抗白細胞介素-15抗體的製作方法

2023-10-31 00:47:02 7

專利名稱：抗白細胞介素-15抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗體，尤其涉及一種抗白細胞介素-15抗體。
背景技術：
類風溼關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種常見病，分布於所有的種族和民族，病人遍及全球，以溫帶、亞熱帶和寒帶地區多見，熱帶地區少見。在氣溫和溼度變化大的北歐、美國、英國、瑞典、義大利、法國、俄羅斯、芬蘭等國家和地區較多。據美國健康中心的調查，全美約有400-500萬人患有類風溼關節炎。國外統計的發病率為0.5%-3%。現我國與國際風溼病學學會聯盟合作進行了類風溼關節炎、強直性脊柱炎的流行病學調查，初步結果是，我國類風溼關節炎的患病率約為0. 8-1.0% ；漢族的患病率明顯高於其他民族； 女性患病多於男性。按此粗略計算，我國大約有1000-1400萬類風溼關節炎病人。我國每年因RA就診人數超過900萬人次，住院患者超過25萬次。RA造成的勞動能力喪失所導致的經濟損失，並給家庭帶來沉重的負擔。在病理上，類風溼關節炎是以慢性多關節滑膜炎、骨及軟骨破壞為主要特徵的全身性自身免疫性疾病，其主要標誌是滑膜中白細胞浸潤。表現為對稱性的多關節的腫脹、 疼痛、晨僵，體重減輕以及全身多系統的受累。這種炎症過程能夠刺激抗凋亡成纖維樣滑膜細胞(FLS)的增殖。這樣直接導致形成血管翳和關節損傷以及關節內致炎症細胞因子， 如TNF-α (腫瘤壞死因子)的表達。類風溼關節炎的發病機理尚無定論。目前研究認為， 許多細胞因子(如TNF-α、白細胞介素15(interleukin-15，IL-15)、血小板衍生生長因子 (platelet-derived growth factor, PDGF)等)在RA的發病過程中起著重要的作用。在我國，治療RA的藥物，主要有非甾體抗炎藥(NSAIDS)、慢性抗風溼藥(DMARDS) 以及中藥類。極少部分患者能使用昂貴的生物製劑類藥物治療類風溼關節炎。甲氨蝶呤(MTX)作為治療類風溼性關節炎的經典藥物，能抑制二氫葉酸還原酶及甲醯基轉移酶活性。來氟米特是一種具有抗增生活性的異唑類免疫抑制劑，其作用機制主要是抑制二氫乳清酸脫氫酶的活性阻斷嘧啶的從頭合成途徑。此外，帕夫林對類風溼關節炎也有一定的療效。但這類藥物的問題在於患者會產生許多對藥物的不良反應，同時大多數病人都要經歷一個慢性的反覆的病程，因而，如何更有效地控制類風溼關節炎患者的病情仍是一個大問題。而中藥(如雷公藤、青風藤等)治療類風溼性關節炎的有效性更是一個棘手問題。在歐美國家，類風溼關節炎患者則能得到三種抗體類藥物etanerc印t(商品名 Enbrel), infliximab (商品名 Remicade), adalimumab (商品名 Humira)的有效治療。此三種抗體類藥物均作用在TNF-α這一靶標。對許多患者有著非常令人滿意的療效。許多患者經治療後，症狀完全消失。因此，抗體類藥物治療類風溼關節炎有其獨到之處。但上述三種藥物對約50%的患者仍然不起作用，說明該部分患者的發病機理原因不是TNF-α。因此，研究開發不同靶標的抗體類藥物有著很深遠的意義。一方面打破歐美國家的技術封鎖壟斷、獲得我們的自主智慧財產權，另一方面我們也可以藉此進入和瓜分歐美市場，再一方面我們可以降低成本生產和銷售與我國患者消費水平相適應的治療類風溼關節炎全人源抗體藥物。白細胞介素-15(interleukin-15，IL-15)是一種非常重要的致炎症細胞因子， 由巨噬細胞、樹突狀細胞、角質化細胞與上皮細胞產生。它屬於4-α-螺旋束細胞因子家族。IL-15能夠活化多種免疫細胞、刺激它們增殖並延長其壽命IL_15能夠誘導T細胞增殖和細胞因子的產生，刺激正常T細胞的遷移與趨化，以及保護它們免除凋亡；能夠增強NK 細胞的細胞毒性和依賴抗體介導的細胞毒性作用，延長NK細胞的壽命並促進NK細胞分泌 IFN- y、GM-CSF和TNF- α ；能夠誘導B細胞的增殖和同族型轉換(效應B細胞向漿細胞的轉換)；IL-15還能夠促進CTL(細胞毒性T淋巴細胞)記憶細胞的產生。大量的實驗表明， 多種細胞中IL-15與IL-15R(S卩IL-15受體)之間的相互作用能夠誘導產生級聯信號轉導。 其中包括Janus激酶(Jak)和STA T途徑轉錄激活子的活化。IL-15在許多疾病反應如超敏反應、移植排斥反應、自身免疫性疾病中具有重要的致炎症反應作用。英國Mclrmes研究組、Harada及同事、Bykovskaia等、以及 Gonzalez-Alvaro等均報導類風溼關節炎患者在滑膜液、滑膜及血清中能顯著檢測到高水平的IL-15。IL-15導致RA的機理部分可能是通過TNF-α起作用，而Ziolkowska等報導 IL-15可能是通過調節IL-17而導致類風溼關節炎。丹麥Genmab生物醫藥公司與英國Glasgow大學關節炎中心的Mchnes研究組、丹麥Rigs醫院、丹麥Frederiksberg醫院、英國倫敦Guy醫院及瑞典Karolinska醫院等密切合作，利用全人源IL-15的單克隆抗體進行了治療類風溼關節炎的臨床試驗，結果取到令人比較滿意的效果。

發明內容
本發明提供了一種特異性高的抗白細胞介素-15抗體。一種抗白細胞介素-15抗體，包括重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區的三個高變區 CDRHU CDRH2、CDRH3 的胺基酸序列分別為GFTFSSYAM、AISGSGGTTYYADSVKG、 AWAPFVNSIVVVTANDL，所述輕鏈可變區的三個高變區⑶RL1、⑶RL2、⑶RL3的胺基酸序列分別為RASQGISTWLA、AASSLQS、QQANSFPI。所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述抗體可以是全抗體、抗體片段或單鏈抗體。本發明還提供了編碼上述抗體的基因。本發明還提供了上述抗白細胞介素-15抗體在製備抑制IL-15誘導的T細胞增殖藥物中的應用本發明抗白細胞介素-15抗體特異性高，製備過程相對簡單，成本低廉。


圖1為本發明抗白細胞介素-15單鏈抗體的結構示意圖；圖2為實施例6誘導表達產物純化前後的凝膠電泳圖，第1道為純化前，第2道為純化後；
圖3為實施例7本發明抗體濃度與OD45tl關係曲線圖；圖4為實施例8中T細胞與各抗體混合培養後數量分布圖，讀數為CPMxIO3 ； #IL15-3為本發明的抗IL-15單鏈抗體；Abl6為非特異性單鏈抗體；mAb為鼠抗人IL-15抗體(購自R&D Systems公司)。
具體實施例方式本發明採用專利申請01813639. 7公開的方法構建人單鏈抗體文庫，並在人單鏈抗體文庫中篩選IL-8抗體，具體實施過程如下實施例1逆轉錄和擴增得到人抗體重鏈和輕鏈DNA以來自人骨髓、人胎肝、人脾和人外周血白細胞的polyA+RNA(購自Clontech)為模板，並使用從Clontech購得的逆向轉錄酶試劑盒，以oligo(dT)和隨機引物(random primers)為引物，根據Clontech試劑盒所提供的方法指南，將poly A+RNA逆向轉錄成 cDNA。以上述cDNA為模板，使用一系列識別人抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)基因的引物，應用PCR法擴增人抗體中所有的重鏈和輕鏈的可變區。一系列識別人抗體重鏈和輕鏈可變區基因的引物序列如下 C(C/T) GG
GG
G) GC
第一組人抗體重鏈可變區(VH)基因的5』 -端引物
VHlb 5' CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TC(C/G)G VH2b 5' -CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA VH3b 5' -CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG G VH4b 5' -CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GAG GTG CAG CTG(G/T)TG GAG(A/T)
VH5b 5' -CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTC CAG CT (G/T)GT(A/G)CAG TCT
VH6b VH7b
-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC -CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC
CAG(A/G)TC ACC TTG AAG GAG TCT G CAG GTG CAG CTG GTG (C/G)A (A/G)TCT第=Ja人抗體重鏈可變區(VH)基因的3'』-端引物
VHlf:5''-GCCGCCTGATCCACC ACCGCCTGA GGA GAC(A/G)GTGACCAGGGT G
VH2f:5'『-GCCGCCTGATCCACC ACCGCCTGA GGA GACGGTGACCAGGGTT
VH3f:5'『-GCCGCCTGATCCACC ACCGCCTGA AGA GACGGTGACCATTGT
VH4f:5'『-GCCGCCTGATCCACC ACCGCCTGA GGA GACGGTGACCGTGGTCC
VH5f:5'『-GCCGCCTGATCCACC ACCGCCGGT TGG GGCGGATGCACTCC
VH6f:5'『-GCCGCCTGATCCACC ACCGCC(C/G) GA TGG GCC CTT GGT GGA (A/
第三組 VLlb 5!
CCG CCVL2b 5 CCA C
人抗體λ-輕鏈可變區(V λ)基因的5』 -端引物
-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG TCT GT(C/G)(C/G/T)TG ACG CAG
-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TAT G(A/T)G CTG AC(Α/Τ) CAG
VL3b5'『-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TAT GAG CTG A (C/T)(A/G) CAGC(C/T)ACCVL4b5'『-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG CCT GTG CTG ACT CA (A/G) (C/T)CVL5b5'『-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG (A/G/T)CT GTG GTG AC (C/T) CAGGAG CCVL6b5''-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG CC (A/T) G (G/T) G CTG ACT CAGCC (A/C)CCVL7b5''-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TCT GAG CTG A(C/G)T CAG GA(C/G) CCVL8b5'-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG TCT G (C/T)(C/T)CTG A(C/T)T CAGCCTVL9b5''-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT AAT TTT ATG CTG ACT CAG CCC C第四組:人抗體λ-輕鏈可變區(V λ)基因的3』 -端引物VLlf5'『-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TAG GAC GGT (C/G)A (C/G)CTT GGT CCVL2f5'『-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA GAG GAC GGT CAG CTG GGT GC第五組人抗體k-輕鏈可變區(Vk)基因的5』 -端引物VKlb5'『-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAC ATC C(A/G)G (A/G/T)TG ACC CAG
TCT CCVK2b5'『-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAA ATT GT(A/G)(A/T)TG AC(A/G)CAG
TCT CC
VK3b5'-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAT ATT GTG (A/C)TG AC(C/G/T)CAG(A/
Τ)CT CCVK4b5'『-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT C第六 a人抗體k-輕鏈可變區(Vk)基因的3』 -端引物VKlf5'『-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCVK2f5'『-GGG GTT TTT CAGTAT CTA CGA TTT GAT CTC CA(C/G)CTT GGT CCVK3f5'『-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT ATC CAC TTT GGT CCVK4f5'『-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT AAT CTC CAG TCG TGT CCPCR法擴增人抗體中的重鏈可變區(VH)時應用上述第一組引物與第二組引物的組合，即有42個PCR反應。類似地，擴增人抗體中的λ-輕鏈可變區(V λ)時應用上述第三組引物與第四組引物的組合，即有18個PCR反應。擴增人抗體中的k輕鏈可變區(Vk) 時應用上述第五組引物與第六組引物的組合，即有20個PCR反應。第1組引物中包含有酵母雙雜交載體pACT2(Hua SB, Luo Y，Qiu Μ, Chan Ε, Zhou H, Zhu L. (1998)Gene. 215 :143-152.)(Hua SB,Qiu M,Chan E，Zhu L，Luo Y. (1997)Plasmid 38:91-96.)多克隆位點上遊的同源序列(下劃線部分)；第4組和第6組引物中包含有與酵母雙雜交載體PACT2多克隆位點下遊的同源序列(下劃線部分)；而第2組、第3組和第 5組引物中包含有連接肽(linker)的序列(下劃線部分)。連接肽用於連接抗體的重鏈和輕鏈的可變區。PCR法擴增人抗體中所有的重鏈和輕鏈可變區的反應條件如下
5. 0 μ 1 PCR 緩衝液(IOx)1. 0μ 1 3，_ 端引物(10 μ Μ)1. Ομ 1 5，_ 端引物(10 μ Μ)5· O μ 1 cDNA 底物1. Ομ 1 dNTP(IOmM)36 μ 1 水1. O 單位 Taq 聚合酶(Clontech 生產)將上述各組分混合均勻後置於PCR儀(Applied BioSystems公司)中進行反應。 PCR反應的參數為解鏈94°C，1分鐘、退火50°C，1分鐘、延伸72°C，2. 5分鐘、循環30次。實施例2連接載體多克隆位點的同源序列和連接肽序列以實施例1中PCR所得的人抗體重鏈可變區DNA為模板，以引物7和引物8為上遊引物和下遊引物，採用PCR法進行擴增，反應條件同上。引物7序列為載體pACT2多克隆位點的上遊同源序列，引物8序列為連接肽反鏈序列。弓丨物7 (pACT2上遊同源序列)5，-ACC CCA CCA AAC CCA AAA AAA GAG ATC TGT ATG GCT TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC引物8 (連接肽序列反鏈)5，-ACT GCC TCC ACC ACC GCT GCC ACC TCC GCC AGA TCC TCC GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC以實施例1中PCR所得的人抗體輕鏈可變區DNA為模板，以引物9和引物10分別為下遊引物和上遊引物，採用PCR法進行擴增，反應條件同上。引物9為載體pACT2多克隆位點的下遊同源序列，引物10為連接肽順鏈序列。弓丨物9 (pACT2下遊同源序列)5，-GAG ATG GTG CAC GAT GCA CAG TTG AAG TGA ACT TGC GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA引物10 (連接肽序列順鏈)5，-GGC GGT GGT GGA TCA GGC GGC GGA GGA TCT GGC GGA GGT GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT實施例3將人抗體重鏈和輕鏈DNA通過連接肽序列連接成單鏈抗體將實施例2中PCR擴增得到的含載體pACT2多克隆位點的同源序列和連接肽序列的人抗體重鏈可變區DNA和輕鏈可變區DNA混合。以該混合DNA為模板，以引物7和引物 9分別為上遊引物和下遊引物，進行PCR擴增，得到包括人抗體重鏈DNA序列、輕鏈DNA序列、載體PACT2多克隆位點同源序列以及連接肽DNA序列的單鏈抗體(scFv)DNA，反應條件同實施例1。實施例4構建人單鏈抗體(scFv)基因文庫上述實施例3所述的單鏈抗體(scFv)DNA兩側接有酵母雙雜交載體 pACT2 (Clontech公司生產)多克隆位點兩側的同源序列。將上述實施例3所述的單鏈抗體(scFv) DNA與經限制性內切酶(Bam HI和Eco RI)處理後的酵母雙雜交載體pACT2按照Clontech公司提供的方法(Yeast Protocol Handbook, PT3024-1)將其共同轉化進入酵母菌株丫187(基因型獻10，ura3-52, his3_200，ade2_101，lys2-801, trp 1-901, leu2_3， 112，gal4A, gal80 Δ，URA3: :GALlUAS-GALlTATA_lacZ)內，經細胞內同源重組後將單鏈抗體(scFv)DNA整合到pACT2載體上，從而得到酵母雙雜交單鏈抗體(scFv)文庫。單鏈抗體 (scFv)DNA片段與pACT2載體上的激活區域(Activation Domain, AD)融合在一起。為檢查這個人單鏈抗體(scFv)文庫的質量，隨機挑出了 21個克隆。對插入片段測序分析表明所有克隆都包括與融合在一起的單鏈抗體(scFv)DNA片段(數據未顯示)，而且所有單鏈抗體(scFv)DNA序列都是獨特的。上述經同源重組而得到酵母雙雜交單鏈抗體(scFv)基因文庫中抗體DNA拷貝數大約有1 X IO8個，可應用於酵母雙雜交技術篩選特定的抗體。實施例5篩選抗體使用人白細胞介素-15(IL15)作為抗原對酵母雙雜交單鏈抗體scFv文庫進行篩選。將編碼人IL-15的DNA克隆進入載體pGBKT7 (Clontech公司)構建出pGBK_IL15。 PGBK-IL15編碼Gal4 DNA結合區域(Binding Domain,即BD)並融合人IL-15在其C端。在編碼人IL-15的DNA序列得到驗證後，pGBK_IL15質粒DNA轉化進酵母菌株 AH109 (基因型 MATa，ura3-52, his3_200，ade2_101，trp 1-901, leu2_3，112，gal4A , gal80 Δ，LYS2: :GALIuas-GALItata-HIS3, GAL2uas_GAL2tata_ADE2，URA3: :MELIuas_MELlTATA_lacZ) (Clontech公司)。帶有pGBK_IL15質粒的AH109酵母可在不含色氨酸的合成培養基 (SD/-W)上生長。將等量的含有pGBK-IL15的MAI1a型酵母細胞(AH109菌株)與包含單鏈抗體scFv 文庫的ΜΑΤα型酵母細胞(Υ187菌株)進行共同培養時，此二型細胞即可交配結合。載有 scFv文庫的pACT2載體含有LEU2基因，pGBK_IL15包含TRPl基因。包含兩種質粒的酵母細胞可以生長在不含亮氨酸和絲氨酸的酵母合成培養基(SD/-LW)。存在scFv/IL-15相互作用的細胞會激活整合在菌株基因組中的報告基因ADE2和HIS3，從而使得酵母細胞可以生長在缺乏腺嘌呤，組氨酸，亮氨酸和色氨酸的培養基(SD/-AHLW)上，並在該平板培養基上形成菌落。我們在上述篩選培養基(SD/-AHLW)上總共挑選出23個菌落。然後，對這些菌落進行進一步的分析。首先，按Clontech公司的方法使用β半乳糖苷酶檢測法檢測IacZ表達。存在 scFv/IL-15相互作用的細胞也會激活整合在菌株基因組中的另一報告基因lacZ，從而能測得酵母細胞內表達的β半乳糖苷酶。檢測酵母細胞β半乳糖苷酶的方法如下(1)上述酵母在篩選培養基(SD/-AHLW)平板上生長。(2)將酵母菌落轉移到Whatman五號濾紙上。(3)將帶有酵母細胞菌落的濾紙浸入液氮之中，使細胞破裂。(4)將濾紙從液氮中取出，並置於30°C的烘箱內。重複步驟3和4 二次。(5)將濾紙鋪於適量的X-gal溶液中，並置於37°C的溫箱內約15分鐘。若帶有菌落處顯示藍色，表明為β半乳糖苷酶陽性。X-gal溶液配方如下16. lg/L Na2HPO4 · 7H205. 50g/L NaH2PO4 · H2O
0. 75g/L KCl0. 246g/L MgSO4 · 7H2035mg/L X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β -D-galactopyranoside)5mM β-巰基乙醇pH7. 0檢測結果上述挑選出的23個菌落中有11個是β半乳糖苷酶陽性的，表明在這些菌落的細胞內另一報告基因IacZ也被激活了。其次，對上述11個β半乳糖苷酶陽性菌落的scFv進行特異性分析，以確定單鏈抗體scFv是特異性地與IL-15部分結合，而不是與其它部分。將含有scFv的pACT2質粒 DNA從上述11個β半乳糖苷酶陽性的酵母中提取出來。並分別與pGBKT空載體DNA，或與含有編碼融合&114-DNA結合區(BD)和人核纖層蛋白C編碼序列的質粒pGBKT-Lan^Clontech 公司)的DNA，共同轉化到AH109酵母細胞內。轉化後的酵母細胞先鋪於SD/-LW平板培養基上生長，然後轉移到SD/-AHLW平板培養基上。並進一步使用β半乳糖苷酶分析。經上述方法對scFv進行特異性分析後，我們得到5個對人IL-15具有特異性的單鏈抗體ScFv0然後，對上述5個對人IL-15具有特異性的單鏈抗體scFv進行測序分析。使用 ABI自動測序儀測定scFv的DNA序列。分析這些單鏈抗體scFv克隆的序列表明有二個不同的抗人白細胞介素-15的單鏈抗體。其中與克隆號#IL15-3相同的有2個，而與克隆號 #IL15-7相同的則有3個。克隆號#IL15-3的單鏈抗體的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，DNA序列如 SEQ ID N0. 3所示；VL的胺基酸序列如SEQ ID N0. 2所示，DNA序列如SEQ ID N0. 4所示。重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO. 1)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSffVRQAPGKGL EffYSAISGSGGTTYYADSYKGRF TISRDNSKNTLYLQMNNLRVEDTAV YYCAKAffAPFYNSIYYYTANDLffGQGTLYTYSS下劃線部分依次為重鏈可變區中的三個高變區⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3的胺基酸序列。輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID N0. 2)DIQLTQSPS SVSASV⑶RVTITCRASQGISTffLAffYQQKPGKAPKL LIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPITF GQGTRLEIK下劃線部分依次為輕鏈可變區中的三個高變區⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3的胺基酸序列。實施例6抗體表達與純化將抗人IL-15的單鏈抗體scFv的DNA克隆到蛋白質表達載體中pET27b⑴ (Novagen公司)而得到pET27b_IL15。克隆後的pET27b_IL15，在scFv的N端是pelB序列 (可將表達後的scFv蛋白質分泌到表達細菌E. coli的周質腔periplasmic space中)，而 C端含有一段編碼HSV標記物和一個6x His標記物(可用於蛋白質的純化)的序列。將 pET27b-IL15轉化入蛋白質表達細菌Ε. coli菌株BL21 DE3 (Novagen公司)。並按照該公司提供的方法用IPTG(濃度0. 5mM)誘導表達和分離抗人IL-15的單鏈抗體scFv蛋白質。
因為scFv蛋白質的C端含有一個6x His標記物，可以應用Qiagen公司所提供的方法方便地用Ni-NTA柱(Qiagen公司)來純化scFv蛋白質。純化前後蛋白質用SDS-PAGE 凝膠電泳的分析，結果如圖2所示。實施例7酶標免疫法(ELISA)測試抗IL15的scFv特性重組人IL-15的蛋白質購自美國R&D Systems公司。用於酶標免疫法(ELISA)的 96-孔板(MaxiSorp板)購自Nunc公司。方法如下(1)上述96-孔板首先用IL-15包被。(2)包被後的96-孔板再用SuperBlock(購自Pierce公司)作封閉處理。(3)純化了的抗IL-15單鏈抗體在0.02% BSA中作系列稀釋後加入已包被有 IL-15的96-孔中，與IL-15結合。(4)將96-孔板清洗後，在96-孔中再加入稀釋了 5000倍的鼠抗HSV標記物的抗體(購自Novagen公司)用來檢測結合了的單鏈抗體(注在scFv的C端含有一個HSV標記物)。(5)將96-孔板清洗後，在96-孔中再加入稀釋了 10000倍的山羊抗鼠IgG抗體並偶聯有HRP (辣根過氧化物酶)的偶聯物(購自Sigma公司)。(6)將96-孔板最終清洗後，應用購自Sigma公司的HRP底物TMB試劑作顯色處理。(7)最後，反應用0. 5M的硫酸終止，並檢測450nm的吸收光譜。結果如圖3所示，結果說明克隆號#IL15_3單鏈抗體能有效地結合IL-15。實施例8測試scFv抑制IL-15誘導的T細胞增殖測試純化後的抗IL-15單鏈抗體的對IL-15誘導⑶8+T細胞增殖的抑制作用。實驗步驟如下(1)每孔2. 5X IO4個分離後的⑶8+T細胞培養在96孔細胞培養板中。培養基為 RPMI-1640+10% FCS (胎牛血清)。重組人IL-15的蛋白質(濃度為IOpM)與上述純化後的抗IL-15單鏈抗體(InM)或鼠抗人IL-15抗體(購自R&D Systems公司)(InM)混合在
培養基中。(2)在37°C的(X)2培養箱內培養72小時。(3)每孔中加入0. 5 μ Ci的[3H]-胸腺嘧啶。在37°C的(X)2培養箱內繼續培養6 小時。(4)用RPMI-1640培養基洗三遍後，將細胞收集，再用液體閃爍儀計數，重複三次， 取平均。結果如圖4所示，所獲得的抗IL-15單鏈抗體#IL15_3能有效抑制IL-15誘導 ⑶8+T細胞增殖作用。
權利要求
1.一種抗白細胞介素-15抗體，包括重鏈可變區和輕鏈可變區，其特徵在於，所述重鏈可變區的三個高變區⑶RHl、⑶RH2、⑶RH3的胺基酸序列分別為GFTFSSYAM、 AISGSGGTTYYADSVKG、AffAPFVNSIVVVTANDL,所述輕鏈可變區的三個高變區 CDRL1、CDRL2、 CDRL3 的胺基酸序列分別為 -RASQGISTWUUAASSI^QSaQQANSFPI。
2.根據權利要求1所述的抗白細胞介素-15抗體，其特徵在於，所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.根據權利要求1所述的抗白細胞介素-15抗體，其特徵在於，所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.根據權利要求1所述的抗白細胞介素-15抗體，其特徵在於，所述抗體為單鏈抗體。
5.編碼權利要求1 4任一所述抗白細胞介素-15抗體的基因。
6.權利要求1 4任一所述抗白細胞介素-15抗體在製備抑制IL-15誘導的T細胞增殖藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抗白細胞介素-15抗體，包括重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區的三個高變區CDRH1、CDRH2、CDRH3的胺基酸序列分別為GFTFSSYAM、AISGSGGTTYYADSVKG、AWAPFVNSIVVVTANDL，所述輕鏈可變區的三個高變區CDRL1、CDRL2、CDRL3的胺基酸序列分別為RASQGISTWLA、AASSLQS、QQANSFPI。本發明抗白細胞介素-15抗體特異性高，製備過程相對簡單，成本低廉。
文檔編號A61K39/395GK102250243SQ201110184280
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月1日 優先權日2011年7月1日
發明者餘乃絢, 侯偉, 華紹炳 申請人:華紹炳