM、約 40mM、約 45mM、約 50mM、約 55mM、約 60mM、約 65mM、約 70mM、約 75mM、約 80mM、約 85mM、約 90mM、約 95mM、約 lOOmM、約 llOmM、約 120mM、約 130mM、 約 140mM、約 150mM、約 160mM、約 170mM、約 180mM、約 190mM、約 200mM、約 210mM、約 220mM、 約 230mM、約 240mM、約 250mM、約 260mM、約 270mM、約 280mM、約 290mM 或約 300mM 外源 NHS。 在一個實施方案中，本發明的方法包括添加約〇. ImM至約5mM、約0. ImM至約10mM、約1. OmM 至約5mM、約1. OmM至約10mM、約5. OmM至約10mM、約10mM至約20mM、約20mM至約30mM、 約30mM至約40mM、約40mM至約50mM、約50mM至約60mM、約60mM至約70mM、約70mM至約 80mM、約 80mM 至約 90mM、約 90mM 至約 100mM、約 100mM 至約 llOmM、約 llOmM 至約 120mM、約 120mM 至約 130mM、約 130mM 至約 140mM、約 140mM 至約 150mM、約 150mM 至約 160mM、約 160mM 至約 170mM、約 170mM 至約 180mM、約 180mM 至約 190mM、約 190mM 至約 200mM、約 200mM 至 約 220mM、約 220mM 至約 240mM、約 240mM 至約 260mM、約 260mM 至約 280mM 或約 280mM 至約 300mM外源NHS。在另一個實施方案中，本發明的方法包括添加約10mM至約200mM、約20至 約150mM、約50至約150mM或約20至約100mM外源NHS。
[0015] 在一些實施方案中，本發明的方法包括添加相對於作為雙官能接頭的水解/氨解 的結果在修飾反應過程中產生的NHS的量的一定摩爾比的外源NHS。本領域技術人員可測 定在特定修飾過程中產生的NHS的量，因為產生的NHS的量基本上與使用的雙官能接頭的 量相等。本領域技術人員隨後可向反應混合物中添加相對於在修飾反應中產生的NHS的量 的一定摩爾比的外源NHS。在一個實施方案中，相對於在修飾反應過程中產生的NHS的量添 加約2至約200倍的外源NHS。例如，本發明的方法包括添加相對於在修飾反應中產生的 NHS的量約2倍、約5倍、約10倍、約15倍、約20倍、約25倍、約50倍、約100倍、或約200 倍的外源NHS。
[0016] 在一些實施方案中，本發明的方法包括添加相對於雙官能接頭的量的一定摩爾 比的外源NHS。在一個實施方案中，外源NHS對雙官能交聯試劑的摩爾比為約0. 5至約 1000(例如，約1至約900、約5至約750、約50至約500、約100至約500、約0. 5至約500 或約100至約1000)。例如，本發明的方法包含相對於雙官能接頭的量約0. 5倍、約1倍、約 2倍、約5、約10倍、約15、約20倍、約25、約50倍、約100倍、約200倍、約300倍、約400 倍、約500倍、約600倍、約700倍、約800倍、約900或約1000倍的NHS。
[0017] 已描述了許多用於製備細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的方法（參見，例如， 美國臨時專利申請No. 61/468, 997、美國專利5, 208, 020、美國專利6, 441，163、美國專利 7, 811，572、美國專利申請公布No. 2006/0182750、美國專利申請公布No. 2008/0145374、美 國專利申請公布No. 2011/0003969和美國專利申請公布No. 2012/0253021)。本 申請人:已 令人驚訝地發現在用於製備細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的方法的過程中在任意點上 外源NHS的添加對綴合物穩定性具有有益效應。因此，本發明的方法包括在製備細胞結合 劑-細胞毒素劑綴合物的方法的過程中在任意點上添加外源NHS。例如，本發明的方法包 括將外源NHS添加至修飾步驟（即，其中將細胞結合劑與雙官能接頭反應的步驟）、綴合步 驟（即，其中將修飾細胞結合劑與細胞毒素劑反應的步驟）、純化步驟或在前述步驟的任何 步驟之間的保持步驟。在一個實施方案中，本發明的方法包括將外源NHS添加至修飾步驟 (即，將NHS添加至修飾反應）、修飾步驟與純化步驟之間的保持步驟、修飾步驟與綴合步驟 之間的保持步驟、純化步驟、綴合步驟、綴合步驟與純化步驟之間的保持步驟和/或兩個純 化步驟之間的保持步驟。
[0018] 在一個實施方案中，本發明提供了用於製備具有連接於其的接頭的細胞結合劑 的方法，所述方法包括在外源NHS存在的情況下將細胞結合劑與雙官能交聯試劑反應，以 將接頭共價地連接於細胞結合劑，從而製備包含具有連接於其的接頭的細胞結合劑的混合 物。
[0019] 根據本發明的方法，將細胞結合劑與雙官能交聯試劑（即，修飾反應）接觸產生包 含具有連接於其的細胞結合劑以及反應物和其它副產物的第一混合物。在本發明的一些實 施中，第一混合物包含具有穩定和不穩定地鍵合於其的接頭的細胞結合劑以及反應物和其 它副產物。當接頭與細胞結合劑之間的共價鍵在正常貯存條件下在一段時期（所述時期可 從數月變化至數年）內未被顯著削弱或斷裂時，接頭被"穩定地"鍵合於細胞結合劑。相反 地，當接頭與細胞結合劑之間的共價鍵在正常貯存條件下在一段時期（所述時期可從數月 變化至數年）內被顯著削弱或斷裂，則接頭被"不穩定地"鍵合於細胞結合劑。
[0020] 修飾反應優選在約4至約pH9的pH (例如，約4. 5至約8. 5、約5至約8、約5. 5至 約7. 5、約6至約7、約6至約8、約6至約9或約6. 5至約7. 5的pH)下進行。在一些實施 方案中，修飾反應在約6至約8的pH(例如，約6、約6. 5、約7、約7. 5或約8的pH)下進行。
[0021] 在本發明的一個實施方案中，修飾細胞結合劑從反應和副產物的純化通過將第一 混合物經歷純化法來進行。在這一點上，第一混合物可使用切向流過濾（TFF)例如基於膜 的切向流過濾法、非吸附色譜、吸附色譜、吸附過濾或選擇性沉澱或任何其它適當的純化法 以及其組合來進行純化。該第一純化步驟提供了純化的第一混合物，即相較於在根據本發 明的純化之前的第一混合物增加的具有連接於其的接頭的細胞結合劑的濃度和減少的未 鍵結合的雙官能交聯試劑的量。優選地，第一混合物使用切向流過濾來進行純化。
[0022] 在純化第一混合物以獲得具有連接於其的接頭的細胞結合劑的純化的第一混合 物後，通過將具有連接於其的接頭的細胞結合劑與細胞毒素劑在具有約4至約9的pH的溶 液中反應來將細胞毒素劑綴合於第一純化的混合物中的具有連接於其的接頭的細胞結合 齊U，從而形成第二混合物，其中產生包含（i)通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結 合劑、（ii)游離細胞毒素劑和（iii)反應副產物的第二混合物。
[0023] 任選地，可省略修飾細胞結合劑的純化。因此，在本發明的一個實施方案中，未將 包含具有連接於其的細胞結合劑以及反應物和其它副產物的第一混合物經歷純化法。在這 樣的情況下，可將細胞毒素劑與交聯試劑同時添加，或可一些更晚的點，例如在將交聯試劑 添加至細胞結合劑後1、2、3或更多個小時添加細胞毒素劑。通過將修飾細胞結合劑與細胞 毒素劑在具有約4至約9的pH的溶液中反應來將修飾細胞結合劑綴合於細胞毒素劑（例 如，類美登素），其中綴合步驟導致穩定的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物、非穩定的細胞 結合劑-細胞毒素劑綴合物、非綴合細胞毒素劑（即，"游離"細胞毒素劑）、反應物和副產 物的混合物的形成。
[0024] 綴合反應優選在約4至約pH9的pH(例如，約4. 5至約8. 5、約5至約8、約5. 5至 約7. 5、約6. 0至約7或約6. 5至約7. 5的pH)下進行。在一些實施方案中，綴合反應在約 6 至約 6. 5 的 pH(例如，5. 5 至 7 的 ρΗ、5· 7 至 6. 8 的 ρΗ、5· 8 至 6. 7 的 ρΗ、5· 9 至 6. 6 的 pH 或6至6. 5的pH、）、約6或更低的pH(例如，約4至6、約4至約5. 5、約5至6的pH)或約 6. 5或更高的pH(例如，6. 5至約9、約6. 5至約7、約7至約9、約7. 5至約9或6. 5至約8 的pH)下進行。在一個實施方案中，綴合反應在約4的pH至低於6的pH下或在高於6. 5 至9的pH下進行。當綴合步驟在約6. 5或更高的pH下進行時，一些含巰基細胞毒素劑可 易於通過二硫鍵形成二聚化。在一個實施方案中，可能需要從反應混合物除去痕量金屬和 /或氧以及任選地添加抗氧化劑或使用具有更具反應性的離去基團的接頭或以超過一個等 分添加細胞毒素劑來使得在這樣的情況下能夠進行高效反應。
[0025] 本發明的方法可任選地包括將蔗糖添加至用於本發明的方法的綴合步驟，以增加 細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的穩定性和回收。令人想要地，以約〇. 1% (w/v)至約20% (w/v)(例如，約 0.1% (w/v)、l% (w/v)、5% (w/v)、10% (w/v)、15% (w/v)或 20% (w/v)) 的濃度添加鹿糖。優選地，以約1% (w/v)至10% (w/v)(例如，（例如，約0. 5% (w/v)、約 1% (w/v)、約 1.5% (w/v)、約 2% (w/v)、約 3% (w/v)、約 4% (w/v)、約 5% (w/v)、約 6% (w/v)、約 7 % (w/v)、約 8 % (w/v)、約 9 % (w/v)、約 10 % (w/v)或約 11 % (w/v))的濃度 添加蔗糖。此外，綴合反應還可包括緩衝劑的添加。可使用本領域已知的任何適當的緩衝 齊[J。適當的緩衝劑包括例如檸檬酸鹽緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑、琥珀酸鹽緩衝劑和磷酸鹽緩衝 齊U。在優選實施方案中，緩衝劑選自HEPPSO (N- (2-羥乙基）哌嗪-Ν' - (2-羥基丙磺酸））、 P0PS0 (哌嗪-1，4-雙-(2-羥基-丙烷-磺酸）脫水物）、HEPES (4- (2-羥乙基）哌嗪-1-乙 磺酸）、HEPPS(EPPS) (4-(2-羥乙基）哌嗪-1-丙磺酸）、TES(N-[三（羥甲基）甲基]-2-氨 基乙磺酸）及其組合。
[0026] 在綴合步驟後，將綴合物經歷純化步驟。在這一點上，綴合混合物可使用切向流過 濾（TFF)例如基於膜的切向流過濾法、非吸附色譜、吸附色譜、吸附過濾或選擇性沉澱或任 何其它適當純化法以及其組合來純化。本領域技術人員將理解，綴合步驟後的純化使得能 夠分離包含化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的穩定的綴合物。
[0027] 在一個實施方案中，本發明提供了用於製備包含化學地偶聯於細胞毒素劑的細 胞結合劑的綴合物的方法，所述方法包括在修飾步驟後的第一純化步驟和在第綴合步驟 後的第二純化步驟，其中方法包括外源NHS。可在本發明的方法過程中的任意點上添加外 源NHS(即，至修飾步驟、至綴合步驟、至純化步驟或至上述步驟的任一個之間的的保持步 驟）。例如，在一個實施方案中，本發明提供了用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒 素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括（a)將細胞結 合劑與雙官能交聯試劑接觸，以將接頭共價地連接於細胞結合劑，從而製備包含具有連接 於其的接頭的細胞結合劑的第一混合物，（b)將第一混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、 非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，從而製備具有連接於其的接頭的細胞結合劑的 純化的第一混合物，（c)通過將具有連接於其的接頭的細胞結合劑與細胞毒素劑反應來將 細胞毒素劑綴合於純化的第一混合物中的具有連接於其的接頭的細胞結合劑，從而製備包 含（i)含有通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴 合物、（ii)游離細胞毒素劑和（iii)反應副產物的第二混合物，和（d)將第二混合物經歷 切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合以將細胞結合劑-細 胞毒素劑綴合物從第二混合物的其它組分純化出來，從而製備細胞結合劑-細胞毒素劑 綴合物的純化的第二混合物，其中在步驟（a)期間或之後以及在步驟（c)之前添加外源 NHS (即，在外源NHS存在的情況下進行步驟步驟（a)中的接觸，所述方法包括在外源NHS存 在的情況下在步驟（a)之後保持混合物，在步驟（b)中添加外源NHS和/或方法包括在外源 NHS存在的情況下在步驟（b)之後保持第一混合物）。在另一個實施方案中，本發明提供了 用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素 劑綴合物的方法，方法包括：(a)將細胞結合劑與雙官能交聯試劑接觸以將接頭共價連接 於細胞結合劑，從而製備包含具有連接於其的接頭的細胞結合劑的第一混合物，（b)將第一 混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，從而製備 具有連接於其的接頭的細胞結合劑的純化的第一混合物，（c)通過將具有連接於其的接頭 的細胞結合劑與細胞毒素劑在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下反應來將細胞毒素劑 綴合於純化的第一混合物中的具有連接於其的接頭的細胞結合劑，從而製備包含（i)含有 通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物、（ii) 游離細胞毒素劑和（iii)反應副產物的第二混合物，和（d)將第二混合物經歷切向流過濾、 選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合以將細胞結合劑-細胞毒素劑綴合 物從第二混合物的其它組分純化出來，從而製備細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的 第二混合物。在另一個實施方案中，本發明提供了用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細 胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的方法，方法包括：(a)將細胞結 合劑與雙官能交聯試劑接觸以將接頭共價地連接於細胞結合劑，從而製備包含具有連接於 其的接頭的細胞結合劑的第一混合物，（b)將第一混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非 吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，從而製備具有連接於其的接頭的細胞結合劑的純 化的第一混合物，（c)通過將具有連接於其的接頭的細胞結合劑與細胞毒素劑反應來將細 胞毒素劑綴合於純化的第一混合物中的具有連接於其的接頭的細胞結合劑，從而製備包含 (i)含有通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合 物、（ii)游離細胞毒素劑和（iii)反應副產物的第二混合物，（d)在外源N-羥基琥珀醯亞 胺存在的情況下溫育第二混合物；和（e)在步驟（d)之後將第二混合物經歷切向流過濾、選 擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合以將細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物 從第二混合物的其它組分純化出來，從而製備通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結 合劑的純化的第二混合物。
[0028] 本文中描述的任何純化法可用於本發明的方法。在本發明的一個實施方案中，在 純化步驟中使用切向流過濾（TFF，也稱為交叉流過濾、超濾和滲濾）和/或吸附色譜樹脂。 例如，本發明的方法可包含在修飾步驟後使用TFF的第一純化步驟和在綴合步驟後使用 TFF的第二純化步驟。或者，本發明的方法可包括在修飾步驟後使用吸附色譜的第一純化步 驟和在綴合步驟後使用吸附色譜的第二純化步驟。本發明的方法還可包括在修飾步驟後使 用吸附色譜的第一純化步驟和在綴合步驟後使用TFF的第二純化步驟，或在修飾步驟後使 用TFF的第一純化步驟和在綴合步驟後使用吸附色譜的第二純化步驟。
[0029] 在本發明的一個實施方案中，將非吸附色譜用作純化步驟。例如，本發明的方法可 包括在修飾步驟後使用非吸附色譜的第二純化步驟和在綴合步驟後使用非吸附色譜的第 二純化步驟。
[0030] 在另一個實施方案中，本發明提供了用於製備包含化學地偶聯於細胞毒素劑的細 胞結合劑的綴合物的方法，其中在修飾反應後和在綴合反應前，未將包含具有連接於其的 接頭的細胞結合劑的第一混合物經歷，並且其中所述方法包括外源NHS。可在在本發明的 方法過程中的任意點上添加外源NHS(即，至修飾步驟、至綴合步驟、至純化步驟或至上述 步驟的任一個之間的保持步驟）。因此，在一個實施方案中，本發明提供了用於製備包含通 過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的方法， 所述方法包括：(a)將細胞結合劑與雙官能交聯試劑接觸以將接頭共價地連接於細胞結合 齊U，從而製備包含具有連接於其的接頭的細胞結合劑的第一混合物，（b)通過將具有連接於 其的接頭的細胞結合劑與細胞毒素劑反應來將細胞毒素劑綴合於第一混合物中的具有連 接於其的接頭的細胞結合劑，從而製備包含（i)含有通過接頭偶聯於細胞毒素劑的細胞結 合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物、（ii)游離細胞毒素劑和（iii)反應副產物的第二 混合物，和（c)將第二混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色 譜或其組合，以將細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從第二混合物的其它組分純化出來，從 而製備細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物，其中在步驟（a)的過程中或 之後和在步驟（b)之前添加外源N-羥基琥珀醯亞胺（S卩，在外源NHS存在的情況下進行步 驟（a)中的接觸和/或所述方法包括在外源NHS存在的情況下在步驟（a)之後保持第一混 合物）。在另一個實施方案中，本發明提供了用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒 素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括：(a)將細胞結 合劑與雙官能交聯試劑接觸以將接頭共價連接於細胞結合劑，從而製備包含具有連接於其 的接頭的細胞結合劑的第一混合物，（b)通過將具有連接於其的接頭的細胞結合劑與細胞 毒素劑在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下反應來將細胞毒素劑綴合於第一混合物中 的具有連接於其的接頭的細胞結合劑，從而製備包含（i)含有通過接頭偶聯於細胞毒素劑 的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物、（ii)游離細胞毒素劑和（iii)反應副產 物的第二混合物，和（c)將第二混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過 濾、吸附色譜或其組合，以將細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從第二混合物的其它組分純 化出來，從而製備細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。在另一個實施方 案中，本發明提供了用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的綴合 物的方法，所述方法包括：(a)將細胞結合劑與雙官能交聯試劑接觸以將接頭共價地連接 於細胞結合劑，從而製備包含具有連接於其的接頭的細胞結合劑的第一混合物，（b)通過將 具有連接於其的接頭的細胞結合劑與細胞毒素劑反應來將細胞毒素劑綴合於第一混合物 中的具有連接於其的接頭的細胞結合劑，從而製備包含（i)含有通過接頭化學地偶聯於細 胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物、（ii)游離細胞毒素劑和（iii) 反應副產物的第二混合物，（c)在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下溫育第二混合物； 和（d)將第二混合物在步驟（c)之後經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、 吸附色譜或其組合，以將細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從第二混合物的其它組分純化出 來，從而製備細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。本文中描述的任何純 化法可用作綴合反應後的純化步驟。在優選實施方案中，將切向流過濾、吸附色譜或非吸附 色譜用作綴合反應後的純化步驟。
[0031] 在另一個實施方案中，本發明提供了用於製備包含化學地偶聯於細胞毒素劑的細 胞結合劑的綴合物的方法，其中將修飾反應和綴合反應組合入單個步驟，隨後進行純化步 驟（如在美國臨時專利申請No. 61/468, 997和美國專利申請公布No. 2012/0253021中描述 的），並且其中方法包括外源NHS。可在本發明的方法過程中的任意點上添加外源NHS (即， 至組合修飾/綴合步驟、至純化步驟或至上述步驟之間的保持步驟）。因此，在一個實施方 案中，本發明提供了用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞 結合劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括：(a)將細胞結合劑與細胞毒素劑在外源 N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下接觸以形成包含細胞結合劑和細胞毒素劑的第一混合物， 隨後將第一混合物與包含接頭的雙官能交聯試劑在具有約4至約9的pH的溶液中接觸，以 提供包含（i)含有通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒 素劑綴合物、（ii)游離細胞毒素劑和（iii)反應副產物的第二混合物；和（b)將第二混合 物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，以將細胞結合 劑-細胞毒素劑綴合物從第二混合物的其它組分純化出來，從而製備細胞結合劑-細胞毒 素劑綴合物的純化的第二混合物。在另一個實施方案中，本發明提供了用於製備包含通過 接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所 述方法包括：(a)將細胞結合劑與細胞毒素劑接觸以形成包含細胞結合劑和細胞毒素劑的 第一混合物，隨後將第一混合物與包含接頭的雙官能交聯試劑在外源N-羥基琥珀醯亞胺 存在的情況下於具有約4至約9的pH的溶液中接觸，以提供包含（i)含有通過述接頭化 學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物、（ii)游離細胞毒 素劑和（iii)反應副產物的第二混合物；和（b)將第二混合物經歷切向流過濾、選擇性沉 澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，以將細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從第 二混合物的其它組分純化出來，從而製備細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的第二混 合物。在另一個實施方案中，本發明提供了用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒素 劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的方法，方法包括：(a)將細胞結合劑與 細胞毒素劑接觸以形成包含細胞結合劑和細胞毒素劑的第一混合物，隨後將第一混合物與 包含接頭的雙官能交聯試劑於具有約4至約9的pH的溶液中接觸，以提供包含（i)含有通 過述接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物、（ii) 游離細胞毒素劑和（iii)反應副產物的第二混合物；(b)在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的 情況下溫育第二混合物；和（c)將第二混合物在步驟（b)之後經歷切向流過濾、選擇性沉 澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，以將細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從第 二混合物的其它組分純化出來，從而製備細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的第二混 合物。在一個實施方案中，在將第一混合物與雙官能交聯試劑接觸後立即進行步驟（b)的 溫育（即，在組合修飾/綴合步驟後的保持步驟）。在一個實施方案中，方法包括將第二混合 物經歷步驟（a)與（b)之間的純化步驟，以將細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從第二混合 物的其它組分純化出來，從而在保持步驟之前（即，在步驟（b)之前）製備細胞結合劑-細 胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。本文中描述的任何純化法可用於本發明的方法。在 優選實施方案中，切向流過濾、吸附色譜或非吸附色譜用作純化步驟。
[0032] 在一個實施方案中，本發明提供了用於製備包含化學地偶聯於細胞毒素劑的細 胞結合劑的綴合物的方法，其中所述方法包括將預形成的細胞毒素劑-接頭化合物綴 合於細胞結合劑，如美國專利6, 441，163以及美國專利申請公布No. 2011/0003969和 2008/0145374中描述的，並且其中方法包括外源NHS。可在本發明的方法的過程中的任意 點上添加外源NHS(即，至綴合步驟、至純化步驟或上述步驟之間的保持步驟）。例如，在一 個實施方案中，本發明提供了用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合 劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括（a)將細胞結合劑與包含化學 地偶聯於接頭的細胞毒素劑的細胞毒素劑-接頭化合物接觸，以將細胞毒素劑-接頭化合 物共價地連接於細胞結合劑，從而製備包含含有通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞 結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的混合物和（b)將包含細胞結合劑-細胞毒素劑 綴合物的混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合， 以純化綴合物，其中在步驟（a)期間或之後和在步驟（b)之前添加外源N-羥基琥珀醯亞胺 (即，在外源NHS存在的情況下進行步驟（a)中的接觸或方法包括在外源NHS存在的情況下 在（a)之後保持混合物）。在另一個實施方案中，本發明提供了用於製備包含通過接頭化 學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所述方法 包括：(a)將細胞結合劑與包含化學地偶聯於接頭的細胞毒素劑的細胞毒素劑-接頭化合 物接觸，以將細胞毒素劑-接頭化合物共價地連接於細胞結合劑，從而製備包含含有通過 接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的混合物； (b)在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下溫育步驟（a)的混合物；和（c)將混合物在步 驟（b)後經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，以將細 胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從混合物的其它組分純化出來，從而製備細胞結合劑-細胞 毒素劑綴合物的純化的混合物。方法任選地包括將步驟（a)的混合物經歷步驟（a)與（b) 之間的純化，以將細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從混合物的其它組合分純化出來，從而 在保持步驟（步驟（b))之前製備細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的混合物。步驟 (a)與（b)之間的純化步驟任選地在外源NHS存在的情況下進行。本文中描述的任何純化 法可用於本發明的方法。在優選實施方案中，切向流過濾、吸附色譜或非吸附色譜用作純化 步驟。
[0033] 在一個實施方案中，通過將細胞毒素劑與包含接頭雙官能交聯試劑接觸來製備細 胞毒素劑-接頭化合物，以將細胞毒素劑共價地連接於接頭。在將細胞毒素劑-接頭化合 物與細胞結合劑接觸之前，將細胞毒素劑-接頭化合物任選地經歷純化。
[0034] 在本發明的一個實施方案中，本發明的方法包括在綴合步驟後兩個分開的純化步 驟。可在外源NHS存在的情況下進行綴合反應後的純化步驟。例如，本發明的方法可包括 綴合步驟，隨後進行純化步驟（在外源NHS不存在或存在的情況下），隨後在外源NHS存在 的情況下進行保持步驟，隨後進行另一個純化步驟。本文中描述的任何純化法可用作綴合 反應後的純化步驟。在優選實施方案中，切向流過濾、吸附色譜、非吸附色譜或其組合在綴 合反應後用作純化步驟。
[0035] 任何適當的TFF系統可用於純化，包括Pell icon型系統 (Millipore, Billerica, ΜΑ) > Sartocon Cassette 系統（Sartorius AG, Edgewood, NY)和 Centrasette 型系統（Pall Corp.，East Hills, NY)。
[0036] 任何適當的吸附色譜樹脂可用於純化。優選吸附色譜樹脂包括羥基磷灰石色 譜法、疏水性電荷誘導色譜法（HCIC)、疏水相互作用色譜法（HIC)、離了交換色譜法、混 合模式離子交換色譜法、固定金屬親和色譜法（IMAC)、染料配體色譜法、親和色譜法、反 相色譜法及其組合。適當的羥基磷灰石樹脂的實例包括陶瓷羥基磷灰石（CHT I型和II 型，Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)、HA Ultrogel 輕基憐灰石（Pall Corp.，East Hills, NY)和陶瓷氟憐灰石（CFT I 型和 II 型，Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。適當 的HCIC樹脂的實例為MEP Hypercel樹脂（Pall Corp.，East Hills, NY)。適當的HIC樹脂的 實例包括丁基-Sepharose、己基-Sepaharose、苯基-Sepharose和辛基Sepharose樹脂（全 部來自 GE Healthcare, Piscataway，NJ)以及 Macro-prep 甲基和 Macro-Prep 叔-丁基樹 脂（Biorad Laboratories, Hercules, CA)。適當的離子交換樹脂的實例包括SP-Sepharose、 CM-Sepharose 和 Q-Sepharose 樹脂（全部來自 GE Healthcare, Piscataway, NJ)以及 Unosphere S 樹脂（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。適當的混合模式離子交換 劑的實例包括 Bakerbond ABx 樹脂（JT Baker，Phillipsburg NJ)。適當的 IMAC 樹脂 的實例包括螯合 Sepharose 樹脂（GE Healthcare, Piscataway, NJ)和 Profinity IMAC 樹脂（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。適當的染料配體樹脂的實例包括Blue Sepharose 樹脂（GE Healthcare, Piscataway, NJ)和 Affi-gel Blue 樹脂（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。適當的親和樹脂的實例包括蛋白A Sepharose樹脂（例 如，MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, NJ)，其中細胞結合劑為抗體，和外源凝集素 親和樹脂例如兵豆屬植物外源凝集素 Sepharose樹脂（GE Healthcare, Piscataway, NJ)， 其中細胞結合劑具有適當的外源凝集素結合部位。或者，可使用對於細胞結合 劑是特異的抗體。可將這樣的抗體固定於例如Sepharose 4Fast Flow樹脂（GE Healthcare, Piscataway, NJ)。適當的反相樹脂的實例包括C4、C8和C18樹脂（Grace Vydac，Hesperia, CA)〇
[0037] 任何適當的非吸附色譜樹脂可用於純化。適當的非吸附色譜樹脂的實例包括但不 限於 SEPHADEX? G-25、G-50、G-100、SEPHACRYL? 樹脂（例如，S-200 和 S-300)、SUPERDEX? 樹脂（例如，SUPERDEX?75 和 SUPERDEX?200)、BIO-GEL?樹脂（例如，P-6、P-10、P-30、 P-60和P-100)以及對於本領域技術人員來說是已知的其它樹脂。
[0038] 在一個實施方案中，本發明的方法還包括在外源NHS存在的情況下包括一個或多 個（例如，一、二或三個）保持步驟（S卩，將外源NHS添加至保持步驟），以將不穩定地結合的 接頭從細胞結合劑釋放。保持步驟包括在用雙官能交聯試劑修飾細胞結合劑後，在將細胞 毒素劑綴合於具有連接於其的接頭的細胞結合劑後，和/或在純化步驟之後保持混合物。
[0039] 保持步驟包括將溶液維持在適當的溫度（例如，約2°C至約37°C )進行適當的時 期（例如，約1小時至約1周）以從細胞結合劑釋放不穩定結合的接頭，同時大體上不從細 胞結合劑釋放穩定結合的接頭。在一個實施方案中，保持步驟包括將溶液維持在低溫（例 如，約2°C至約10°C或約4°C )、室溫（例如，約20°C至約30°C或約20°C至約25°C )或升高 的溫度（例如，約30°C至約37°C )。
[0040] 保持步驟的持續時間取決於進行維持步驟時的溫度。例如，保持步驟的持續時間 可通過在升高的溫度上進行保持步驟來顯著減少，最大溫度受限於細胞結合劑-細胞毒素 劑綴合物的穩定性。保持步驟可包括維持溶液約1小時至約1天（例如，約1小時、約2小 時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約 12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約22小時或約24小時），約5小時 至約1周，約12小時至約1周（例如，約12小時、約16小時、約20小時、約24小時、約2 天、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天），進行約12小時至約1周（例如，約12小時、 約16小時、約20小時、約24小時、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天）或約 1天至約1周。
[0041] 在一個實施方案中，保持步驟包括將溶液維持在約2°C至約8°C的溫度，進行至少 約12小時直至1天的時間。
[0042] 用於保持步驟的pH值優選為約4至約9 (例如，約4. 5至約8. 5或約5至約8)。 在一個實施方案中，用於保持步驟的pH值從約5變化至約7. 5 (例如，約5. 5至約7. 5、約6 至約7. 5、約6. 5至約7. 5、約7至約7. 5、約5至約7、約5至約6. 5、約5至約5. 5、約5. 5 至約7、約6至約6. 5或約6至約7)。例如，用於保持步驟的pH值可以為約4、約4. 5、約5、 約5. 5、約6、約6. 5、約7、約7. 5、約8、約8. 5或約9。
[0043] 可在將細胞結合劑綴合於細胞毒素劑之前或之後進行保持步驟。在一個實施方案 中，在用雙官能交聯試劑修飾細胞結合劑之後直接進行保持步驟。例如，本發明的方法包括 在用雙官能交聯試劑修飾細胞結合劑之後並且在綴合之前進行保持步驟。在修飾細胞結合 劑後，可在保持步驟之前和/或保持步驟之後，但在綴合步驟之前進行純化。在另一個實施 方案中，在將細胞毒素劑綴合於具有連接於其的細胞結合劑之後並且在純化步驟之前直接 進行保持步驟。在另一個實施方案中，在綴合和純化步驟之前進行保持步驟，隨後進行另外 的純化步驟。
[0044] 在具體實施方案中，保持步驟可包括在約2°C至約室溫在於約5-7. 5或約6. 5-7. 5 的pH下溫育混合物約1小時至約1周。
[0045] 本發明提供了用於製備包含化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的穩定綴合 物的組合物的方法，其中所述組合物大體上不含不穩定的綴合物。在這方面，本發明提供了 用於製備具有顯著高的純度和穩定性的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的方法。由綴合物 的高純度和穩定性，這樣的組合物可用於治療疾病。包含化學地偶聯於細胞毒素劑例如類 美登素的細胞結合劑例如抗體的組合物描述於例如美國專利7, 374, 762和美國專利申請 公布No. 2007/0031402中。在本發明的一個方面，具有顯著地高的純度的細胞結合劑-細 胞毒素劑綴合物下列特徵的一個或多個特徵：（a)大於約90% (例如，大於或等於約91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)，優選大於約95%的綴合物種類是 單體的，（b)綴合物製劑中未綴合接頭水平低於約10% (例如，少於或等於約9%、8%、7%、 6<%、5<%、4<%、3 1. Ο %>0. 9 %,0. 8 %,0. 7 %,0. 6 %,0. 5 %,0. 4 %, 0. 3%、0. 2%、0. 1%或0% )(相對於總的細胞毒素劑），和/或（e)貯存後（例如，在約1 周、約2周、約3周、約1月、約2月、約3月、約4月、約5月、約6月、約1年、約2年或約5 年後）游離細胞毒素劑水無顯著升高。游離細胞毒素劑水平的"顯著升高"意指在一定的 貯存時間後，游離細胞毒素劑的水平的升高少於約〇. 1 %、約〇. 2%、約0. 3%、約0. 4%、約 0. 5%、約 0. 6%、約 0. 7%、約 0. 8%、約 0. 9%、約 1. 0%、約 1. 1 %、約 1. 2%、約 1. 3%、約 1. 4%、約 1. 5%、約 1. 6%、約 1. 7%、約 1. 8%、約 1. 9%、約 2. 0%、約 2. 2%、約 2. 5%、約 2. 7%、約 3. 0%、約 3. 2%、約 3. 5%、約 3. 7%或約 4. 0%。
[0046] 如本文中所用，術語"未綴合的接頭"是指與雙官能交聯試劑共價連接的細胞結合 齊U，其中細胞結合劑未通過雙官能交聯試劑的接頭共價地偶聯於細胞毒素劑（即，"未綴合 的接頭"可由CBA-L表示，其中CBA表示細胞結合劑並且L表示雙官能交聯試劑。相反地， 細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物可由CBA-L-D表示，其中D表示細胞毒素劑）。
[0047] 在一個實施方案中，細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物中的細胞毒素劑對細胞結合 劑的平均摩爾比為約1至約10、約2至約7、約3至約5、約2. 5至約4. 5 (例如，約2. 5、約 2. 6、約 2. 7、約 2. 8、約 2. 9、約 3. 0、約 3. 1、約 3. 3、約 3. 4、約 3. 5、約 3. 6、約 3. 7、約 3. 8、約 3. 9、約 4. 0、約 4. 1、約 4. 2、約 4. 3、約 4. 4、約 4. 5)、約 3. 0 至約 4. 0、約 3. 2 至約 4. 2、約 4. 5 對 5. 5 (例如，約 4. 5、約 4. 6、約 4. 7、約 4. 8、約 4. 9、約 5. 0、約 5. 1、約 5. 2、約 5. 3、約 5. 4、 約 5. 5)。
[0048] 細胞結合劑可以是結合細胞，通常且優選地動物細胞（例如，人細胞）的任何適當 的試劑。細胞結合劑優選為肽或多肽。適當的細胞結合劑包括例如抗體（例如，單克隆抗 體及其片段）、幹擾素（例如，-〇、-0、-^)、淋巴因子（例如，白細胞介素2(11^-2)，白細 胞介素3 (IL-3)、白細胞介素4(IL-4)、白細胞介素6 (IL-6)、激素（例如，胰島素、TRH(促 甲狀腺激素釋放激素）、MSH(黑素細胞刺激素）、類固醇激素，例如雄激素類和雌激素類）、 生長因子和集落刺激因子，例如表皮生長因子（EGF)、轉化生長因子α (TGF-α)、成纖維細 胞生長因子（FGF)、血管內皮生長因子（VEGF)、集落刺激因子（CSF)，例如G-CSF，M-CSF和 GM_CSF(Burgess, Immunology Today 5:155-158(1984))、營養物轉運分子（例如，轉鐵蛋 白）、維生素（例如，葉酸）以及特異性結合細胞表面上的靶分子的任何其它試劑或分子。 [0049] 當細胞結合劑是抗體時，其結合抗原，所述抗原是多肽和可以是跨膜分子（例如 受體）或配體例如生長因子。示例性抗原包括分子例如腎素；生長激素，包括人生長激素 和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋 白酶；胰島素 Α-鏈；胰島素 Β-鏈；胰島素原；濾泡刺激激素；降鈣素；促黃體激素；胰高血 糖素；凝血因子例如因子vmc、因子IX、組織因子（TF)和von Willebrands因子；抗-凝血 因子例如蛋白C ;心鈉素；肺表面活性劑；血纖溶酶原激活物，例如尿激酶或人悄或組織類 型血纖溶酶原激活物（t-PA);鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β ; 腦啡肽酶；RANTES(在激活上受調節的，通常Τ-細胞表達和分泌的）；人巨噬細胞炎性蛋 白（MIP-1-α);血清白蛋白，例如人血清白蛋白；Muellerian抑制物質；鬆弛素 Α-鏈； 鬆弛素 B-鏈；鬆弛素原；小鼠促性腺素相關肽；微生物蛋白，例如β-內醯胺酶；DNA酶； IgE ;細胞毒素 Τ淋巴細胞相關抗原（CTLA)，例如CTLA-4 ;抑制素；活化素；血管內皮生長 因子（VEGF);激素或生長因子的受體；蛋白A或D ;類風溼因子；神經營養因子例如骨來 源的神經營養因子（BDNF)，神經營養因子-3、-4、-5或-6 (NT-3、NT4、NT-5或NT-6)或神 經生長因子例如NGF-β ;血小板衍生生長因子（PDGF);成纖維細胞生長因子例如aFGF和 bFGF;表皮生長因子（EGF);轉化生長因子（TGF)例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-βΙ、 TGF-β 2、TGF-β 3、TGF-β 4 或 TGF-β 5 ;胰島素-樣生長因子-I 和-II (IGF-I 和 IGF-II); des (l-3)-IGF-I (腦 IGF-I)、胰島素-樣生長因子結合蛋白、EpCAM、⑶3、FLT3、PSMA、PSCA、 MUC1、MUC16、STEAP、CEA、TENB2、EphA 受體、EphB 受體、葉酸受體、F0LR1、間皮素、cripto、 α νβ 6、整聯蛋白、VEGF、VEGFR、EGFR、轉鐵蛋白受體、IRTA1、IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5 ; CD 蛋白例如 CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD 11、CD 14、CD 19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、 CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80. CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CD152 或美國專利申請公布 No. 2008/0171040 或 美國專利申請公布No. 2008/0305044(將所述美國專利申請公布通過引用整體併入本文） 中公開的結合一種或多種腫瘤相關抗原或細胞表面受體的抗體；紅細胞生成素；骨誘導因 子；免疫毒素；骨形態發生蛋白（BMP);幹擾素，例如幹擾素-α、-β和-γ ;集落刺激因子 (CSF)，例如，M-CSF，GM-CSF和G-CSF ;白細胞介素（IL)，例如，IL-1至IL-10 ;超氧化物歧 化酶；Τ-細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原例如，HIV包膜的部分；轉運蛋 白；歸巢受體；地址素；調節蛋白；整聯蛋白例如⑶11a、⑶lib、⑶11c、⑶18、ICAM、VLA-4 和VCAM ;腫瘤相關抗原例如HER2、HER3或HER4受體；內皮因子、c-Met、lGFlR、PSGR、NGEP、 PSMA、PSCA、LGR5、B7H4以及上文列出的多肽的任一種的片段。
[0050] 此外，結合骨髓細胞的GM-CSF可用作針對來自急性髓性白血病的患病細胞的細 胞結合劑。結合活化的T細胞的IL-2可用於移植排斥的預防，用於移植物抗宿主病的治療 和預防，和用於急性T細胞白血病的治療。結合黑色素細胞的MSH可用於治療黑色素瘤，正 如針對黑色素瘤的抗體可用於治療黑色素瘤一樣。葉酸可用於靶向卵巢和其它腫瘤上表達 的葉酸受體。表皮生長因子可用於靶向鱗癌例如肺以及頭頸癌。生長抑素可用於靶向神經 母細胞瘤和其它腫瘤類型。.
[0051] 乳腺和睪丸的癌症可分別被作為細胞結合劑的雌激素（或雌激素類似物）或雄激 素（或雄激素類似物）成功靶向。
[0052] 如本文中所用，術語"抗體"是指任何免疫球蛋白、任何免疫球蛋白片段例如 Fab、Fab'、F(ab'）2、dsFv、sFv、微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、納米抗體、蛋 白水解激活抗體、結構域抗體、單鏈抗體等（Parham, J. Immunol. 131:2895-2902(1983); Spring 等人，J.Immunol.113:470-478 (1974) ；Nisonoff 等人,Arch. Biochem. Biophys.89:230-244(1960) ;Kim 等人，Mol. Cancer Ther·，7:2486-2497(2008); Carter, Nature Revs. ,6:343-357(2006))或免疫球蛋白嵌合體，其可結合細胞表面上的抗 原（例如，其包含互補決定區（CDR))。任何適當的抗體可用作細胞結合劑。本領域技術人 員將理解適當的抗體的選擇將取決於待被靶向的細胞群體。在這一點上，在特定細胞群體 (通常地且優選地患病細胞群體）中選擇性表達的細胞表面分子（即，抗原）的類型和數目 將決定用於本發明的組合物的適當的抗體的選擇。細胞表面表達特徵譜對於多種細胞類型 包括腫瘤細胞類型是已知的，或如果未知時，可使用常規分子生物學和組織化學技術來測 定。抗體可以是雙特異性抗體（Morrison，SL, Nature biotechnology, 25 (11) :1233 - 4 (20 07))。
[0053] 抗體可以是多克隆的或單克隆的，但最優選是單克隆抗體。如本文中所用，"多克 隆"抗體是指通常包含在被免疫的動物的血清中的抗體分子的異質群體。"單克隆"抗體是 指對於特定抗原是特異性的抗體分子的同質群體。單克隆抗體通常由單個克隆的B淋巴細 胞（"B細胞"）產生。單克隆抗體可使用本領域技術人員已知的多種技術來獲得，包括標準 雜交瘤技術（參見，例如，Kdhler 和 Milstein, Eur. J. Immunol. , 5:511-519 (1976) ；Harlow 和 Lane (編輯），Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988);和 C. A. Janeway 等 人（編輯），Immunobiology,第 5 版，Garland Publishing，New York，NY(2001))。簡而言 之，產生單克隆抗體的雜交瘤法通常包括利用抗原（即，"免疫原"）注射任何適當的動物， 通常且優選地小鼠。隨後殺死動物，將從其脾分離的B細胞與人骨髓瘤細胞融合。產生雜交 細胞（即，"雜交瘤")，其可無限增殖並在體外連續分泌高滴度的具有期望的特異性的抗體。 本領域已知的任何適當方法可用於鑑定產生具有期望的特異性的抗體的雜交瘤細胞。這樣 的方法包括例如酶聯免疫吸附測定（ELISA)、Western印跡分析和放射免疫測定。篩選雜 交瘤的群體以分離單個克隆，所述克隆的每一個分泌針對抗原的單一抗體種類。因為每一 個雜交瘤是來源於與單個B細胞融合的克隆，因此其產生的所有抗體分子在結構上包括它 們的抗原結合部位和同種型是相同的。單克隆抗體還可使用其它適當的技術包括EBV-雜 交瘤技術（參見，例如，Haskard 和 Archer, J. Immunol. Methods, 74 (2) : 361-67 (1984)，和 Roder等人，Methods Enzymol.，121:140-67 (1986))、噬菌體載體表達系統（參見，例如， Huse等人，Science, 246:1275-81 (1989))或包含抗體片段例如Fab和scFv (單鏈可變區） 的噬菌體展示文庫（參見，例如，美國專利5, 885, 793和5, 969, 108以及國際專利申請公布 No. W0 92/01047 和 W0 99/06587)來產生。
[0054] 單克隆抗體可從任何適當的動物分離或可在其中產生，但優選在哺乳動物，更優 選小鼠或人，最優選人中產生。用於在小鼠中產生抗體的方法對於本領域技術人員來說 是公知的並且在本文中進行了描述。關於人抗體，本領域技術人員將理解多克隆抗體可 從利用適當的抗原接種或免疫的人受試者的血清分離。或者，人抗體可通過採用用於在 非人動物例如小鼠中產生人抗體的已知技術來產生（參見，例如，美國專利5, 545, 806 ; 5, 569, 825 ;和 5, 714, 352 以及美國專利申請公布 No. 2002/0197266 A1)。
[0055] 雖然是人的治療應用的理想選擇，但人抗體，特別地人單克隆抗體，通常比小鼠單 克隆抗體更難產生。然而，小鼠單克隆抗體，當給人施用時，誘導快速宿主抗體反應，這可減 小抗體-細胞毒素劑綴合物的治療或診斷潛能。為了克服這些併發症，單克隆抗體優選地 不被人免疫系統識別為"外來的"。
[0056] 為此目的，噬菌體展示可用於產生抗體。在這一點上，編碼抗體的抗原結合可 變（V)結構域的噬菌體文庫可使用標準分子生物學和重組DNA技術來產生（參見，例如， Sambrook 等人（編輯），Molecular Cloning, A LaboratoryManual,第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(2001))。選擇編碼具有期望的特異性的可變區的噬 菌體的對期望的抗原的特異性結合，重建包含選擇的可變結構域的完全人抗體。將編碼重 建抗體的核酸序列引入適當的細胞系，例如用於雜交瘤產生的骨髓瘤細胞，以便具有單克 隆抗體的特徵的人抗體由細胞分泌（參見，例如，Janeway等人，同上，Huse等人，同上， 和美國專利6, 265, 150)。或者，可從對於特定人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因是轉基因的小 鼠產生單克隆抗體。這樣的方法在本領域是已知的並且描述於例如美國專利5, 545, 806和 5, 569, 825以及Janeway等人（同上）中。
[0057] 最優選地，抗體是人源化抗體。如本文中所用，"人源化"抗體是其中將形成抗 體的抗原結合環的小鼠單克隆抗體的互補決定區（CDR)移植至人抗體分子的構架上的抗 體。歸因於小鼠與人抗體的構架的相似性，通常在本領域接受：該方法產生在抗原性上 與人抗體相同但結合與CDR所源自的小鼠單克隆抗體結合的抗原相同的抗原的單克隆抗 體。用於產生人源化抗體的方法在本領域是公知的並且詳細地描述於例如Janeway等人 (同上）、美國專利5, 225, 539、5, 585, 089和5, 693, 761、歐洲專利0239400 B1以及英國 專利2188638中。人源化抗體還可使用美國專利5, 639, 641和Pedersen等人，J. Mol. Biol. ,235:959-973(1994)中描述的抗體表面再建技術來產生。雖然本發明組合物的綴合 物中使用的抗體最優選為人源化單克隆抗體，但如上所述的人單克隆抗體和小鼠單克隆抗 體也在本發明的範圍內。
[0058] 具有至少一個抗原結合部位，從而識別並結合至少一個存在於靶細胞表面上的抗 原或受體的抗體片段也在本發明的苦海無邊內。在這方面，完整抗體分子的蛋白質水解切 割可產生保留識別並結合抗原的能力的許多抗體片段。例如，利用蛋白酶木瓜蛋白酶對抗 體分子的有限消化通常產生三個片段，所述片段中的兩個片段相同並且被稱為Fab片段， 因為它們保留親代抗體分子的抗原結合活性。利用酶胃蛋白酶對抗體分子的切割通常產 生兩個抗體片段，所述片段中的一個保留抗體分子的兩個抗原結合臂，從而被稱為F(ab'） 2 片段。利用二硫蘇糖醇或巰基乙胺對F(ab'）2片段的還原產生稱為Fab'片段的片段。單 鏈可變區片段（sFv)抗體片段（其由包含通過合成肽連接於抗體輕鏈的V結構域的抗體重 鏈的可變（V)結構域的截斷的Fab片段組成）可使用常規重組DNA技術學技術（參見，例 如，Janeway等人，同上）來產生。類似地，二硫化物穩定的可變區片段（dsFv)可通過重組 DNA 技術來製備（參見，例如，Reiter 等人，Protein Engineering, 7:697-704(1994))。然 而，本發明的背景中的抗體片段不限於抗體片段的這些示例性類型。可使用識別並結合期 望的細胞表面受體或抗原的任何適當的抗體片段。抗體片段進一步描述於例如Parham, J. Immunol. ,131:2895-2902(1983) ;Spring 等人，J.Immunol. ,113:470-478(1974);和 Nisonoff 等人，Arch. Biochem. Biophys.，89:230-244 (1960)中。抗體-抗原結合可使用本 領域已知的任何適當的方法來測定，所述方法是例如放射免疫測定（RIA)、ELISA、Western 印跡、免疫沉澱和競爭性抑制測定（參見，例如，Janeway等人，同上，和美國專利申請公布 No. 2002/0197266A1)。
[0059] 此外，抗體可以是嵌合抗體或其抗原結合片段。關於"嵌合"，其意指抗體包含至 少兩個獲自或來源於至少兩個不同物種的免疫球蛋白或其片段（例如，兩種不同免疫球蛋 白，例如與鼠免疫球蛋白可變區組合的人免疫球蛋白恆定區）。抗體還可以是結構域抗體 (dAb)或其抗原結合片段，例如，胳騎抗體（參見，例如，Desmyter等人，似1：11^31:；1〇1(31:· Biol.，3:752，（1996))或藍魚抗體，例如，新的抗原受體（IgNAR)(參見，例如，Greenberg等 人，Nature, 374:168 (1995)和 Stanfield 等人，Science, 305:1770-1773 (2004))。
[0060] 任何適當的抗體可用於本發明的背景。例如，單克隆抗體J5是對於 常見急性淋巴細胞白血病抗原（CALLA)是特異性的鼠 IgG2a抗體（Ritz等 人，Nature, 283:583-585(1980))，並且可用於靶向表達CALLA的細胞（例如，急性淋巴母 細胞白血病細胞）。單克隆抗體MY9是特異性結合CD33抗原的鼠 IgGl抗體（Griffin等 人，Leukemia Res.，8:521 (1984))，並且可用於靶向表達CD33的細胞（例如，急性髓性白血 病（AML)細胞）。
[0061] 類似地，單克隆抗體抗-B4(也稱為M)是結合B細胞上的⑶19抗原的鼠 IgGl抗 體（Nadler等人，J. Immunol.，131:244-250 (1983))，並且可用於靶向B細胞或表達CD19的 患病細胞（例如，非何杰金氏淋巴瘤細胞和慢性淋巴母細胞白血病細胞）。N901是結合在 神經內分泌來源包括小細胞肺腫瘤的細胞上發現的CD56(神經細胞粘附分子）抗原的鼠單 克隆抗體，其可在綴合物中用於將將藥物靶向神經內分泌來源的細胞。優選在J5、MY9和B4 抗體用作綴合物的部分之前將其進行表面再建或人源化。抗體的表面再建或人源化描述於 例如 Roguska 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:969-73 (1994)中。
[0062] 此外，單克隆抗體C242結合CanAg抗原（參見，例如，美國專利5, 552, 293)，並 且可用於將綴合物靶向表達CanAg的腫瘤例如結直腸癌、胰腺癌、非小細胞肺癌和胃癌。 此〇242是單克隆抗體0242的人源化形式（參見，例如，美國專利5,552,293)。將!11^242 所產生自的雜交瘤以ECACC標識號90012601保藏。HuC242可使用CDR-移植法（參見，例 如，美國專利5, 585, 089、5, 693, 761和5, 693, 762)或表面再建技術（參見，例如，美國專利 5,639,641)來製備。HuC242可用於將綴合物靶向表達CanAg抗原的腫瘤細胞，例如結直腸 癌細胞、胰腺癌細胞、非小細胞肺癌細胞和胃癌細胞。
[0063] 為了靶向卵巢癌和前列腺癌細胞，可將抗-MUC1抗體用作綴合物中的細胞 結合劑。抗-MUC1抗體包括例如抗-HMFG-2 (參見，例如，Taylor-Papadimitriou等 人，Int.J. Cancer, 28:17-21 (1981))、hCTMOl (參見，例如，van Hof 等人，Cancer Res.，56:5179-5185(1996))和DS6。前列腺癌細胞還可通過使用抗-前列腺-特異性膜 抗原（PSMA)作為細胞結合劑例如J591，利用綴合物來靶向（參見，例如，Liu等人，Cancer Res.，57:3629-3634 (1997))。此外，表達Her2抗原的癌細胞例如乳腺癌和卵巢癌可使用抗 體曲妥珠單抗來靶向。結合胰島素樣生長因子受體的抗-IGF-IR抗體還可用於綴合物。結 合 CD27L、EGFRvIII、Cripto、CD138、CD38、EphA2、整聯蛋白、CD37、葉酸受體和 Her3 的抗體 還可用於綴合物。
[0064] 在一個實施方案中，抗體選自huN901、huMy9_6、huB4、huC242、曲妥珠單抗、比伐 單抗、西羅珠單抗、利妥昔單抗、huDS6、國際專利申請公布No. W0 2010/124797中描述的 抗-間皮素抗體（例如MF-T)、美國專利申請公布No. 2010/0093980中描述的抗-cripto 抗體（例如huB3F6)、美國專利申請公布No. 2007/0183971中描述的抗-CD138抗體（例如 huB-B4)、美國專利No. 7, 736, 644和7, 628, 986以及美國專利申請公布No. 2010/0111979 ; 2009/0240038 ;2009/0175887 ;2009/0156790 和 2009/0155282 中描述的抗-EGFRvIII 抗 體、國際專利申請公布No. W0/2011/039721和W0/2011/039724中描述的人源化EphA2抗體 (例如2H11R35R74)、國際專利申請公布No. W0 2008/047242中描述的抗-CD38抗體（例如 hu38SB19)、美國臨時申請No. 61/307, 797、61/346, 595和61/413, 172以及美國專利申請公 布No. 2012/0009181中描述的抗-葉酸受體抗體（例如，huMovl9);美國專利5, 958, 872 和6, 596, 743中描述的抗-IGF1R抗體；美國專利申請公布No. 2011/0256153中描述的 抗4037抗體（例如，1111〇)37-3);美國專利申請公布此.2006/0127407中描述的抗-整聯蛋 白α νβ6抗體（例如，CNT095);和國際專利申請公布No.WO 2012/019024中描述的抗-Her3 抗體。特別優選的抗體是本文中描述的人源化單克隆抗體。
[0065] 雖然細胞結合劑優選為抗體，但細胞結合劑還可以是非抗體分子。適 當的非抗體分子包括例如，錨蛋白重複蛋白（DARPins ;Zahnd等人，J. Biol. Chem·，281，46,35167-35175,（2006) ;Binz 等人，Nature Biotechnology, 23:1257-126 8 (2005))或錨蛋白樣重複蛋白或例如美國專利申請公布No. 2007/0238667 ;美國專利 7, 101，675 ;以及國際專利申請公布No. TO/2007/147213和TO/2007/062466)中描述的 合成肽、幹擾素（例如，-α、-β或-γ幹擾素）、淋巴因子（例如，白細胞介素2(IL-2)、 IL-3、IL-4或IL-6)、激素（例如，胰島素）、生長因子（例如，EGF、TGF- a、FGF和 VEGF)、集落刺激因子（例如，G-CSF、M-CSF 和 GM-CSF(參見，例如，Burgess, Immunology Today, 5:155-158 (1984))、生長抑素和轉鐵蛋白（參見，例如，0' Keefe等人，181〇1· Chem.，260:932-937(1985))。例如，GM-CSF，其結合髓系細胞，可用作細胞結合劑來靶向急 性髓性白細胞。此外，IL-2,其結合活化的T-細胞，可用於預防移植排斥，用於治療或預防 移植物抗宿主病，和用於治療急性T細胞白血病。表皮生長因子（EGF)可用於靶向鱗癌例 如肺癌和頭頸癌。生長抑素可用於靶向神經母細胞瘤細胞和其它腫瘤細胞類型。
[0066] 綴合物可包含任何適當的細胞毒素劑。如本文中所用，"細胞毒素劑"是指導致細 胞死亡、誘導細胞死亡或減小細胞活力的任何化合物。適當的細胞毒素劑包括例如類美登 素和類美登素類似物、紫杉烷、CC-1065和CC-1065類似物以及多拉司他汀及多拉司他汀 類似物。在本發明的優選實施方案中，細胞毒素劑為類美登素，包括美登醇和美登醇類似 物。類美登素是抑制微管形成並且對哺乳動物細胞具有高度毒性的化合物。適當的美登醇 類似物的實例包括具有修飾芳香環的美登醇類似物和在其它位置具有修飾的美登醇類似 物。這樣的類美登素描述於例如美國專利4, 256, 746 ;4, 294, 757 ;4, 307, 016 ;4, 313, 946 ; 4, 315, 929 ；4, 322, 348 ；4, 331, 598 ；4, 361, 650 ；4, 362, 663 ；4, 364, 866 ；4, 424, 219 ； 4, 371, 533 ;4, 450, 254 ;5, 475, 092 ;5, 585, 499 ;5, 846, 545 和 6, 333, 410 中。
[0067] 具有修飾芳環的美登醇類似物的實例包括：（1)C-19-脫氯（美國專利4, 256, 746) (通過安絲菌素 P2的LAH還原製備的）、（2) C-20-羥基（或C-20-去甲基）+/-C-19-脫 氯（美國專利4, 361，650和4, 307, 016)(通過使用鏈黴菌屬（Streptomyces)或放線菌 屬（Actinomyces)的去甲基作用或使用LAH的脫氯作用製備的）和（3)C-20-去甲氧基、 C-20-醯氧基（-0C0R)、+/-脫氯（美國專利4, 294, 757)(通過使用醯氯的醯化作用製備 的）。
[0068] 具有除芳環外的位置的修飾的美登醇類似物的實例包括：（l)C-9-SH(美國專 利4, 424, 219)(通過美登醇與H2S或P2S5的反應製備的）、（2)C-14-烷氧甲基（脫甲氧 基/01 201〇(美國專利4,331，598)、（3)(：-14-羥甲基或醯氧甲基（0120!1或01 2^)(美國 專利4,450,254)(從諾卡爾菌屬（此(^"1幻製備的）、（4)(：-15-羥基/醯氧基（美國 專利4, 364, 866)(通過鏈黴菌屬對美登醇的轉化製備的）、（5)C-15-甲氧基（美國專利 4, 313, 946和4, 315, 929)(從滑桃樹分離的）、（6)C-18-N-去甲基（美國專利4, 362, 663 和4, 322, 348)(通過鏈黴菌屬對美登醇的去甲基作用製備的）和（7) 4, 5-脫氧（美國專利 4, 371，533)(通過美登醇的三氯化鈦/LAH還原製備的）。
[0069] 在本發明的優選實施方案中，綴合物利用含硫醇基類美登素 DM1 (也稱為N2'-去乙 醯基-N2 -(3-巰基-1-氧戊基）-美坦辛作為細胞毒素劑。DM1的結構由式（I)表不：
[0070]
【權利要求】
1. 一種用於製備具有連接於其的接頭的細胞結合劑的方法，所述方法包括在外源 N-羥基琥珀醯亞胺（NHS)存在的情況下將細胞結合劑與雙官能交聯試劑接觸以將接頭共 價地連接於所述細胞結合劑，從而製備包含具有連接於其的接頭的細胞結合劑的混合物。
2. -種用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合 劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細胞結合劑與雙官能交聯試劑接觸以將接頭共價地連接於所述細胞結合劑，從 而製備包含具有連接於其的接頭的細胞結合劑的第一混合物， (b) 將所述第一混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合，從而製備具有連接於其的接頭的細胞結合劑的純化的第一混合物， (c) 通過將具有連接於其的接頭的細胞結合劑與細胞毒素劑反應來將細胞毒素劑綴合 於所述純化的第一混合物中的具有連接於其的接頭的細胞結合劑，從而製備包含（i)含有 通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物、（ii) 游離細胞毒素劑和（iii)反應副產物的第二混合物，和 (d) 將第二混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其 組合以將所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出來，從 而製備所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物， 其中在步驟（a)期間或之後以及在步驟（c)之前添加外源N-羥基琥珀醯亞胺。
3. 根據權利要求2所述的方法，其中在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下進行步驟 (a)中的接觸。
4. 根據權利要求2所述的方法，其還包括在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下在步 驟（a)之後保持所述第一混合物。
5. 根據權利要求4所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的溶液進行所述保 持。
6. 根據權利要求5所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
7. 根據權利要求2所述的方法，其中在步驟（b)中添加外源N-羥基琥珀醯亞胺。
8. 根據權利要求2所述的方法，其還包括在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下在步 驟（b)之後保持所述純化的第一混合物。
9. 根據權利要求8所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的溶液中進行所述保 持。
10. 根據權利要求9所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
11. 根據權利要求2至10中任一項所述的方法，其中在步驟（b)和（d)中使用切向流 過濾。
12. 根據權利要求2至10中任一項所述的方法，其中在步驟（b)和（d)中使用吸附色 譜。
13. 根據權利要求2至10中任一項所述的方法，其中在步驟（b)中使用吸附色譜以及 在步驟（d)中使用切向流過濾。
14. 根據權利要求2至10中任一項所述的方法，其中在步驟（b)和（d)中使用非吸附 色譜。
15. 根據權利要求2至10中任一項所述的方法，其中在步驟（b)中使用切向流過濾以 及在步驟（d)中使用吸附色譜。
16. 根據權利要求2至15中任一項所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的溶 液中進行步驟（a)中的接觸。
17. 根據權利要求16所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
18. 根據權利要求16所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
19. 根據權利要求2至18中任一項所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的溶 液中進行步驟（c)中的綴合。
20. 根據權利要求19所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
21. 根據權利要求19所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
22. -種用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合 劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細胞結合劑與雙官能交聯試劑接觸以將接頭共價連接於細胞結合劑，從而製備 包含具有連接於其的接頭的細胞結合劑的第一混合物， (b) 通過將具有連接於其的接頭的細胞結合劑與細胞毒素劑反應來將細胞毒素劑綴合 於所述第一混合物中的具有連接於其的接頭的細胞結合劑，從而製備包含（i)含有通過接 頭偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物、（ii)游離細胞毒素 劑和（iii)反應副產物的第二混合物，和 (c) 將所述第二混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合，以將所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出 來，從而製備所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物， 其中在步驟（a)的過程中或之後和在步驟（b)之前添加所述外源N-羥基琥珀醯亞胺。
23. 根據權利要求22所述的方法，其中在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下進行步 驟（a)中的接觸。
24. 根據權利要求22所述的方法，其還包括在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下在 步驟（a)後保持所述第一混合物。
25. 根據權利要求24所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的溶液中進行所述 保持。
26. 根據權利要求25所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
27. 根據權利要求22至26中任一項所述的方法，其中在步驟（c)中使用切向流過濾。
28. 根據權利要求22至26中任一項所述的方法，其中在步驟（c)中使用吸附色譜。
29. 根據權利要求22至26中任一項所述的方法，其中在步驟（c)中使用非吸附色譜。
30. 根據權利要求22至29中任一項所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進行步驟（a)中的接觸。
31. 根據權利要求30所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
32. 根據權利要求30所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
33. 根據權利要求22至32中任一項所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進行步驟（b)中的綴合。
34. 根據權利要求33所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
35. 根據權利要求33所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
36. -種用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合 劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細胞結合劑與包含化學地偶聯於接頭的細胞毒素劑的細胞毒素劑-接頭化合物 接觸，以將細胞毒素劑-接頭化合物共價地偶聯於所述細胞結合劑，從而製備包含含有通 過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的 混合物，和 (b) 將包含所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的混合物經歷切向流過濾、選擇性沉 澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，以純化所述綴合物，其中在步驟（a)的過程 中或之後和在步驟（b)之前添加外源N-羥基琥珀醯亞胺。
37. 根據權利要求36所述的方法，其中在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下進行步 驟（a)中的接觸。
38. 根據權利要求36所述的方法，其還包括在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下在 步驟（a)後保持所述混合物。
39. 根據權利要求38所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的溶液中進行所述 保持。
40. 根據權利要求39所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
41. 根據權利要求36至40中任一項所述的方法，其中通過將細胞毒素劑與包含接頭的 雙官能交聯試劑接觸以將所述細胞毒素劑共價地連接於所述接頭來製備細胞毒素劑-接 頭化合物，並從而製備包含所述細胞毒素劑-接頭化合物的混合物。
42. 根據權利要求36至41中任一項所述的方法，其中在與所述細胞結合劑接觸之前純 化所述細胞毒素劑-接頭化合物。
43. 根據權利要求36至41中任一項所述的方法，其中在與細胞結合劑接觸之前不純化 所述細胞毒素劑-接頭化合物。
44. 根據權利要求36至43中任一項所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進行步驟（a)中的接觸。
45. 根據權利要求44所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
46. 根據權利要求44所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
47. -種用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合 劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細胞結合劑與雙官能交聯試劑接觸以將接頭共價地連接於所述細胞結合劑，從 而製備包含具有連接於其的接頭的細胞結合劑的第一混合物， (b) 將所述第一混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合，從而製備具有連接於其的接頭的細胞結合劑的純化的第一混合物， (c) 通過將所述具有連接於其的接頭的細胞結合劑與細胞毒素劑在外源N-羥基琥珀 醯亞胺存在的情況下反應，來將細胞毒素劑綴合於所述純化的第一混合物中的具有連接於 其的接頭的細胞結合劑，從而製備包含（i)含有通過接頭偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑 的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物、（ii)游離細胞毒素劑和（iii)反應副產物的第二混合 物，和 (d) 將所述第二混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合以將所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出 來，從而製備細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。
48. 根據權利要求47所述的方法，其中在步驟（b)和（d)中使用切向流過濾。
49. 根據權利要求47所述的方法，其中在步驟（b)和（d)中使用吸附色譜。
50. 根據權利要求47所述的方法，其中在步驟（b)和（d)中使用非吸附色譜。
51. 根據權利要求47所述的方法，其中在步驟（b)中使用吸附色譜以及在步驟（d)中 使用切向流過濾。
52. 根據權利要求47所述的方法，其中在步驟（b)中使用切向流過濾以及在步驟（d) 中使用吸附色譜。
53. 根據權利要求47至52中任一項所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進行步驟（a)中的接觸。
54. 根據權利要求53所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
55. 根據權利要求53所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
56. 根據權利要求47至55中任一項所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進行步驟（c)中的綴合。
57. 根據權利要求56所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
58. 根據權利要求56所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
59. -種用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合 劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細胞結合劑與雙官能交聯試劑接觸以將接頭共價地連接於所述細胞結合劑，從 而製備包含具有連接於其的接頭的細胞結合劑的第一混合物， (b) 通過將具有連接於其的接頭的細胞結合劑與細胞毒素劑在外源N-羥基琥珀醯亞 胺存在的情況下反應，來將細胞毒素劑綴合於所述第一混合物中的所述具有連接於其的接 頭的細胞結合劑，從而製備包含（i)含有通過所述接頭化學地偶聯於所述細胞毒素劑的細 胞結合劑的所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物、（ii)游離細胞毒素劑和（iii)反應副產 物的第二混合物，和 (c) 將所述第二混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合以將所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出 來，從而製備所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。
60. 根據權利要求59所述的方法，其中在步驟（c)中使用切向流過濾。
61. 根據權利要求59所述的方法，其中在步驟（c)中使用吸附色譜。
62. 根據權利要求59所述的方法，其中在步驟（c)中使用非吸附色譜。
63. 根據權利要求59至62中任一項所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進行步驟（a)中的接觸。
64. 根據權利要求63所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
65. 根據權利要求63所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
66. 根據權利要求59至65中任一項所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進行步驟（c)中的綴合。
67. 根據權利要求66所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
68. 根據權利要求66所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
69. -種用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合 劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細胞結合劑與雙官能交聯試劑接觸以將接頭共價地連接於所述細胞結合劑，從 而製備包含具有連接於其的接頭的細胞結合劑的第一混合物， (b) 將所述第一混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合，從而製備具有連接於其的接頭的細胞結合劑的純化的第一混合物， (c) 通過將所述具有連接於其的接頭的細胞結合劑與細胞毒素劑反應,來將細胞毒素 劑綴合於所述純化的第一混合物中的所述具有連接於其的接頭的細胞結合劑，從而製備包 含（i)含有通過所述接頭化學地偶聯於所述細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞 毒素劑綴合物、（ii)游離細胞毒素劑和（iii)反應副產物的第二混合物， (d) 在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下溫育所述第二混合物；和 (e) 在步驟（d)之後將所述第二混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸 附過濾、吸附色譜或其組合，以將所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從所述第二混合物 的其它組分純化出來，從而製備通過所述接頭化學地偶聯於所述細胞毒素劑的細胞結合劑 的純化的第二混合物。
70. 根據權利要求69所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH溶液中進行步驟 (d)中的溫育。
71. 根據權利要求70所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
72. 根據權利要求70所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
73. 根據權利要求69至72中任一項所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進行步驟（a)中的接觸。
74. 根據權利要求73所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
75. 根據權利要求73所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
76. 根據權利要求69至75中任一項所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進行步驟（c)中的綴合。
77. 根據權利要求76所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
78. 根據權利要求76所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
79. 根據權利要求69至78中任一項所述的方法，其還包括在步驟（c)與（d)之間將所 述第二混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，以 將所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出業，從而在步 驟（d)之前製備所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。
80. 根據權利要求79所述的方法，其中在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下進行純 化。
81. 根據權利要求79或80所述的方法，其中將所述第二混合物在步驟（c)與（d)之間 經歷切向流過濾。
82. 根據權利要求69至81中任一項所述的方法，其中在步驟（e)中使用切向流過濾。
83. 根據權利要求69至81中任一項所述的方法，其中在步驟（e)中使用吸附色譜。
84. 根據權利要求69至81中任一項所述的方法，其中在步驟（e)中使用非吸附色譜。
85. 根據權利要求69至84中任一項所述的方法，其中在步驟（b)中使用切向流過濾。
86. 根據權利要求69至84中任一項所述的方法，其中在步驟（b)中使用吸附色譜。
87. 根據權利要求69至84中任一項所述的方法，其中在步驟（b)中使用非吸附色譜。
88. -種用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的綴合物的方 法，所述方法包括： (a) 將細胞結合劑與雙官能交聯試劑接觸以將接頭共價地連接於所述細胞結合劑，從 而製備包含具有連接於其的接頭的細胞結合劑的第一混合物， (b) 通過將所述具有連接於其的接頭的細胞結合劑與細胞毒素劑反應,來將細胞毒素 劑綴合於所述第一混合物中的所述具有連接於其的接頭的細胞結合劑，從而製備包含（i) 含有通過所述接頭化學地偶聯於所述細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素 劑綴合物、（ii)游離細胞毒素劑和（iii)反應副產物的第二混合物， (c) 在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下溫育所述第二混合物；和 (d) 將所述第二混合物在步驟（c)之後經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸 附過濾、吸附色譜或其組合，以將所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從所述第二混合物 的其它組分純化出來，從而製備所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的第二混合 物。
89. 根據權利要求88所述的方法，其中在具有約4. 0至9. 0的pH的溶液中進行步驟 (c)中的溫育。
90. 根據權利要求89所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
91. 根據權利要求89所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
92. 根據權利要求88至91中任一項所述的方法，其中在具有約4. 0至9. 0的pH的溶 液中進行步驟（a)中的接觸。
93. 根據權利要求92所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
94. 根據權利要求92所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
95. 根據權利要求88至94中任一項所述的方法，其中在具有約4. 0至9. 0的pH的溶 液中進行步驟（b)中的綴合。
96. 根據權利要求95所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
97. 根據權利要求95所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
98. 根據權利要求88至97中任一項所述的方法，其還包括在步驟（b)與（c)之間將所 述第二混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合步 驟，以將所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出來，從 而在步驟（c)之前製備所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。
99. 根據權利要求98所述的方法，其中在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下在步驟 (b)與（c)之間進行所述第二混合物的純化。
100. 根據權利要求98或99所述的方法，其中將所述第二混合物在步驟（b)與（c)之 間經歷切向流過濾。
101. 根據權利要求88至100中任一項所述的方法，其中在步驟（d)中使用切向流過 濾。
102. 根據權利要求88至100中任一項所述的方法，其中在步驟（d)中使用吸附色譜。
103. 根據權利要求88至100中任一項所述的方法，其中在步驟（d)中使用非吸附色 譜。
104. -種用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合 劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細胞結合劑與細胞毒素劑接觸以形成包含所述細胞結合劑和所述細胞毒素劑的 第一混合物，隨後將所述第一混合物與包含接頭的雙官能交聯試劑在具有約4至約9的pH 的溶液中接觸，以提供包含（i)含有通過所述接頭化學地偶聯於所述細胞毒素劑的細胞結 合劑的細胞結合劑細胞毒素劑綴合物、（ii)游離細胞毒素劑和（iii)反應副產物的第二混 合物； (b) 在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下溫育所述第二混合物；和 (c) 將所述第二混合物在步驟（b)後經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附 過濾、吸附色譜或其組合，以將所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的 其它組分純化出來，從而製備所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。
105. 根據權利要求104所述的方法，其中在將所述第一混合物與所述雙官能交聯試劑 接觸後立即進行步驟（b)的溫育。
106. 根據權利要求104或105所述的方法，其中在具有約4. 0至9. 0的pH的溶液中進 行步驟（b)中的溫育。
107. 根據權利要求106所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
108. 根據權利要求106所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
109. 根據權利要求104至108中任一項所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH 溶液中進行步驟（a)中的接觸。
110. 根據權利要求109所述的方法，其中所述pH為約6. 0至8. 0。
111. 根據權利要求104至110中任一項所述的方法，其還包括在步驟（a)與（b)之間將 所述第二混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合， 以將所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出來，從而在 步驟（b)之前製備所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。
112. 根據權利要求111所述的方法，其中在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下在步 驟（a)與（b)之間進行所述第二混合物的純化。
113. 根據權利要求111或112所述的方法，其中將所述第二混合物在步驟（a)與（b) 之間經歷切向流過濾。
114. 根據權利要求104至113中任一項所述的方法，其中在步驟（c)中使用切向流過 濾。
115. 根據權利要求104至113中任一項所述的方法，其中在步驟（c)中使用吸附色譜。
116. 根據權利要求104至113中任一項所述的方法，其中在步驟（c)中使用非吸附色 譜。
117. -種用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合 劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a)將細胞結合劑與細胞毒素劑在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下接觸，以形成 包含所述細胞結合劑和所述細胞毒素劑的第一混合物，隨後將所述第一混合物與包含接頭 的雙官能交聯試劑於具有約4至約9的pH的溶液中接觸，以提供包含（i)含有通過接頭化 學地偶聯於所述細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物、（ii)游離細 胞毒素劑和（iii)反應副產物的第二混合物；和 (b)將所述第二混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合，以將所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出 來，從而製備所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。
118. -種用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合 劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細胞結合劑與細胞毒素劑接觸以形成包含所述細胞結合劑和所述細胞毒素劑的 第一混合物，隨後將所述第一混合物與包含接頭的雙官能交聯試劑在外源N-羥基琥珀醯 亞胺存在的情況下於具有約4至約9的pH的溶液中接觸，以提供包含（i)含有通過所述接 頭化學地偶聯於所述細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物、（ii)遊 離細胞毒素劑和（iii)反應副產物的第二混合物；和 (b) 將所述第二混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合，以將所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出 來，從而製備所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。
119. 根據權利要求117或118所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的溶液中 的進行步驟（a)的接觸。
120. 根據權利要求119所述的方法，其中所述pH為約6. 0至8. 0。
121. 根據權利要求117至120中任一項所述的方法，其中在步驟（b)中使用切向流過 濾。
122. 根據權利要求117至120中任一項所述的方法，其中在步驟（b)中使用吸附色譜。
123. 根據權利要求117至120中任一項所述的方法，其中在步驟（b)中使用非吸附色 譜。
124. -種用於製備包含通過接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合 劑-細胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細胞結合劑與包含化學地偶聯於接頭的細胞毒素劑的細胞毒素劑-接頭化合物 接觸，以將所述細胞毒素劑-接頭化合物共價地連接於所述細胞結合劑，從而製備包含含 有通過所述接頭化學地偶聯於細胞毒素劑的細胞結合劑的細胞結合劑-細胞毒素劑綴合 物的混合物； (b) 在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下溫育步驟（a)的所述混合物；和 (c) 將所述混合物在步驟（b)後經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、 吸附色譜或其組合，以將所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從所述混合物的其它組分純 化出來，從而製備所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的混合物。
125. 根據權利要求124所述的方法，其中通過將細胞毒素劑與包含接頭的雙官能交聯 試劑接觸以將所述細胞毒素劑共價地連接於接頭，來製備所述細胞毒素劑-接頭化合物。
126. 根據權利要求124或125所述的方法，其中在與所述細胞結合劑接觸之前純化所 述細胞毒素劑-接頭化合物。
127. 根據權利要求124或125所述的方法，其中在與所述細胞結合劑接觸之前不純化 所述細胞毒素劑-接頭化合物。
128. 根據權利要求124至127中任一項所述的方法，其中在具有約4. 0至9. 0的pH的 溶液中進行步驟（b)中的溫育。
129. 根據權利要求128所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
130. 根據權利要求128所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
131. 根據權利要求124至130中任一項所述的方法，其中在具有約4. 0至9. 0的pH的 溶液中進行步驟（a)中的接觸。
132. 根據權利要求131所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
133. 根據權利要求131所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
134. 根據權利要求124至133中任一項所述的方法，其還包括在步驟（a)與（b)之間 將步驟（a)的所述混合物經歷切向流過濾、選擇性沉澱、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合，以將所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物從所述混合物的其它組分純化出來， 從而在步驟（b)之前製備所述細胞結合劑-細胞毒素劑綴合物的純化的混合物。
135. 根據權利要求134所述的方法，其中在外源N-羥基琥珀醯亞胺存在的情況下在步 驟（a)與（b)之間進行所述混合物的純化。
136. 根據權利要求134或135所述的方法，其中在步驟（a)與（b)之間將步驟（a)的 混合物經歷切向流過濾。
137. 根據權利要求124至136中任一項所述的方法，其中在步驟（c)中使用切向流過 濾。
138. 根據權利要求124至136中任一項所述的方法，其中在步驟（c)中使用吸附色譜。
139. 根據權利要求124至136中任一項所述的方法，其中在步驟（c)中使用非吸附色 譜。
140. 根據權利要求2至139中任一項所述的方法，其中所述非吸附色譜選自 SEPHADEX?樹脂、SEPHACRYL?樹脂、SUPERDEX?樹脂和⑷〇...(;丨丨丨/樹脂。
141. 根據權利要求1至140中任一項所述的方法，其中所述吸附色譜選自羥基磷灰石 色譜法、疏水性電荷誘導色譜法（HCIC)、疏水相互作用色譜法（HIC)、離子交換色譜法、混 合模式離子交換色譜法、固定金屬親和色譜法（IMAC)、染料配體色譜法、親和色譜法、反相 色譜法及其組合。
142. 根據權利要求1至141中任一項所述的方法，其中所述細胞結合劑選自抗體、幹擾 素、白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素3(IL-3)、白細胞介素4(IL-4)、白細胞介素6(IL-6)、 胰島素、EGF、TGF- a、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF 和轉鐵蛋白。
143. 根據權利要求142所述的方法，其中所述細胞結合劑為抗體。
144. 根據權利要求143所述的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。
145. 根據權利要求143所述的方法，其中所述抗體為人源化單克隆抗體。
146. 根據權利要求143所述的方法，其中所述抗體選自huN901、huMy9-6、huB4、 huC242、曲妥珠單抗、比伐單抗、西羅珠單抗、CNT095、huDS6、利妥昔單抗、抗-⑶27L抗體、 抗-EGFRvIII抗體、抗-Cripto抗體、抗-CD138抗體、抗-CD38抗體、抗-EphA2抗體、整聯 蛋白靶向抗體、抗-CD37抗體、抗-葉酸受體抗體、抗-Her3抗體和抗-IGFIR抗體。
147. 根據權利要求1至146中任一項所述的方法，其中所述細胞毒素劑選自類美登素、 紫杉烷類、CC1065以及前述毒素劑的類似物。
148. 根據權利要求147所述的方法，其中所述細胞毒素劑為類美登素。
149. 根據權利要求148所述的方法，其中所述類美登素包含硫醇基。
150. 根據權利要求148所述的方法，其中所述類美登素為DM1。
151. 根據權利要求148所述的方法，其中所述類美登素為DM4。
152. 根據權利要求1至151中任一項所述的方法，其中所述細胞結合劑通過化學鍵被 化學地偶聯於所述細胞毒素劑，所述化學鍵選自二硫鍵、酸不穩定鍵、光不穩定鍵、肽酶不 穩定鍵、硫醚鍵和酯酶不穩定鍵。
153. 根據權利要求1至152中任一項所述的方法，其中所述雙官能交聯試劑包含可與 所述細胞結合劑的賴氨酸殘基形成醯胺鍵的反應性部分。
154. 根據權利要求153所述的方法，其中所述反應性部分為羧酸部分或反應性酯部 分。
155. 根據權利要求153所述的方法，其中所述雙官能交聯試劑包含N-琥珀醯亞胺酯部 分或N-磺基琥珀醯亞氨酯部分。
156. 根據權利要求155所述的方法，其中所述雙官能交聯試劑還包含基於馬來醯亞胺 的部分。
157. 根據權利要求155所述的方法，其中所述雙官能交聯試劑選自4-(馬來醯亞胺甲 基）環己基羧酸N-琥珀醯亞胺酯（SMCC)、N-琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基）-環 己烷-1-羧基-(6-醯氨基己酸酯）（LC-SMCC)、κ -馬來醯亞胺基十一酸N-琥珀醯亞胺酯 (KMUA)、γ -馬來醯亞胺基丁酸N-琥珀醯亞胺酯（GMBS)、N- ( β -馬來醯亞胺基丙醯氧基） 琥珀醯亞胺酯（BMPS)、ε -馬來醯亞胺基己酸Ν-羥基琥珀醯亞胺酯（EMCS)、間-馬來醯亞 胺苯甲醯基-Ν-羥基琥珀醯亞胺酯（MBS)、Ν-( α -馬來醯亞胺乙醯氧基）_琥珀醯亞胺酯 (AMAS)、6-( β -馬來醯亞胺丙醯氨基）己酸琥珀醯亞胺酯（SMPH)、4-(對-馬來醯亞胺苯 基）-丁酸Ν-琥珀醯亞胺酯（SMPB)、磺基-Mai、PEG 4-Mal、CX1-1、4_ (2-吡啶基二硫代）丁 酸N-琥珀醯亞胺酯（STOB)、4_ (2-吡啶基二硫代）戊酸N-琥珀醯亞胺酯（SPP)和4- (2-批 啶基二硫代）2-磺基丁酸N-琥珀醯亞胺酯（磺基-STOB)。
158. 根據權利要求157所述的方法，其中所述雙官能交聯試劑為4-(馬來醯亞胺甲 基）環己基羧酸N-琥珀醯亞胺酯（SMCC)、4-(2-吡啶基二硫代）戊酸N-琥珀醯亞胺酯 (SPP)或4-(2-吡啶基二硫代）丁酸N-琥珀醯亞胺酯（STOB)。
159. 根據權利要求1至158中任一項所述的方法，其中所述外源N-羥基琥珀醯亞胺對 所述雙官能交聯劑的摩爾比為約〇. 5至約1000。
【文檔編號】A61K39/395GK104093425SQ201280068773
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2012年12月13日 優先權日:2011年12月13日
【發明者】劉芳, G·W·安普萊特, D·H·梅舒拉姆 申請人:伊繆諾金公司