一種轉基因萊茵衣藻生物反應器的構建方法

2023-10-09 07:22:34

專利名稱：：一種轉基因萊茵衣藻生物反應器的構建方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，涉及一種轉基因生物反應器的構建方法，具體是利用萊茵衣藻構建轉基因藻類生物反應器，可實現快速、廉價生產各種藥用蛋白質、可食性疫苗、具有生物學活性的次生代謝產物、工業原料等。
背景技術：
：DNA重組技術是二十世紀七十年代在大腸桿菌表達系統中發展起來的。隨著現代分子生物學技術的不斷發展完善，外源基因的高效表達已經成為基因工程製藥、基因診斷與治療、現代農業和工業原材料生產的重要生物技術手段。研究開發出適應不同技術需求的各種外源基因高效表達系統已經成為現代生物技術的熱點問題。目前比較成熟的幾個外源基因表達系統雖然都有其各自的優勢，但仍然存在各種不足大腸桿菌表達系統雖然表達量大，但產物大多以包涵體形式存在，且不能進行糖基化修飾；酵母表達系統解決了真核基因的產物糖基化問題，但也存在甲醛誘導物的毒性、產物乙醇累積及發酵底物的高成本等問題；高等植物表達系統能利用植物光合作用產物作為生產外源蛋白的底物，但其生產周期長，佔地空間大。於是人們想到利用藻類作為外源基因表達系統來表達外源蛋白。因為藻類既能象高等植物一樣進行光合作用，解決發酵底物問題，又能象細菌一樣進行集約化生產。目前比較成熟的藻類外源基因表達系統是藍藻表達系統，但藍藻屬於原核生物，同細菌一樣不能進行真核基因表達產物的糖基化修飾，同時藍藻細胞壁較厚使表達產物難於分離，胞外多糖豐富，純培養較困難等。人們開始利用單細胞真核藻類來作為外源基因表達系統，例如中國專利「轉基因小球藻的高效生物反應器」(專利號ZL97112189.3)，以及中國專利「轉基因鹽藻生物反應器」(專利號ZL00131217.0)。這些真核藻類表達系統實現了真核基因表達產物的糖基化修飾，但仍存在以下需改進之處(1)表達系統不穩定，表達水平達不到商業化應用的需求；(2)藻類遺傳背景不夠清楚，達不到外源基因定點整合的要求；(3)藻類細胞內無足夠表達產物儲藏場所，高表達會嚴重影響藻類生長。萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)屬於綠藻門團藻目衣藻科，是一種單細胞真核鞭毛藻類，是研究多種生命活動(如光合作用、鞭毛組裝、趨光性和生理節律等)的模式生物，與酵母細胞有許多共同的特徵，素有「光合酵母」之稱。萊茵衣藻的細胞呈卵形，有細胞壁、細胞質和細胞核；細胞質裡有一個大型杯狀葉綠體，佔整個細胞體積的40-60％。細胞前部偏在一側的地方有一個紅色的眼點，眼點對光線的強弱很敏感。萊茵衣藻細胞的前端有兩根鞭毛，能夠擺動，因此可以在水中自由遊動。萊茵衣藻的全身都能夠吸收溶解在水中的二氧化碳和無機鹽，並且能夠依靠眼點的感光和鞭毛的擺動，遊到光照和其他條件都適宜的地方，進行光合作用，維持自己的生活。它具有無性生殖、有性生殖兩種方式，有光能自養、異養及光能異養3種不同的營養生長方式，其生長速度快且光合效率高。在20世紀80年代中後期，關於衣藻同源基因的轉化、表達和調控有大量報導，但外源基因表達沒有成功。直到90年代初期才出現關於萊茵衣藻外源基因遺傳轉化與表達的報導(Halletal，ExpressionofaforeigngeneinChlamydomonasreinhardtii，Gene，124(1993)75-81)，多為利用報告基因和篩選基因進行轉基因研究，表達量很低且不穩定。在90年代中後期出現了外源篩選基因在衣藻中的穩定表達(Stevensetal，ThebacterialphleomycinresistancegenebleasadominantselectablemarkerinChlamydomonas.MolGenGenet251(1996)23-30)，這為外源基因在萊茵衣藻中的表達提供了基礎。國內也出現了利用萊茵衣藻表達外源基因的報導(zhangetal，NS3-CChimericAntigenGeneofHepatitisCViruswasIntroducedSite-specificallyintoChloroplastGenomeofChlamydomonasreinhardtii，Hereditas，1999，21(6)1-6；wangetal，ExpressionandmolecularanalysisofphbBgeneinChlamydomonasreinhardtii，ChineseScienceBulletin，2004，49(16)1713-1717)，但表達水平有待提高，沒有建立完整的外源基因高效表達系統。本發明建立了一套利用轉基因萊茵衣藻進行目的產物生產的轉基因生物反應器技術體系。
發明內容本發明的目的在於提供一種轉基因萊茵衣藻生物反應器的構建方法，包括轉基因受體萊茵衣藻品系、含有篩選標記表達框架的外源基因高效表達載體構建、外源基因的遺傳轉化、轉基因藻的篩選與鑑定和外源基因表達調控方法。通過該方法構建轉基因萊茵衣藻高效生物反應器，實現快速、廉價生產各種藥用蛋白質、工業原料、可食性疫苗、具有生物學活性的次生代謝產物等。本發明方法包括以下幾個方面的內容1.轉基因受體藻的篩選與培養選擇轉基因受體藻可選用細胞壁缺陷的萊茵衣藻CC-849作為受體藻，但本發明不限於該品系。採用Tris-acetate-phosphate(TAP)培養基，在通氣和光照～90μE/m2.s的條件下培養。轉基因藻培養依生產規模採用不同規模的光合生物培養系統，大規模生產可採用跑道式藻類培養系統。2.外源基因萊茵衣藻表達載體的構建外源基因高效表達載體包括萊茵衣藻強啟動子(RBCS2啟動子，atpA啟動子，HSP70A-RBCS2合成啟動子等)、目的基因(MT-like等)、終止子(RBCS2終止子，rbcL3′終止子等)、特定的篩選標記基因(ble，aadA等)。(1)外源基因萊茵衣藻細胞核表達載體的構建首先將載體pSP105上克隆有RBCS2的5′啟動子序列和它的3′終止子序列，中間攜帶有PmaCI、BamHI、XbaI和SalI限制性內切酶位點，利用相應的酶切位點插入外源基因構成RBCS2的5′啟動子、目的基因和RBCS2終止子的表達盒，通過EcoRV酶切位點將該表達盒插入pSP124載體上(pSP124上含有RBCS2啟動子-ble-RBCS2終止子組成的ble基因的表達盒，編碼13.5KD的腐草黴素結合蛋白)，構建含RBCS啟動子的外源基因萊茵衣藻細胞核表達載體。載體pCB740上有Hsp70A-RBCS2合成啟動子，以pCB740質粒為模板，設計上下引物上遊引物PrHp1(5′CGCAAGCTTCAGGAATTCGCTGAGGCTTGACATGAT3′)HindIII下遊引物PrHp2(5′CGACTGCAGCGTCACGTGGCTAGCTCTCTTGTAAA3′)PmaCI通過PCR從質粒pCB740上擴增出含HSP70A-RBCS2啟動子片段，經電泳分離後從凝膠中回收，採用T-A克隆策略將其克隆到的pMD18-T載體上，得到的轉化子命名為HRT，通過PmaCI和HindIII從重組質粒HRT上分離出HSP70A-RBCS2啟動子片段，將pSP105用PmaCI和HindIII雙酶切，經電泳分離後從凝膠中回收切除了RBCS2啟動子/740bp的pSP105質粒片段/pSP105-1P，通過T4DNA連接酶將HSP70A-RBCS2啟動子連接到pSP105-1P，得到新的萊茵衣藻表達載體pH105，利用相應的酶切位點插入外源基因構成含HSP70A-RBCS2啟動子、目的基因和RBCS2終止子的表達盒，通過EcoRV酶切位點將該表達盒插入pSP124載體上，構建含HSP70A-RBCS2啟動子的外源基因萊茵衣藻細胞核表達載體。(2)外源目的基因萊茵衣藻葉綠體表達載體的構建首先是利用同源重組片段衣藻葉綠體的psbA基因外顯子5和23SrRNA3′端序列將外源基因定點整合到受體細胞葉綠體基因組psbA基因外顯子5和23SrRNA3′端序列之間，利用萊茵衣藻葉綠體rbcL基因的5′啟動子、rbcL基因的3』終止子驅動外源基因在萊茵衣藻的表達，篩選標記為aadA基因(賦予藻細胞鏈黴素、壯觀黴素抗性)。質粒p53rGFPct上攜帶有衣藻葉綠體的rbcL5′啟動子和rbcL3′終止子序列，通過NdeI和XbaI可以切下GFPct基因，並插入外源目的基因，rbcL5′啟動子和rbcL3′終止子序列可以在衣藻葉綠體中表達插入的外源基因，構成rbcL啟動子-目的基因-rbcL終止子的外源基因表達盒。載體p322上攜帶有衣藻葉綠體psbA基因外顯子5和23SrRNA的3′端的序列，外源基因表達盒插入葉綠體DNA的psbA基因外顯子5和23SrRNA之間的位置構成p322-1；p423質粒上攜帶有篩選標記aadA基因的表達盒(atpA5′啟動子-aadA-rbcL3′終止子)，通過EcoRI和Sacl雙酶切p423，獲得1.9kb的aadA基因表達盒，連入p322-1的EcoRI和Sacl位點，得到外源基因萊茵衣藻葉綠體表達載體。3.本發明所述的將外源目的基因導入萊茵衣藻的遺傳轉化方法包括(1)珠磨法萊茵衣藻CC-849在TAP培養液中培養至對數期，細胞數約為1-2×106cells/mL，室溫(20-25℃)離心收集，用TAP培養液重懸，調整細胞濃度至2×108cells/mL；吸取300μL懸浮液到5mL的兩個試管裡(內含已滅菌的石英砂)，將目的DNA酶切成線狀，取1μg-2μg加入試管，CC-849/石英砂/外源DNA混合物快速振蕩15秒後；把混合液轉移到25mL的帶螺旋帽的離心管中，加入10mL滅菌TAP培養液，在22℃溫度下60rpm振蕩搖床過夜培養(光照條件為90μE/m2/s)；室溫(20-25℃)離心收集細胞，去上清，用0.5mLTAP重懸，加入3.5mL0.5％TAP培養基，混勻後倒在TAP平板上(含10μg/mL的Zeomycin)，22℃光照培養箱裡培養7-15天，平板上長出綠色的單克隆藻落。(2)基因槍法萊茵衣藻在TAP培養液中培養至對數期，細胞數約為1-2×106細胞/mL，室溫(20-25℃)離心收集，用TAP液體培養基重懸，調整細胞濃度至2×108細胞/mL。吸取300μL懸浮液塗布於TAP固體平板培養基，22℃光照培養箱(光照條件為90μE/m2/s)中培養1-2天以形成細胞層。在無菌條件下用基因槍(Bio-Rad)轟擊。具體步驟如下取50μL金粉懸浮液(60μg/mL)，加入2μg含有外源基因的環狀質粒和50μL2MCaCl2和20μL0.1M亞精胺，通過渦輪振蕩器振蕩1-3分鐘以混合，8,000rpm離心10秒，棄上清，用無水乙醇清洗，振蕩，再8,000rpm離心10秒，棄上清，共5次，最後用60μL無水乙醇重懸沉澱。每次轟擊取10μL，轟擊參數如下真空度25inches·Hg，轟擊距離9cm，每皿轟擊3次，22℃光照培養箱恢復培養12小時，然後轉移到篩選平板上繼續培養(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至綠色單克隆長出。(3)電激穿孔法萊茵衣藻CC-849在TAP培養液中培養至對數期，細胞數約為1-2×106細胞/mL，室溫(20-25℃)離心收集，用電激緩衝液(10mMTris-HCl，pH7.5，10mMCaCl2，0.4M甘露醇，0.4M山梨醇)重懸，調整細胞濃度至2×108細胞/mL。加入終濃度為4μg/mL的含外源基因的質粒及25μg/mL的鮭精DNA，混勻後置冰上，吸取0.4mL於電轉杯中待用。電轉儀(Eppendorf)電激時電壓為1KV/cm，持續時間2秒，然後冰上放置10分鐘，補充10mLTAP液體培養基22℃光照培養箱恢復培養12-18小時，然後轉移到篩選平板上繼續培養(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至綠色單克隆長出。4.本發明所述的外源目的基因導入萊茵衣藻的整合位置為細胞核基因組或者葉綠體基因組。通過構建整合到細胞核基因組的表達載體或整合到葉綠體基因組的表達載體來實現整合位點的控制。5.本發明所述的轉基因藻篩選與鑑定包括(1)用含有篩選抗生素平板的篩選單克隆藻落，通過連續繼代培養15-20代後，進行進一步的分子檢測。(2)分子鑑定包括PCR-Southernblot檢測、RT-PCR-Southernblot檢測和Westernblot檢測。6.本發明所述的目的基因表達調控技術包括強啟動子的篩選、外源基因改造等。7.利用本發明所述的方法，建立了構建一種生產類金屬硫蛋白的轉MT-like基因萊茵衣藻生物反應器的方法。本發明方法構件的轉基因萊茵衣藻生物反應器，相比於現有的轉基因生物反應器，具有以下優點(1)基因組序列已測序完成(見ChlamydomonasCenter，www.chlamy.org)，遺傳背景清楚，便於外源基因的定點整合；(2)細胞內有一個大型杯狀葉綠體，佔整個細胞體積的40-60％，同質化容易；(3)具有無性生殖、有性生殖兩種方式，克服了植物組織培養困難，可在短時間內獲得大量轉基因後代；(4)有光能自養、異養及光能異養3種不同的營養生長方式；(5)易於同步化培養；(6)生物安全性高，轉化的外源基因不會象高等植物那樣通過花粉傳播給後代，避免了外源基因的環境擴散；(7)其生長速度快且光合效率高。與細菌、酵母等需要發酵底物的轉基因生物反應器相比較，本發明構建的一種轉基因萊茵衣藻生物反應器能利用光能將環境中的二氧化碳和水合成目標產物生產的底物，大大降低了生產成本。與高等植物轉基因生物反應器相比較，本發明構建的一種轉基因萊茵衣藻生物反應器生長速率快，能象細菌那樣進行集約化大規模培養，克服了高等植物生長周期長、佔地面積大的問題。與螺旋藻等原核轉基因生物反應器相比較，本發明構建的轉基因萊茵衣藻生物反應器是單細胞真核藻類，能表達來自高等動物和植物的真核基因，克服了轉基因藍藻表達真核基因時的糖基化修飾問題。與小球藻轉基因生物反應器相比較，本發明構建的轉基因萊茵衣藻生物反應器的細胞較大，採用細胞壁缺陷的受體品系，遺傳轉化操作方便，且細胞壁易破，表達產物易於分離。與轉基因鹽藻生物反應器相比較，本發明構建的轉基因萊茵衣藻生物反應器細胞生長快，培養方便，不必在高鹽的極端環境中生長。正因為具有以上的優點，本發明所述的轉基因萊茵衣藻生物反應器是目前很好的真核生物轉基因生物反應系統，具有非常廣闊的應用前景，例如可用於名貴醫藥、可食性疫苗、保健食品等的生產。圖1是pSP105結構示意圖，該載體包含包含5′RBCS2啟動子(780bp)和3′RBCS2終止子，中間有PmaCI、SalI、BamHI和XbaI等位點。圖2是pH105載體的構建過程，以來自pCB740質粒的Hsp70A-RBCS2合成啟動子取代pSP105上的5′RBCS2啟動子，得到pH105載體。圖3是MT-like基因衣藻葉綠體表達載體p322A-MT構建圖，含有aadA表達盒(atpA5′啟動子-aadA-rbcL3′終止子)和MT-like基因表達盒rbcL5′啟動子-(MT-like基因)-rbcL3′終止子，同源重組片段衣藻葉綠體DNA的psbA基因外顯子5和23SrRNA的3′端的序列。圖4是MT-like基因衣藻核表達載體pSP105MT-124構建圖，含有ble基因表達盒(RBCS2啟動子-ble-RBCS2終止子)和MT-like基因表達盒RBCS2啟動子-(MT-like基因)-RBCS2終止子。圖5是MT-like-M基因衣藻核表達載體pH105MT-124構建圖，含有ble基因表達盒(RBCS2啟動子-ble-RBCS2終止子)和MT-like基因表達盒RBCS2啟動子-(MT-like-M基因)-RBCS2終止子。圖6是MT-like基因衣藻葉綠體表達載體p322A-MT-M構建圖，含有aadA表達盒atpA5′啟動子-aadA-rbcL3′終止子和MT-like-M基因表達盒rbcL5′啟動子-(MT-like-M基因)-rbcL3′終止子，同源重組片段衣藻葉綠體DNA的psbA基因外顯子5和23SrRNA的3′端的序列。具體實施例方式實施例1萊茵衣藻品系的選擇與培養本實施例選用萊茵衣藻Chlamydomonasreinhardtiicc-849(購自美國Duke大學衣藻遺傳中心，DukeUniversity，Durham，NC27708USA)作為轉基因操作的受體，該藻株為細胞壁缺陷型的萊茵衣藻品系，但本專利涉及所有用於轉基因操作的其它萊茵衣藻品系。萊茵衣藻培養時使用的培養基為TAP培養基，1L培養基的組份如下Tris2.42g，4倍Beijerincksalts(每升含16gNH4Cl，2gCaCl2·2H2O，4gMgSO4·7H2O)25mL，1M(K)PO4(pH7.0)緩衝液1mL，微量元素混合液(每升含11.4gH3BO3，22gZnSO4·7H2O，5.06gMnCl2·4H2O，4.99gFeSO4·7H2O，1.61gCoCl2·6H2O1.57gCuSO4·5H2O1.1g(NH4)6Mo7O24·4H2O，50gNa2EDTA)1mL，冰醋酸1mL，H2O975mL，pH7.0。萊茵衣藻培養條件如下溫度22-25℃，光照90μE/m2/s的條件下連續光照培養，通氣量可調整(0.5L/min左右)，藻細胞濃度達到1×108-109細胞/mL時離心收集。實施例2外源目的基因萊茵衣藻高效表達載體的構建1.外源目的基因萊茵衣藻核表達載體的構建載體pSP105(Stevens，D.R.，等ThebacterialphleomycinresistancegenebleasadominantselectablemarkerinChlamydomonas.1996，Mol.Gen.Genet.251，23-30.)上克隆有RBCS2的5′啟動子序列和它的3′終止子序列，中間攜帶有PmaCI、BamHI、XbaI和SalI等限制性內切酶位點，可以插入外源基因並在衣藻核基因組中表達外源基因(見圖1)。載體pCB740(SchrodaM.，等SequenceelementswithinanHSP70promotercounteracttranscriptionaltransgenesilencinginChlamydomona.PlantJ，2002，31(4)445-455)上克隆有Hsp70A-RBCS2合成啟動子。載體pSP124(VictoriaLumbreras，等EfficientforeigngeneexpressioninChlamydomonasreinhardtiimediatedbyanendogenousintron.PlantJ，1998，14(4)441-447)上含有ble基因的表達盒(RBCS2啟動子-ble-RBCS2終止子)，編碼13.5KD的腐草黴素結合蛋白，它產生的抗體使衣藻具有腐草黴素和Zeomycin抗性，作為衣藻轉化時的篩選標記。以pCB740質粒為模板，設計兩條引物上遊引物PrHp1(5′CGCAAGCTTCAGGAATTCGCTGAGGCTTGACATGAT3′)HindIII下遊引物PrHp2(5′CGACTGCAGCGTCACGTGGCTAGCTCTCTTGTAAA3′)PmaCI通過PCR(程序是94℃變性3min；94℃1min，60℃1min，72℃1min，30個循環；72℃延伸10min)從質粒pCB740上擴增出含HSP70A-RBCS2啟動子片段(約498bp)，經電泳分離後從凝膠中回收，採用T-A克隆策略將其克隆到的pMD18-T載體(大連寶生物工程有限公司，遼寧省大連經濟開發區東北二街19號)上，得到的轉化子命名為HRT，通過PmaCI和HindIII(大連寶生物工程有限公司)從重組質粒HRT上分離出HSP70A-RBCS2啟動子片段(約498bp)。將pSP105用PmaCI和HindIII雙酶切，經電泳分離後從凝膠中回收切除了RBCS2啟動子(740bp)的pSP105質粒片段(pSP105-1P)，通過T4DNA連接酶(大連寶生物工程有限公司)將HSP70A-RBCS2啟動子連接到pSP105-1P，得到新的萊茵衣藻表達載體，命名為pH105(見圖2)。2.外源目的基因萊茵衣藻葉綠體表達載體的構建本實施例選擇來自紫羊茅植物(Festucarubracv.Merlin)的類金屬硫蛋白(Metallothionein-like，MT-like)基因萊茵衣藻葉綠體表達載體為例。利用同源重組片段衣藻葉綠體的psbA基因外顯子5和23SrRNA3′端序列將外源基因定點整合到受體細胞葉綠體基因組psbA基因外顯子5和23SrRNA3′端序列之間。利用萊茵衣藻葉綠體rbcL基因的5′啟動子、rbcL基因的3』終止子驅動外源基因在萊茵衣藻的表達。篩選標記為aadA基因，賦予藻細胞鏈黴素、壯觀黴素抗性。質粒p53rGFPct(Franklin，S.E.，等DevelopmentofaGFPreportergeneforChlamydomonasreinhardtiichloroplast.PlantJ2002，30733-744)上攜帶有衣藻葉綠體的rbcL5′啟動子和rbcL3′終止子序列，通過NdeI和XbaI可以切下GFPct基因，並插入外源目的基因，rbcL5′啟動子和rbcL3′終止子序列可以在衣藻葉綠體中表達插入的外源基因。載體p322(購自美國Duke大學衣藻遺傳中心，DukeUniversity，Durham，NC27708USA)上攜帶有衣藻葉綠體psbA基因外顯子5和23SrRNA的3′端的序列，方便外源基因表達盒插入葉綠體DNA的psbA基因外顯子5和23SrRNA之間的位置；p423(購自美國Duke大學衣藻遺傳中心，DukeUniversity，Durham，NC27708USA)質粒上攜帶有aadA基因的表達盒(atpA5′啟動子-aadA-rbcL3′終止子)，aadA基因可使藻細胞具有壯觀黴素和鏈黴素抗性，成為萊茵衣藻葉綠體遺傳轉化的篩選標記。根據來自紫羊茅植物的類金屬硫蛋白基因序列(MiMa，Wing-KeungTsang，Pui-SangLauandYuk-ShanWong.1997.CloningandSequencingoftheMetallothionein-likecDNA(AccessionNo.U96646)FromFestucarubracv.Merlin(PGR97-098).PlantPhysiol.1141136)，由上海生工生物技術服務有限公司(上海市漕寶路500號)人工合成帶有NdeI和XbaI酶切位點的類金屬硫蛋白基因片段，具體序列如下1cgccatatgcagatgtcttgcagctgcggatcaagctgtggctgcggctcaaactgcaagNdeI61tgcgggaagatgtaccctgacctggacgagcaggccagcaccaccacccaggccgtggtc121gtcgtcggcgtggctcatgagaacaaggctggacagtttgagatggcctccggcgagggc181tgcaaatgcggcgccaactgcaagtgtgacccctgcaactgctaacgtgtctagactXbaI通過EcoRI和SacI雙酶切p423，獲得1.9kb的aadA基因表達盒(atpA5′啟動子-aadA-rbcL3′終止子)，連入p322的EcoRI和SacI位點，得到p322A。將MT-like基因插入p53rGFPct的NdeI和XbaI位點，得到MT-like基因表達盒(rbcL5′啟動子-MT-like基因-rbcL3′終止子)，獲得p53MT質粒。通過BamHI從p53MT質粒切下MT-llike基因表達盒，插入p322A的BamHI位點，得到類金屬硫蛋白(Metallothionein-like，MT-like)基因萊茵衣藻葉綠體表達載體p322A-MT(見圖3)。實施例3轉基因萊茵衣藻生物反應器的構建(整合到萊茵衣藻核基因組)本實施例選擇來自紫羊茅植物(Festucarubracv.Merlin)的類金屬硫蛋白(Metallothionein-like，MT-like)基因來構建生產類金屬硫蛋白的轉MT-like基因萊茵衣藻生物反應器。MT-like基因衣藻核表達載體的構建根據來自紫羊茅植物的類金屬硫蛋白基因序列(MiMa，Wing-KeungTsang，Pui-SangLauandYuk-ShanWong.1997.CloningandSequencingoftheMetallothionein-likecDNA(AccessionNo.U96646)FromFestucarubracv.Merlin(PGR97-098).PlantPhysiol.1141136)，由上海生工生物技術服務有限公司(上海市漕寶路500號)人工合成帶有PmaCI和SalI酶切位點的類金屬硫蛋白基因片段，具體序列如下1cgccacgtgcagatgtcttgcagctgcggatcaagctgtggctgcggctcaaactgcaagPmaCI61tgcgggaagatgtaccctgacctggacgagcaggccagcaccaccacccaggccgtggtc121gtcgtcggcgtggctcatgagaacaaggctggacagtttgagatggcctccggcgagggc181tgcaaatgcggcgccaactgcaagtgtgacccctgcaactgctaacgtggtcgacctSalI將該基因片段用PmaCI和SalI雙酶切後，連接到pSP105和pH105的多克隆位點，分別獲得中間載體pSP105MT和pH105MT，用EcoRI分別酶切pSP105MT和pH105MT後，分別得到包含RBCS2啟動子、MT-like基因、RBCS2終止子的表達框架(pSP105MT-1P)和包含HSP70A-RBCS2啟動子、MT-like基因、RBCS2終止子的表達框架(pH105MT-1P)，將pSP105MT-1P和pH105MT-1P插入到帶有選擇標記基因ble的pSP124S載體(VictoriaLumbreras，DavidR.StevensandSaulPurton，1998.EfficientforeigngeneexpressioninChlamydomonasreinhardtiimediatedbyanendogenousintron)的EcoRI位點，構成可以進行萊茵衣藻遺傳轉化的轉化載體pSP105MT-124(見圖4)和pH105MT-124(見圖5)。萊茵衣藻遺傳轉化本實施例以珠磨法轉化萊茵衣藻CC-849，具體步驟如下(1)萊茵衣藻CC-849在TAP培養液中培養至對數期，細胞數約為1-2×106cells/mL，室溫離心收集，用TAP培養液重懸，調整細胞濃度至2×108cells/mL。(2)吸取300μL懸浮液到5mL的兩個試管裡(內含已滅菌的石英砂)，將目的DNA(pSP105MT-124或pH105MT-124)酶切成線狀，取1μg-2μg加入試管，CC-849/石英砂/外源DNA混合物快速振蕩15秒。(3)把混合液轉移到25mL的帶螺旋帽的離心管中，加入10mL滅菌TAP培養液，在22℃溫度下60rpm振蕩搖床過夜培養(光照條件為90μE/m2/s)。(4)室溫離心收集細胞，去上清，用0.5mLTAP重懸，加入3.5mL0.5％TAP培養基，混勻後倒在TAP平板上(含10μg/mL的Zeomycin)，22℃光照培養箱裡培養7-15天，平板上長出綠色的單克隆藻落。轉基因萊茵衣藻的篩選與鑑定上述篩選平板培養基中含有10μg/mL的Zeomycin，如果藻細胞能在篩選平板上長出單克隆藻落，說明轉化載體上的標記基因ble已經整合到基因組中。要確定該藻落為轉目的基因衣藻，首先通過連續繼代培養15-20代後，進行進一步的分子檢測。具體方法如下(以轉MT-like基因萊茵衣藻為例)(1)以轉基因衣藻的總DNA為模板，按MT-like基因序列設計一對引物，通過PCR擴增出MT-like基因片段，以地高辛標記的完整的MT-like基因為探針，進行PCR-Southernblot檢測，結果顯示擴增片段可與探針雜交，轉基因衣藻出現和陽性對照一致的雜交印跡反應，而對照組沒有印跡。這表明含MT-like基因已經整合到萊茵衣藻的基因組中。(2)提取轉基因衣藻總RNA，以反轉錄合成的cDNA第一鏈為模板，按MT-like基因序列設計一對引物，通過RT-PCR擴增出MT-like基因片段，以地高辛標記的完整的MT-like基因為探針，進行RT-PCR-Southernblot檢測，若轉基因衣藻出現和陽性對照一致的雜交印跡反應，而對照組沒有印跡，表明整合進衣藻基因組中的MT-like基因在衣藻細胞中具有轉錄活性，可在mRNA水平進行有效轉錄。(3)提取轉基因藻的總蛋白，用MT-like蛋白作標準樣品，通過HPLC分析比較轉基因藻；同時，轉基因藻的總蛋白與目的產物單克隆抗體進行Westernblot分析，在轉基因藻中檢測到MT-like蛋白，而對照樣品則不能檢測到該蛋白。說明導入到衣藻中的MT-like已經表達，並翻譯出目的產物。通過上面的鑑定，確認轉基因萊茵衣藻生物反應器已經構建完成，利用RBCS2啟動子獲得轉基因藻Tr-RBCS2；利用HSP70A-RBCS2啟動子獲得轉基因藻Tr-HSP70A-RBCS2。目標產物的分離技術目標產物的分離方法依產物的特性不同可以採取不同的分離途經。本發明專利涉及從轉基因衣藻中分離目標產物的各類方法，包括有機萃取、相分配、柱層析、電泳和超濾等。本實施例採用親和層析法，具體步驟如下(以轉MT-like基因萊茵衣藻為例)轉基因藻細胞經光誘導和熱激處理，離心(4000g)收集，每克萊茵衣藻加入3mLpH8.0的Tris-HCl緩衝液和2mL乙醇-氯仿溶液(1∶1)，80℃水浴變性10分鐘，破碎採用超聲波破碎法，超聲波強度200kw/m2，處理時間為15分鐘，離心(4000g)15分種，取上清液為初提液。將初提液上樣到用洗脫液(0.01M的NH4HCO3pH8.5)平衡過的SephadexG-50層析柱，經洗脫液在4℃條件下洗脫，收集並脫鹽處理獲得純化的MT-ike蛋白。比較轉基因藻Tr-RBCS2和轉基因藻Tr-HSP70A-RBCS2的MT-like蛋白含量，轉基因藻Tr-HSP70A-RBCS2的表達量高出20倍。實施例4轉基因萊茵衣藻生物反應器的構建(整合到萊茵衣藻葉綠體DNA)外源基因改造本發明為了使外源基因在萊茵衣藻中高效表達，在不影響外源基因表達產物結構和功能特性的基礎上對外源基因進行適當的改造，改造方法包括在基因中插入具有增強子作用的衣藻內含子、將外源基因密碼子換成衣藻優先密碼子等。本實施例中，使用衣藻優先密碼子(見http//www.chlamy.org/的衣藻密碼子表)對紫羊茅植物MT-like基因(下圖第一行)進行改造，得到MT-like-M(下圖第二行)，結果如下1atgtcttgcagctgcggatcaagctgtggctgcggctcaaactgcaagtgcgggaagatg1atgtgcagctgcagcggctgcggcaactgcaagtgcaagatg61taccctgacctggacgagcaggccagcaccaccacccaggccgtggtcgtcgtcggcgtg61tacgacctggacgagcaggccagcaccaccacccaggccgtggtcgtcgtcggcgtg121gctcatgagaacaaggctggacagtttgagatggcctccggcgagggctgcaaatgcggc121gagaacaaggctcaggagatggcctccggcgagggctgctgcggc181gccaactgcaagtgtgacccctgcaactgctaa181gccaactgcaaggacccctgcaactgctaaMT-like基因表達載體的構建(葉綠體基因組表達系統)按照MT-like基因序列和經過優先密碼子改造後MT-like-M基因序列，由上海生工生物技術服務有限公司(上海市漕寶路500號)人工合成的類金屬硫蛋白基因片段，其MT-like基因和MT-like-M基因葉綠體基因組表達系統的表達載體構建過程同實施例3，得到p322A-MT(見圖3)和p322A-MT-M(見圖6)。萊茵衣藻遺傳轉化(1)通過「基因槍法」對p322A-MT-M轉化萊茵衣藻萊茵衣藻CC-849在TAP培養液中培養至對數期，細胞數約為1-2×106細胞/mL，室溫(20-25℃)離心收集，用TAP液體培養基重懸，調整細胞濃度至2×108細胞/mL。吸取300μL懸浮液塗布於TAP固體平板培養基，22℃光照培養箱(光照條件為90μE/m2/s)中培養1-2天以形成細胞層。在無菌條件下用基因槍(Bio-Rad)轟擊。具體步驟如下取50μL金粉懸浮液(60μg/mL)，加入2μg含有外源基因的環狀質粒(p322A-MT-M)和50μL2MCaCl2和20μL0.1M亞精胺，通過渦輪振蕩器振蕩1-3分鐘以混合，8,000rpm離心10秒，棄上清，用無水乙醇清洗，振蕩，再8,000rpm離心10秒，棄上清，共5次，最後用60μL無水乙醇重懸沉澱。每次轟擊取10μL，轟擊參數如下真空度25inches·Hg，轟擊距離9cm，每皿轟擊3次，22℃光照培養箱恢復培養12小時，然後轉移到篩選平板上繼續培養(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至綠色單克隆長出。(2)通過「電激穿孔法」對p322A-MT轉化萊茵衣藻萊茵衣藻CC-849在TAP培養液中培養至對數期，細胞數約為1-2×106細胞/mL，室溫(20-25℃)離心收集，用電激緩衝液(10mMTris-HCl，pH7.5，10mMCaCl2，0.4M甘露醇，0.4M山梨醇)重懸，調整細胞濃度至2×108細胞/mL。加入終濃度為4μg/mL的含外源基因的質粒(p322A-MT)及25μg/mL的鮭精DNA，混勻後置冰上，吸取0.4mL於電轉杯中待用。電轉儀(Eppendorf)電激時電壓為1KV/cm，持續時間2秒，然後冰上放置10分鐘，補充10mLTAP液體培養基22℃光照培養箱恢復培養12-18小時，然後轉移到篩選平板上繼續培養(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至綠色單克隆長出。轉基因萊茵衣藻的篩選與鑑定上述篩選平板培養基中含有100μg/mL的壯觀黴素，如果藻細胞能在篩選平板上長出單克隆藻落，說明轉化載體上的標記基因aadA已經整合到葉綠體基因組中。要確定該藻落為轉目的基因衣藻，首先通過連續繼代培養15-20代後，再進行分子檢測。具體方法如下(以轉MT-like基因萊茵衣藻為例)(1)以轉基因衣藻的總DNA為模板，按MT-like基因序列設計一對引物，通過PCR擴增出MT-like基因片段，以地高辛標記的完整的MT-like基因為探針，進行PCR-Southernblot檢測，結果顯示擴增片段可與探針雜交，轉基因衣藻出現和陽性對照一致的雜交印跡反應，而對照組沒有印跡。這表明含MT-like基因已經整合到萊茵衣藻的基因組中。(2)提取轉基因衣藻總RNA，以反轉錄合成的cDNA第一鏈為模板，按MT-like基因序列設計一對引物，通過RT-PCR擴增出MT-like基因片段，以地高辛標記的完整的MT-like基因為探針，進行RT-PCR-Southernblot檢測，若轉基因衣藻出現和陽性對照一致的雜交印跡反應，而對照組沒有印跡，表明整合進衣藻基因組中的MT-like基因在衣藻細胞中具有轉錄活性，可在mRNA水平進行有效轉錄。(3)提取轉基因藻的總蛋白，用MT-like蛋白作標準樣品，通過HPLC分析比較轉基因藻；同時，轉基因藻的總蛋白與目的產物單克隆抗體進行Westernblot分析，在轉基因藻中檢測到MT-like蛋白，而對照樣品則不能檢測到該蛋白。說明導入到衣藻中的MT-like已經表達，並翻譯出目的產物。通過上面的鑑定，確認轉基因萊茵衣藻生物反應器(葉綠體基因組表達系統)已經構建完成，利用MT-like基因獲得的轉基因藻為Tr-MT-like；利用MT-like-M基因獲得的轉基因藻為Tr-MT-like-M。目標產物的分離技術目標產物的分離方法同實施例三，結果表明，在同樣的誘導條件下，單位乾重的轉基因藻(Tr-MT-like-M)的表達量是轉基因藻Tr-MT-like的12倍。權利要求1.一種轉基因萊茵衣藻生物反應器的構建方法，它包括下列步驟A、轉基因受體藻的篩選與培養；B、含篩選標記基因表達框架的外源基因萊茵衣藻表達載體構建；C、外源基因的遺傳轉化與轉基因藻的篩選；D、外源基因表達調控，其包括外源基因的改造、強啟動子的篩選、控制外源目的基因導入萊茵衣藻的融合位置為細胞核基因組或葉綠體基因組。2.按權利要求1所述的一種轉基因萊茵衣藻生物反應器的構建方法，其特徵是構建一種生產類金屬硫蛋白的轉MT-like基因的萊茵衣藻生物反應器，通過培養轉MT-like基因的萊茵衣藻，並從中分離類金屬硫蛋白。3.按權利要求1所述的一種轉基因萊茵衣藻生物反應器的構建方法，其特徵在於轉基因受體藻的篩選與培養，選擇萊茵衣藻為轉基因受體藻，採用Tris-acetate-phosphate/TAP培養基，在通氣和光照～90μE/m2.s的條件下培養。4.按權利要求1所述的一種轉基因萊茵衣藻生物反應器的構建方法，其特徵是含篩選標記基因表達框架外源基因萊茵衣藻表達載體包括萊茵衣藻強啟動子/RBCS2啟動子，HSP70A-RBCS2合成啟動子、atpA啟動子，目的基因/MT-like、終止子/RBCS2終止子，rbcL3′終止子、篩選標記基因/ble，aadA，其構建過程包括(1)外源基因萊茵衣藻細胞核表達載體的構建A首先將載體pSP105上克隆有RBCS2的5′啟動子序列和它的3′終止子序列，中間攜帶有PmaCI、BamHI、XbaI和SalI限制性內切酶位點，利用相應的酶切位點插入外源基因構成RBCS2的5′啟動子、目的基因和RBCS2終止子的表達盒，通過EcoRV酶切位點將該表達盒插入pSP124載體上/pSP124上含有ble基因的表達盒/RBCS2啟動子-ble-RBCS2終止子，編碼13.5KD的腐草黴素結合蛋白，構建含RBCS2啟動子的外源基因萊茵衣藻細胞核表達載體；B載體pCB740上克隆有Hsp70A-RBCS2合成啟動子，以pCB740質粒為模板，設計上下引物上遊引物PrHp1/5′CGCAAGCTTCAGGAATTCGCTGAGGCTTGACATGAT3′HindIII下遊引物PrHp2/5′CGACTGCAGCGTCACGTGGCTAGCTCTCTTGTAAA3′PmaCI通過PCR從質粒pCB740上擴增出含HSP70A-RBCS2啟動子片段，經電泳分離後從凝膠中回收，採用T-A克隆策略將其克隆到的pMD18-T載體上，得到的轉化子命名為HRT，通過PmaCI和HindIII從重組質粒HRT上分離出HSP70A-RBCS2啟動子片段，將pSP105用PmaCI和HindIII雙酶切，經電泳分離後從凝膠中回收切除了RBCS2啟動子/740bp的pSP105質粒片段/pSP105-1P，通過T4DNA連接酶將HSP70A-RBCS2啟動子連接到pSP105-1P，得到萊茵衣藻表達載體pH105，利用相應的酶切位點插入外源基因構成HSP70A-RBCS2啟動子、目的基因和RBCS2終止子的表達盒，通過EcoRV酶切位點將該表達盒插入pSP124載體上，構建含HSP70A-RBCS2啟動子的外源基因萊茵衣藻細胞核表達載體；(2)外源目的基因萊茵衣藻葉綠體表達載體的構建首先是利用同源重組片段衣藻葉綠體的psbA基因外顯子5和23SrRNA3′端序列將外源基因定點整合到受體細胞葉綠體基因組psbA基因外顯子5和23SrRNA3′端序列之間，利用萊茵衣藻葉綠體rbcL基因的5′啟動子、rbcL基因的3』終止子驅動外源基因在萊茵衣藻的表達，篩選標記為aadA基因，質粒p53rGFPct上攜帶有衣藻葉綠體的rbcL5′啟動子和rbcL3′終止子序列，通過NdeI和XbaI可以切下GFPct基因，並插入外源目的基因，rbcL5′啟動子和rbcL3′終止子序列可以在衣藻葉綠體中表達插入的外源基因，構成rbcL5′啟動子-目的基因-rbcL3′終止子的外源基因表達盒，載體p322上攜帶有衣藻葉綠體psbA基因外顯子5和23SrRNA的3′端的序列，外源基因表達盒插入葉綠體DNA的psbA基因外顯子5和23SrRNA之間的位置構成p322-1；p423質粒上攜帶有篩選標記aadA基因的表達盒/atpA5′啟動子-aadA-rbcL3′終止子，通過EcoRI和SacI雙酶切p423，獲得1.9kb的aadA基因表達盒，連入p322-1的EcoRI和SacI位點，得到外源基因萊茵衣藻葉綠體表達載體。5.根據權利要求1所述的一種轉基因萊茵衣藻生物反應器的構建方法，其特徵在於外源目的基因導入萊茵衣藻的遺傳轉化方法包括(1)珠磨法萊茵衣藻CC-849在TAP培養液中培養至對數期，細胞數約為1-2×106cells/mL，室溫離心收集，用TAP培養液重懸，調整細胞濃度至2×108cells/mL；吸取300μL懸浮液到5mL的兩個試管裡，將目的DNA酶切成線狀，取1μg-2μg加入試管，CC-849/石英砂/外源DNA混合物快速振蕩15秒後，把混合液轉移到25mL的帶螺旋帽的離心管中，加入10mL滅菌TAP培養液，在22℃溫度下60rpm振蕩搖床過夜培養/光照條件為90μE/m2/s；室溫離心收集細胞，去上清，用0.5mLTAP重懸，加入3.5mL0.5％TAP培養基，混勻後倒在TAP篩選平板上，22℃光照培養箱裡培養7-15天，平板上長出綠色的單克隆藻落；(2)基因槍法萊茵衣藻在TAP培養液中培養至對數期，細胞數約為1-2×106細胞/mL，室溫離心收集，用TAP液體培養基重懸，調整細胞濃度至2×108細胞/mL。吸取300μL懸浮液塗布於TAP固體平板培養基，22℃光照培養箱中培養1-2天以形成細胞層，光照條件為90μE/m2/s，在無菌條件下用基因槍/Bio-Rad轟擊，取50μL金粉懸浮液/60μg/mL，加入2μg含有外源基因的環狀質粒和50μL2MCaCl2和20μL0.1M亞精胺，通過渦輪振蕩器振蕩1-3分鐘以混合，8,000rpm離心10秒，棄上清，用無水乙醇清洗，振蕩，再8,000rpm離心10秒，棄上清，共5次，最後用60μL無水乙醇重懸沉澱，每次轟擊取10μL，轟擊參數如下，真空度25inches·Hg，轟擊距離9cm，每皿轟擊3次，22℃光照培養箱恢復培養12小時，然後轉移到篩選平板上繼續培養1-2周，溫度為22℃，光照為90μE/m2/s，至綠色單克隆長出；(3)電激穿孔法萊茵衣藻CC-849在TAP培養液中培養至對數期，細胞數約為1-2×106細胞/mL，室溫離心收集，用電激緩衝液/10mMTris-HCl，pH7.5，10mMCaCl2，0.4M甘露醇，0.4M山梨醇重懸，調整細胞濃度至2×108細胞/mL。加入終濃度為4μg/mL的含外源基因的質粒及25μg/mL的鮭精DNA，混勻後置冰上，吸取0.4mL於電轉杯中待用，電轉儀/Eppendorf電激時電壓為1KV/cm，持續時間2秒，然後冰上放置10分鐘，補充10mLTAP液體培養基22℃光照培養箱恢復培養12-18小時，然後轉移到篩選平板上繼續培養1-2周，溫度為22℃，光照為90μE/m2/s，至綠色單克隆長出。6.按權利要求1所述的一種轉基因萊茵衣藻生物反應器的構建方法，其特徵是轉基因藻篩選與鑑定包括(1)用含有篩選抗生素的平板篩選單克隆藻落，通過連續繼代培養15-20代後，進行進一步的分子檢測；(2)分子鑑定包括PCR-Southernblot檢測、RT-PCR-Southernblot檢測、Westernblot檢測和產物分析。全文摘要本發明涉及一種轉基因萊茵衣藻生物反應器的構建方法。利用萊茵衣藻作為轉基因受體生物，通過構建含有篩選標記基因表達框架的外源基因高效表達載體構建，利用「珠磨法」、基因搶法、或電擊穿孔等方法，將來源於不同生物體(包括動物、植物和微生物等)的目的基因導入萊茵衣藻體內，並根據需要整合到細胞核基因組、或葉綠體基因組中，採用一系列基因表達調控技術，構建轉基因萊茵衣藻高效生物反應器。該方法構建的轉基因萊茵衣藻生物反應器生長速度快、繁殖周期短、產物易分離、光合自養和可集約化大規模培養等特性，實現快速、廉價生產各種藥用蛋白質、工業原料、可食性疫苗、具有生物學活性的次生代謝產物等。文檔編號C12Q1/68GK1827769SQ20061001830公開日2006年9月6日申請日期2006年1月26日優先權日2006年1月26日發明者胡章立,王潮崗,吳錦霞,黎雙飛,雷安平申請人:深圳大學