一種分離魚類反轉座子SINEs的方法
2023-10-09 07:20:09
專利名稱:一種分離魚類反轉座子SINEs的方法
一種分離魚類反轉座子SI NEs的方法技術領域
本發明屬於分子生物學領域,涉及利用魚類基因組內反轉座子SINEs起源的特殊性、及其在基因組內的分布特點,選擇特定的DNA序列設計獨特的引物,運用分子克隆的方法,分離魚類基因組內含有反轉座子SINEs的目的片段。
背景技術:
反轉座子SINE的基本結構一般由三部分組成5』端的頭部、軀幹部和尾部。頭部為RNA相關區,衍生於相應的7SL RNA,tRNA或者5S rRNA ;軀幹部來源不明,且長度也有變化;尾部為長度可變的具有簡單重複序列區。在真核生物基因組中,SINE大約為IO3-1O5拷貝數,長度一般在100-600bp之間。SINEs通過RNA聚合酶III轉錄為RNA,經反轉錄酶作用形成的cDNA隨機插入到基因組中,引起宿主基因組的突變,可作為一種有應用價值的分子標記,應用於物種鑑定和生物進化方面的研究。SINE的插入與特定的重組相關聯,影響機體的應激反應和基因調控,同時,SINE插入的拷貝可成為宿主基因組的啟動子、增強子,沉默子和功能基因的來源。已有研究表明,儘管屬於同一家族的SINE,但其拷貝間的序列差異較大,最高可達35% ;不同科屬的生物類群,具有特定的SINE ;這此特性為克隆生物基因組內的SINE帶來了困難。
目前,較為有效的分離生物基因組內的SINE的方法6種l、pre-mRNA法。原理是利用SINE互補的pre-mRNA具有長發卡結構特點,首先獲得發卡序列並用作探針,然後掃描基因組文庫,找到SINE的全序列。2、基因組重複序列雜交法。利用SINE為大量拷貝而基因為單拷貝的特點,將標記的基因組DNA與基因組文庫相雜交,去掉基因序列,找出重複序列的陽性克隆,然 後再多次雜交,測序,過濾基因序列,最終得到SINEs。3、體外轉錄法。以基因組DNA為模板,使用RNA聚合酶III進行體外轉錄,獲得RNA並標記成探針,與基因組文庫雜交,篩選陽性克隆,測序,獲得SINE。4、A-B PCR法。以RNA聚合酶III的Box A和 Box B序列設計I對引物(A和B) ,A-B PCR擴增得到tRNA相關的約50bp的核心序列,該序列標記成探針,與基因組文庫雜交,篩選出SINEs。5、A-PCR法,也稱改進的A-B PCR法。引物A在基因組內進行PCR,彌散的PCR產物構建文庫,A-B PCR產物標記後掃描該文庫,篩選陽性克隆並測序,獲得BoxA下遊序列;根據已知序列設計正反引物,標記PCR產物並用作探針,掃描基因組文庫,得到全長的SINEs序列。6、磁珠富集法。該方法以A-B PCR法為基礎,獲得約50bp的核心序列,再以反向PCR法獲知核心序列兩側序列,以該序列為探針,通過生物素標記使此序列與磁珠耦合,然後與基因組文庫雜交,捕獲並分離基因組內SINEs。
以上用於分離SINE的方法,關鍵在於SINE核心序列的特異性,但所涉及獲取核心序列的步驟都較為繁鎖,且僅適用於特定的生物類群。本發明利用兩次單引物PCR,無需體外轉錄、掃描基因組文庫、或反向PCR,便能實現快速有效的分離魚類SINE的核心序列,以此序列標記為探針,通過該探針與基因組文庫雜交或與磁珠耦合後再與基因組文庫雜交, 將可獲得魚類SINE全長序列。發明內容
本發明旨在提供一種基於PCR分離魚類基因組DNA中SINE的方法,該方法簡單, 通過兩次單引物PCR擴增,就能直接獲取基因組DNA中SINE的片段。
本發明是通過以下技術方案實現上述發明
①實驗材料鯡形目觸科魴屬的刀魴Coilia nasus、鳳魴C. mystus和七絲魴 C. grayi ;黃鯽屬的黃鯽Setipinna taty ;稜觸屬的赤鼻稜觸Thrissa kammalensis ;小公魚屬的中華小公魚Anchoviella Chinensis0鯰形目鱷科黃顙魚屬黃顙魚Pelteobagrus fulvidracoo S盧形目彈塗魚科大彈塗魚屬大彈塗魚Boleophthalmus pectinirostris。
②提取DNA :剪取一小塊新鮮的肌肉組織(約50g),用DNA裂解酶56°C水浴消化 2-3小時,然後按照上海生工的UNIQ-1O柱式基因組DNA提取試劑盒進行操作,I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA質量,_20°C保存備用。
③引物B設計(見附圖1):根據不同魚類的 tRNA的聚合酶III的Box B序列高度保守性特點,設計I個獨特引物B,由上海生工公司合成,弓丨物序列5』 -GAGGAYTTGAACC-3』。
④B-PCR :使用 Eppendorf Mastercycler (Eppendorf, German) PCR 儀進行擴增,每個反應體積為50ul,包含基因組DNA 100叩,(1見13各0.41,引物0.51^&9酶21反應程序為:94°C預變性2min ;94°C變性30s,44°C退火45s,72°C延伸lmin,共30個循環;最後72°C 延伸lOmin。PCR產物經I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(見附圖2),選取刀鱭約300bp、500bp和 IOOObp的電泳條帶進行克隆和測序分析。
⑤引物A設計(見附圖1):根據步驟④獲得的序列,比對分析BoxA序列,設計單引物A,引物序列為5』 -TGGCCTAGTGG-3』,由上海生工公司合成。
⑥A-PCR=PCR反應條件、體系及程序似同步驟④,僅退火溫度稍有差異,為43°C。 PCR產物經I %瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見附圖3。
⑦序列分析選取刀魴約500bp、700bp、IOOObp和1400bp的條帶進行大腸桿菌 DH5a克隆,隨機挑取克隆由上海生工公司進行測序。序列特點分析(附圖3)可見,具有生物基因組DNA中SINE的基本結構特徵,SINE的頭部包括Box A和Box B兩個結構域,軀幹部為一個變化區,尾部具有正向重複序列或poly (A/T)。
綜上所述,運用此實驗方法,可擴增出魚類基因組DNA中的反轉座子SINEs,將可進一步用於基因工程、分子標記和生物進化方面的研究。
圖1是分離SINE的B-PCR和A-PCR弓丨物設計示意圖
圖2是魚類基因組B-PCR (左)和A-PCR (右)擴增產物電泳圖。
電泳圖譜中O :空白對照;M :分子量標準;1 :彈塗魚;2 :黃顙魚;3 :中華小公魚;
4 :赤鼻稜鍉;5 :黃鯽;6 :七絲鱭;7 :鳳鱭;8 :刀鱭
附圖3A-PCR擴增的刀鱭SINE家族不同元件的序列比對。實框SINE的Box A和 Box B ;虛框正向重複序列;下箭頭略去了一段插入序列;單、雙下劃線局部正向重複;波浪線poly(A/T)或可 能的poly(A) 鹼基缺失。
權利要求
1. 一種分離魚類基因組DNA的SINE的方法,其特徵在於使用一個引物 B(5』 -GAGGAYTTGAACC-3』 )對基因組進行第1次PCR擴增,擴增產物克隆測序;使用一個引 物A (5』 -TGGCCTAGTGG-3』)對基因組進行第2次PCR擴增,擴增產物克隆測序,分析序列特 點,獲得SINEs。
全文摘要
本發明公開了一種基於PCR方法分離魚類基因組DNA中的反轉座子SINEs的方法,本發明包括2次PCR擴增和2次克隆測序,具體步驟如下①使用一個引物B對魚類基因組DNA進行第1次擴增,回收擴增產物並克隆測序;②使用一個引物A對魚類基因組DNA進行第2次擴增,回收擴增產物並克隆測序,分析序列特點,獲得目的基因。該方法提供了一種快速、簡便、高效的分離魚類SINE的新途徑。
文檔編號C12N15/10GK103013990SQ20111028977
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月27日 優先權日2011年9月27日
發明者劉 東, 朱國利, 唐文喬, 郭弘藝 申請人:上海海洋大學