一種異細交鏈孢菌酮酸化學發光酶聯免疫檢測試劑盒及其使用方法與流程

2023-10-10 01:23:09

本發明屬於化學發光酶聯免疫檢測技術領域，具體地，涉及一種異細交鏈孢菌酮酸化學發光酶聯免疫檢測試劑盒及其使用方法。

背景技術：

鏈格孢黴廣泛分布於泥土和穀物、蔬菜、水果等農產品中，是重要的植物病原體。異細交鏈孢菌酮酸(ITeA)作為其主要的次級代謝產物之一，與細交鏈孢菌酮酸(TeA)同屬於四胺基酸衍生物，極易溶於甲醇、乙酸乙酯、二甲基亞碸等有機溶劑，在石油醚等低極性的溶劑中溶解性差。研究表明，異細交鏈孢菌酮酸具有細胞毒性作用，能抑制胺基酸的結合，阻止蛋白質和DNA合成。據調查，鏈格孢菌最常汙染小麥、高粱、大麥、葵花籽油、菜籽、番茄、蘋果、柑橘類和橄欖等，在高粱嬰兒穀物食品中檢測到ITeA的含量達75±8μg/kg，茴香茶中含量達21±14μg/kg，高粱糖果中含量達64±5μg/kg。

目前文獻報導的真菌毒素的檢測方法有薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、色譜與質譜聯用技術等儀器方法。然而，由於其操作複雜，耗時長，因此較難滿足大批量樣品的現場篩選需求，而免疫分析法因成本低、操作簡單、速度快、一次檢測樣本量大、儀器化程度低，值得我們推廣成為常用的篩選方法。

化學發光免疫分析方法是將發光物質標記到抗原或抗體上，與抗體或抗原發生特異性免疫反應後，通過檢測標記物的化學發光強度確定被測抗體或抗原的含量，其靈敏度高，簡便快捷，可以用作現場大批量樣品的篩選。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是克服現有異細交鏈孢菌酮酸類檢測技術的缺陷和不足，提供一種異細交鏈孢菌酮酸化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，所述試劑盒準確、靈敏、快速、能夠高通量檢測異細交鏈孢菌酮酸。

本發明的另一目的在於提供上述試劑盒的使用方法。

本發明的上述目的是通過以下技術方案予以實現的。

一種異細交鏈孢菌酮酸的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，包含以下成分：

(1)包被有異細交鏈孢菌酮酸抗原的化學發光酶標板，所述的異細交鏈孢菌酮包被原濃度為15.6ng/mL，所述化學發光酶標板為可拆不透明白色發光板；

(2)異細交鏈孢菌酮酸抗體；

(3)酶標抗抗體；

(4)異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液，濃度為1mg/mL；

(5)化學發光液；

(6)濃縮洗滌液；

所述異細交鏈孢菌酮酸抗原是半抗原ITeAHGA(化學名為3-(1-腙基乙基)-4-羥基-5異丁基-1H-吡咯-2(5H)-酮)與卵清蛋白(OVA)共價偶聯合成得到的偶聯物；ITeAH的結構式如下所示：

其中ITeAHGA的製備方法參考申請號為201310747570.2的專利。

優選地，所述化學發光酶標板是96孔或40孔可拆不透明酶標板，材質為聚苯乙烯，包被有能與抗異細交鏈孢菌酮酸抗體特異性結合的異細交鏈孢菌酮酸抗原，並封閉微孔表面未吸附異細交鏈孢菌酮酸抗原的位點。

所述包被有異細交鏈孢菌酮酸抗原的化學發光酶標板的製備方法為：用包被液將異細交鏈孢菌酮酸抗原按需要稀釋，向發光板微孔中加入包被液，放入37℃環境進行孵育過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌，然後在每孔中加入封閉液，37℃孵育，傾去孔內液體，乾燥後用鋁膜真空密封保存。

另外，可以作為固定異細交鏈孢菌酮酸抗原固相載體的物質較多，例如聚苯乙烯、硝酸纖維素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯醯胺、交聯葡萄糖、矽橡膠、瓊脂糖凝膠等。該載體的形式可以為凹孔、紙片、小珠等。

優選地，所述包被異細交鏈孢菌酮酸抗原的包被液為按比例將1.69g碳酸鈉和2.95g碳酸氫鈉溶於1L雙蒸水中得到，異細交鏈孢菌酮酸抗原的包被濃度為0.167ug/L。

優選地，所述封閉液為將0.1g BSA(牛血清白蛋白)、5g甘氨酸、5g蔗糖溶於100mL PBS(0.01mol/L pH7.4)溶液得到。

優選地，所述異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液在使用時用0.01mol/L、pH5.4的磷酸鹽吐溫緩衝液(PBST)將標準品溶液稀釋成濃度為0.0μg/L、0.00512μg/L、0.0256μg/L、0.128μg/L、0.64μg/L、3.2μg/L、16μg/L的一系列異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液。

優選地，所述磷酸鹽吐溫緩衝液(PBST)的配方為：NaH2PO4·12H2O 2.9g、NaCl8.5g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、500μl Tween-20，定容至1L。

優選地，所述化學發光液由A液和B液組成，A液和B液按體積比為1:1；A液的配方為：將對碘苯酚、魯米諾、Tris溶於去離子水，pH為8.2～8.6；B液的配方為：將體積分數0.40％的H2O2、Tris溶於去離子水，pH為6.8～7.2。更優選地，A液pH為8.4，B液pH為7.0。

優選地，所述濃縮洗滌液為含有體積濃度0.5％Tween-20的pH 7.4 0.4mol/L的磷酸鹽緩衝液；所述濃縮洗滌液為20倍濃縮洗滌液，使用時用去離子水稀釋成1倍洗滌液。

本發明還提供所述的異細交鏈孢菌酮酸化學發光酶聯免疫檢測試劑盒的使用方法，包含如下步驟：

S1.將試劑盒從冷藏環境中取出，置於15～35℃平衡30min～45min；將所述異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液用磷酸鹽緩衝液稀釋成一系列的濃度梯度；

S2.取出化學發光酶標板，往標準孔中加入不同濃度的異細交鏈孢菌酮酸溶液，樣品孔中加入待測樣品，然後每孔加入異細交鏈孢菌酮酸抗體，蓋上蓋板膜振搖混勻，孵育；

S3.吸除板孔中的反應液，用洗滌液進行洗滌，將酶標板拍幹；所述洗滌液為濃縮洗滌液稀釋20倍得到；

S4.往各孔中加入酶標抗抗體，輕拍混勻，孵育；

S5.每孔加入化學發光液，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，1～2min後測定各孔的發光值RLU；

S6.檢測結果的計算與分析：確定樣品中異細交鏈孢菌酮酸的含量。

抑制率(％)＝B/B0×100(％)，式中：B為不同濃度異細交鏈孢菌酮酸的標準品溶液孔或待測樣品孔的發光值；B0為0濃度異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液發光值；

以抑制率為縱坐標，異細交鏈孢菌酮酸的濃度的對數為橫坐標繪製標準曲線，從而確定樣品中異細交鏈孢菌酮酸的的含量。

優選地，S2所述的待測樣品為啤酒、果汁、番茄醬或大米。

待測樣品前處理方法如下：

啤酒、果汁樣本處理：量取1mL樣品於離心管中，除空白組外其他組直接添加ITeA標準品。加入2mL×2氯仿振蕩萃取以4000r/min離心10min，有機相加入100μL 98％水合肼，振蕩反應30min後，減壓蒸乾溶劑，殘餘物用l mL H2O復溶。

番茄醬處理：稱取1g已勻漿的番茄醬樣品於離心管中，除空白組外其它組直接添加不同濃度水平的ITeA，加入1mL飽和NaCl溶液，混勻後加入2mL×2氯仿振蕩萃取，以4000r/min離心10min，有機相加入100uL 98％水合肼，振蕩反應30min後，減壓蒸乾溶劑，l mL H2O復溶。

本發明方法應用以下原理：

本發明採用間接競爭化學發光酶聯免疫法(ic-CLIA)，設計了使用該方法檢測異細交鏈孢菌酮酸的試劑盒，彌補了現有技術的缺點。

化學發光免疫分析是將化學反光體系與免疫反應相結合，用於檢測微量抗原或抗體的一種新型標記免疫測定技術。其檢測原理是：(1)使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。(2)使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。(3)洗滌後加入發光底物，酶促使發光底物發光，通過專用的儀器檢測光子的數量，從而反算出未知抗原或抗體的濃度。此方法的突出優點表現為靈敏度高，線性動力學範圍寬，光信號持續時間長，分析方法簡便快速，結果穩定、誤差小，安全性好且使用期長。發光檢測儀比吸收光譜儀靈敏100，000倍，比螢光儀至少靈敏1，000倍。相比ELISA免疫分析方法，檢測限至少低一個數量級，因此更靈敏。相比儀器分析方法的優勢表現在：能實現大批量檢測，且更經濟、省時。

與現有技術相比，本發明有益效果在於：本發明提供了一種異細交鏈孢菌酮酸化學發光酶聯免疫檢測試劑盒及其使用方法，其最大檢測範圍為0.2～3.78ng/mL，靈敏度為0.78ng/mL，檢出限為0.032ng/mL，回收率為82.4～105.8％，

該試劑盒檢測快速、大大縮短了檢測時間，不考慮檢測人員操作熟練程度的影響，整個檢測過程僅僅需要70min左右即可完成，且檢出限更低、靈敏度更高。同時，採用包被抗原的包被板大大提升了試劑盒的穩定性和精密度，檢測更穩定、更準確。

另外，本發明所述試劑盒採用化學發光方法，不使用濃硫酸等有強腐蝕性的試劑、以及有強致癌性的底物，更加環保安全。且操作簡單、成本低，非常適合大量樣品或現場篩查，具有重要的實際應用推廣意義。

附圖說明

圖1為異細交鏈孢菌酮酸化學發光的標準曲線。

具體實施方式

下面結合說明書附圖和具體實施例對本發明做進一步詳細說明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明採用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。

實施例1

實施例中所使用試劑的製備方法如下：

包被液：將1.69g碳酸鈉和2.95g碳酸氫鈉溶於1L雙蒸水中得到。

20倍濃縮洗滌液：包含有體積分數0.5％Tween20的pH7.4 0.4mol/L的磷酸鹽緩衝液，使用時用去離子水稀釋成1倍。

封閉液：取0.1g BSA(牛血清白蛋白)、5g甘氨酸、5g蔗糖溶於100mL PBS溶液(0.01mol/L pH7.4)得到。

異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液：用色譜級甲醇將鄰異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液稀釋成1mg/mL備用；再用0.01mol/L pH5.4的PBST稀釋為濃度分別為50ng/mL、12.5ng/mL、3.125ng/mL、0.7812ng/mL、0.1953ng/mL、0.0488ng/mL、0.0122ng/mL的異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液，4℃保存。

化學發光液：化學發光液由A液和B液組成，A液為將20mg對碘苯酚、8mg魯米諾、1.21gTris溶於100mL去離子水，用鹽酸調pH至8.2～8.6得到；B液為將體積分數0.40％的H2O2、1.21g的Tris溶於100mL去離子水，用鹽酸調pH至6.8～7.2得到；使用時將A液和B液按體積比1:1的比例混合。

異細交鏈孢菌酮酸多克隆抗體(2.5mg/mL)：實驗室前期製備。

辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG(10mg/mL)：購自武漢博士得生物工程有限公司。

實施例1異細交鏈孢菌酮酸多克隆抗體、包被原抗體的製備

(1)包被原的製備

採用活潑酯法製備包被原ITeAH-OVA。

(2)異細交鏈孢菌酮酸多克隆抗體的製備

以免疫原ITeAH-BSA作為免疫原分別免疫3隻兔子，將製備好的免疫原與等量的免疫佐劑(第一次免疫用不完全弗氏佐劑，以後加強免疫均用弗氏不完全佐劑)乳化均勻，免疫動物。將2.5～3kg的紐西蘭大白兔分別採用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳緣靜脈多種注射方式免疫，4周後第二次免疫，以後每間隔3周加免一次。第四次加強免疫後1周耳緣靜脈取血，並利用間接競爭ELISA測定血清效價。當效價不再上升是，採用耳緣靜脈加強免疫。一周後心臟採血，水浴0.5～1h，4℃10000離心15min，取上清即為抗血清。抗血清採用硫酸銨沉澱法純化的到多克隆抗體，與-20℃凍存備用。

實施例2化學發光酶聯免疫方法的建立

(1)包被原濃度與抗體濃度的優選

1)將包被原按照31.2、15.6、8.9、5.0、2.5ng/mL用包被液稀釋並縱向包被不透明白色發光板，100μg/mL，37℃孵育過夜，用洗滌液洗滌兩次，吸水紙上拍幹。

2)加入配製好的封閉液150μL/孔進行封閉，37℃過夜，甩幹放入烘箱。

3)加入50μL/孔PBS稀釋好的不同梯度的異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液

4)加入50μL/孔用PBS稀釋的不同梯度的異細交鏈孢菌酮酸多克隆抗體(1:32000、1:64000、1:96000、1:128000)，37℃孵育30min，洗板5次，吸水紙上拍幹。

5)加入100μL/孔稀釋好的二抗，37℃孵育30min，洗板5次，吸水紙上拍幹。

6)加入現配的化學發光液，100μL/孔，用化學發光免疫分析儀測定發光值。以發光值隨包被原濃度有明顯變化的包被抗原濃度和抗體稀釋濃度為最佳濃度進行特異性測定。得到包被原最佳濃度為15.6ng/ml，抗體稀釋倍數為64000倍。

(2)抗體靈敏度的測定

以包被濃度為包被原最佳濃度為15.6ng/ml，抗體稀釋倍數為64000倍，進行抗體靈敏度的測定。

1)取96孔不透明白色發光板，將包被原用稀釋液稀釋至15.6ng/ml，每孔加入100μL，37℃孵育過夜，用洗滌液洗滌兩次，吸水紙上拍幹

2)加入配製好的封閉液150μL/孔進行封閉，37℃過夜，甩幹放入烘箱。

3)分別加入50μL/孔PBS稀釋好的不同梯度的異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液和稀釋64000倍的抗體，37℃孵育30min，洗板5次，吸水紙上拍幹。

4)加入100μL/孔稀釋5000倍的二抗，37℃孵育30min，洗板5次，吸水紙上拍幹。

5)加入現配的化學發光液，100μL/孔，用化學發光免疫分析儀測定發光值。

結果以抑制率計算，抑制率(％)＝B/B0×100(％)，B是不同標準濃度溶液競爭的發光值，B0時不加標準品的發光值，計算50％抑制率是標準品的濃度即為異細交鏈孢菌酮酸多克隆抗體的靈敏度，即為0.78ng/mL。

實施例3酶聯免疫試劑盒的製備

1、準備試劑

(1)包被有異細交鏈孢菌酮酸抗原的酶標板：96孔可拆酶標板，已異細交鏈孢菌酮酸抗原及封閉液，包被濃度為0.05mg/L。所述異細交鏈孢菌酮酸為異細交鏈孢菌酮酸半抗原ITeAH與OVA的偶聯物。

酶標板微孔板的包被：包被抗原用包被液稀釋至0.05mg/L，每孔內加入100μL包被液，37℃孵育過夜，傾去孔內液體，洗滌液洗滌2次，拍幹。然後每孔中加入120μL封閉液，37℃孵育3h，傾去孔內液體，置於37℃烘箱中烘乾後，用鋁箔袋真空密封4℃保存。

(2)異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液的配製：準確稱取異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液，用色譜級甲醇稀釋成1mg/mL，再用0.01mol/L PBST緩衝液(配方為NaH2PO4·12H2O2.9g、NaCl 8.5g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、500μLTween-20，定容至1L)分別配製50ng/mL、12.5ng/mL、3.125ng/mL、0.7812ng/mL、0.1953ng/mL、0.0488ng/mL、0,0122ng/mL異細交鏈孢菌酮酸溶液，4℃保存。

(3)異細交鏈孢菌酮酸多克隆抗體濃度為1mg/mL；其工作濃度為1:64000，用PBS進行稀釋。

(4)化學發光液：由A液和B液組成；使用時將A液和B液按體積比1:1的比例混合。

A液的配製方法為：將20mg對碘苯酚、8mg魯米諾、1.21gTris溶於100mL去離子水，用鹽酸調pH至8.2～8.6得到；

B液的配製方法為：將體積分數0.40％H2O2、1.21gTris溶於100mL去離子水，用鹽酸調pH至6.8～7.2得到。

(5)20倍濃縮洗滌液；使用時用去離子水稀釋成1倍洗滌液。

2、試劑分裝

將各試劑測定合格後無菌分裝，已稀釋好的異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液l mL/瓶，異細交鏈孢菌酮酸多克隆抗體7mL/瓶，A液7mL/瓶，B液7mL/瓶，20倍濃縮洗滌液50mL/瓶。分裝後貼標籤，註明批號和有效期，4℃保存。

3、試劑盒的組裝

分別將上述包被有異細交鏈孢菌酮酸抗原的化學發光酶標板1塊，異細交鏈孢菌酮酸抗體、A液、B液、20倍濃縮洗滌液各1瓶，異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液6瓶和使用說明書1份置於試劑盒內指定位置，試劑盒檢驗合格後封裝，4℃保存。

實施例4異細交鏈孢菌酮酸化學發光酶聯免疫檢測試劑盒的應用

1、利用本發明試劑盒進行檢測

(1)取出試劑盒，置於室溫(20～24℃)平衡30min以上，取出化學發光酶標板，用0.01mol/L PBST緩衝液將異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液稀釋成一系列不同濃度的異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液(0.0μg/L、0.00512μg/L、0.0256μg/L、0.128μg/L、0.64μg/L、3.2μg/L、16μg/L)。

(2)在標準孔加入50μL不同濃度的異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液，樣品孔加入50μL待測樣品，然後每孔加入50μL用0.01mol/L PBST稀釋好的異細交鏈孢菌酮酸標抗體，蓋上蓋板膜在微量振蕩器上振搖10min後，置於37℃孵育30min。

(3)吸除板孔中的反應液，各孔加入洗滌液約300μL，靜置20秒左右，除去其中液體，如此共洗5次，最後一次將板拍幹；也可用自動洗板機洗板5次，洗完後將微孔架倒置在吸水紙上拍打(每輪洗板拍打3次)，以保證完全除去孔中的液體。

(4)每孔加入100μL化學發光液，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，1～2min後用化學發光免疫分析儀測定各孔的發光值RLU，保存數據。

2、檢測結果計算與分析

抑制率(％)＝B/B0×100(％)，

式中：B為不同濃度標準品溶液孔(或待測樣品孔)的發光值；B0為0濃度標準品溶液發光值。

以抑制率為縱坐標，異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液濃度的對數為橫坐標繪製標準曲線，以異細交鏈孢菌酮酸的吸光值代入上述標準曲線中求出待測樣品中異細交鏈孢菌酮酸的含量。不考慮檢測人員操作熟練程度的影響，整個檢測過程僅僅需要80min左右即可完成。檢測結果的分析還可以利用計算機專業軟體進行計算與分析。

3、標準曲線

通過對標準品溶液的檢測結果分析得到異細交鏈孢菌酮酸標準曲線圖(如附圖1所示)，表明了本發明試劑盒對異細交鏈孢菌酮酸的線性檢測範圍為0.2～3.78ng/ml，靈敏度0.78ng/ml，檢出限0.032ng/mL。

實施例4異細交鏈孢菌酮酸化學發光酶聯免疫檢測試劑盒的應用及精密度、準確度試驗

檢測方法同實施例3。

1、待測樣品前處理

(1)啤酒、蘋果汁樣本處理

啤酒、蘋果汁樣本處理：量取1mL樣品於離心管中，除空白組外其他組直接添加ITeA標準品。加入2mL×2氯仿振蕩萃取以4000r/min離心10min，有機相加入100μL 98％水合肼，振蕩反應30min後，減壓蒸乾溶劑，殘餘物用l mL H2O復溶用於分析。

(2)番茄醬處理

稱取1g已勻漿的番茄醬樣品於離心管中，除空白組外其它組直接添加不同濃度水平的ITeA，加入1mL飽和NaCl溶液，混勻後加入2mL×2氯仿振蕩萃取，以4000r/min離心10min，有機相加入100uL 98％水合肼，振蕩反應30min後，減壓蒸乾溶劑，l mL H2O復溶用於分析。

2、異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液的重複性試驗

從3批按照實施例2中的方法製備的酶標板中，各隨機抽出20個微孔，按照實施例3中試劑盒的檢測方法測定0.8μg/L異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液的發光值，重複20次，計算變異係數CV％，結果如表1所示。

表1異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液重複性試驗

結果表明，本發明試劑盒標準品溶液檢測的批內變異係數範圍在4.75～8.5％之間，批間變異係數為7.6％。

2、樣本重複性與準確度試驗

準確度是指測得值與真值的符合程度，在酶聯免疫測定中，準確度常以回收率表示，精密度常以變異係數來表示。在空白樣品中，添加異細交鏈孢菌酮酸至終濃度為0.2、0.6、1.2μg/L，每個濃度各10個平行，測定3批。計算平均值、添加回收率及批內與批間變異係數。結果見表2。

表2樣本重複性與準確度試驗結果

結果表明，醬油、果汁、白酒樣品的添加回收率在80.3～108.9％之間，批內變異係數在3.6～9.3％，批間變異係數3.2～8.2％之間，符合國家對於試劑盒各項指標的標準。

實施例5異細交鏈孢菌酮酸化學發光酶聯免疫檢測試劑盒保存期實驗

1、將實施例2的試劑盒放置於2～8℃，分別取儲存了0、2、4、6、8、9、10、11和12個月的試劑盒，對異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液(0.8μg/L)的吸光度值、50％抑制濃度、添加回收率、批內變異係數各參數進行測定。

2、將試劑盒在37℃保存的條件下放置12天，每天對異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液(0.8μg/L)的吸光度值、50％抑制濃度、添加回收率、批內變異係數各參數進行測定。

3、將試劑盒在－20℃冰箱保存12天，每天對異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液(0.8μg/L)的吸光度值、50％抑制濃度、添加回收率、批內變異係數各參數進行測定。

結果表明，經過三種條件保存試驗，異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液(0.8μg/L)的吸光度值下降小於10％，各項指標均符合質量要求，因此，試劑盒可以在2～8℃保存12個月。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。