具有增強的產量相關性狀的植物及其生產方法

2023-10-09 18:02:29

具有增強的產量相關性狀的植物及其生產方法
【專利摘要】本發明一般涉及分子生物學領域，並涉及通過在植物中提高編碼銨轉運蛋白多肽之核酸序列的表達而提高多種植物產量相關性狀的方法。本發明還涉及具有提高編碼AMT多肽之核酸序列表達的植物，所述植物與對照植物相比具有提高的產量相關性狀。本發明還提供可用於本發明方法的構建體。
【專利說明】具有增強的產量相關性狀的植物及其生產方法
[0001]本申請為2008年11月21日提交的，發明名稱為「具有增強的產量相關性狀的植物及其生產方法」的PCT申請PCT/EP2008/065947的分案申請，所述PCT申請進入中國國家階段的日期為2010年05月24日，申請號為200880117394.1。
[0002]本發明一般涉及分子生物學領域，並涉及通過在植物中提高編碼銨轉運蛋白(型ponium transporter, AMT)多肽之核酸序列的表達而提高多種植物產量相關性狀的方法。本發明還涉及具有表達編碼AMT多肽之核酸序列提高的植物，所述植物與對照植物相比具有提高的產量相關性狀。本發明還提供可用於本發明方法的構建體。
[0003]持續增長的世界人口和農業用可耕地供應萎縮刺激了有關增加農業效率的研究。常規的作物及園藝學改良手段利用選擇育種技術來鑑定具有受歡迎特性的植物。然而，此類選擇育種技術具有幾個缺陷，即這些技術一般耗費很多勞動並且產生這樣的植物，其經常含有異源性遺傳組分，這可能不總是導致所希望性狀從親代植物中傳遞。分子生物學進展已經允許人類改良動物及植物的生殖質。植物的遺傳工程使得可以分離和操作遺傳物質(一般處於DNA或RNA形式)並且隨後引入該遺傳物質至植物中。此類技術具有產生具備多種經濟學、農學或園藝學改良性狀的作物或植物的能力。
[0004]具有特殊經濟意義的性狀是增加的產量。產量通常定義為作物產生的可測量的經濟價值。這可以就數量和/或品質方面進行定義。產量直接取決於幾個因素，例如器官的數目和大小、植物構造(例如枝的數目)、種子產生、葉衰老等。根發育、養分攝入量、脅迫耐性和早期活力(early vigor)也可以是決定產量的重要因素。因此，優化前述因素可以對增加作物產量有貢獻。
[0005]種子產量是特別重要的性狀，這是因為許多植物的種子對於人類和動物營養而言至關重要。諸如玉米、稻、小麥、芸苔(canola)和大豆等作物佔人類總卡路裡攝取量的一半以上，不論是通過種子本身的直接消耗，還是通過由加工的種子所飼養的肉類產品的消耗。它們也是工業加工所用的糖類、油類和多類代謝物的來源。種子含有胚(新的枝條和根的來源)和胚乳(萌發和幼苗早期生長過程中胚生長的營養源)。種子的發育涉及許多基因，並且需要代謝物自根、葉和莖轉移至正在生長的種子。特別是胚乳，同化糖類、油類和蛋白質的代謝前體，將其合成為貯存性高分子，以充盈穀粒。
[0006]植物生物量為飼料作物如苜蓿、青貯穀物和乾草的產量。在穀物作物中使用產量的許多替代參數。其中首要的是估算植物大小。根據物種以及發育階段的不同，可以通過許多方法測量植物大小,但是包括植物總乾重、地上乾重、地上鮮重、葉面積、莖體積、植物高度、蓮座植物直徑、葉長、根長、根生物量、分櫱數和葉數。許多物種在給定的發育階段維持植物不同部分大小間的保守比。利用這些異速生長關係而對這些有關大小的測量結果進行由此及彼的外推(如Tittonell等2005Agric Ecosys&Environl05:213)。早期發育階段的植物大小通常將與晚期發育階段的植物大小有關。具有更大葉面積的較大植物通常能夠比較小的植物吸收更多的光 和二氧化碳，因此很可能在同期增重更多(Fasoula&TolIenaar2005 Maydica50:39)。除了植物所具有的最初達到較大大小的微環境或遺傳優勢的潛在延續，此為其附加效應。植物大小和生長速率存在著強遺傳組分(如ter Steege等2005PlantPhysiology 139:1078),且迄今為止,種種多樣化基因型植物在一種環境條件下的大小很可能與另一種環境條件下的大小有關(Hittalmani等2003Theoretical Applied Genetics107:679)。以這種方式，使用標準環境作為田地中作物在不同時間和地點所遭遇的多樣化動態環境的替代參數。
[0007]對於眾多作物的另一個重要性狀是早期活力。改進早期活力是現代稻育種計劃在溫帶和熱帶稻品種上的重要目標。長根在水栽稻中對於正確土壤固著是重要的。在將稻直接播種至澇田的情況下，以及在植物必須從水中迅速出苗的情況下，較長的苗與萌發勢相關。在實施條播(drill-seeding)的情況下，較長的中胚軸和胚芽鞘對於良好出苗是重要的。人工改造植物內早期活力的能力將在農業中是極其重要的。例如，不良的早期活力已經限制了基於玉米帶生殖質(Corn Belt germplasm)的玉米(Zea mayes L.)雜種在歐洲大西洋地區的引種。
[0008]收穫指數為種子產量與地上乾重的比值，其在許多環境條件下相對穩定，因此在植物大小和穀物產量之間通常能夠獲得比較穩固的相關性(如Rebetzke等2002CropScience42:739)。這些方法固有地聯繫在一起，因為大多數穀物生物量取決於植物葉和莖當前或忙存的光合作用生產力(Gardener等 1985Physiology of Crop Plants.1owa StateUniversity Press, pp68_73)。因此,對植物大小的選擇,甚至是在發育早期階段的選擇，已經用作為未來潛在產量的指標(如Tittonell等2005 Agric Ecosys&Environl05:213)。當測試遺傳差異對脅迫耐性的影響時，溫室或植物培養室與田地相比具有固有的優勢:即能夠使土壤性能、溫度、水和養分的可用性以及光強度標準化。不過，因缺乏風力或昆蟲導致不良授粉，或由於空間不足以讓成熟根或冠層生長等等，對產量造成的這些人工局限性會限制這些控制環境在測試產量差異中的應用。因此，在培養室或溫室標準條件下測量早期發育階段的植物大小，是提供潛在遺傳產量優勢指標的標準方法。
[0009]又一個重要性狀是改進的非生物脅迫耐受性。非生物脅迫是世界範圍作物損失的主要原因，對於大多數主要作物植物而言降低平均產量超過50%(Wang等、Planta(2003)218:l-14`)。非生物脅迫可以由乾旱、鹽度、極端溫度、化學毒性、養分(大量元素和/或微量元素)過剩或缺乏、輻射和氧化脅迫引起。提高植物對非生物脅迫耐受性的能力將在世界範圍對農民具有極大的經濟優勢並且會允許在不利條件期間及在作物栽培否則是不可能的陸地上栽培作物。
[0010]作物產量因而可以通過優化前述因素之一而增加。
[0011]取決於最終用途，對某些產量性狀的改良可能優先於其它產量性狀。例如對於應用如飼料或木材生產或生物燃料資源而言，增加植物營養體部分可能是希望的，而對於應用如麵粉、澱粉或油生產而言，增加種子參數可能是尤其希望的。即便在種子參數當中，某些參數可以更優先於其它參數，這取決於應用。多種機制可以對增加種子產量有貢獻，無論形式為增加的種子大小或是增加的種子數目。
[0012]增加植物中產量相關性狀(種子產量和/或生物量)的一種方法可以是通過調節植物的內在生長機制如細胞周期或參與植物生長或參與防禦機制的多種信號途徑。
[0013]現已發現可以通過提高植物中的編碼銨轉運蛋白(AMT)多肽的核酸序列在植物中表達而改進植物中的多種產量相關性狀。所述提高的產量相關性狀包括以下一種或多種:提高的早期活力、提高的地上部分生物量、提高的根生物量、提高的每株植物種子總產量、提聞的種子飽滿率、提聞的飽滿種子數和提聞的收穫指數。
[0014]背景
[0015]銨和硝酸鹽是植物生長和發育的主要氮源。植物需要轉運蛋白來獲得銨和硝酸鹽。銨和硝酸鹽的轉運蛋白不僅存在於植物中，而且存在於幾乎所有生物中。銨轉運蛋白(AMT)通常在基因組中作為基因家族存在，例如至少在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中有 6 種，萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii )中有 8 種(Gonzales-Ballester等(2004)Plant Molec Biol56:863-878)，楊中有 14 種(Couturier 等(2007)NewPhytologistl74:137-150),三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)這種娃藻中有 6 種(Allen(2005)J Phycology41)。
[0016]基於系統進化分析，鑑定了銨轉運蛋白的3個亞家族(Loqu6&von Wiren(2004) JExp Bot55(401):1293-1305):
[0017]1.AMT亞家族，包括植物AMTl型轉運蛋白和藍細菌銨轉運蛋白；
[0018]2.MEP亞家族，包括植物AMT2型轉運蛋白、酵母MEP轉運蛋白、大腸桿菌AmtB和其他原核同源物；
[0019]3.Rh亞家族，僅包括人和動物RH血型抗原。
[0020]所有AMT多肽都是高度疏水的膜蛋白，具有至少10個(通常11個)推定的跨膜螺旋。許多報導顯示AMT多肽能在寬濃度範圍內攝入銨，但親和力在不同生物之間有差異。在某些生物(如植物)中，鑑定了高親和力和低親和力銨轉運蛋白(Gazzarini等(1999)PlantCell 11:937-47)。除了親和力特性以外，還鑑定了銨攝取的其他調節機制，例如在轉錄和轉錄水平上(Yuan 等(2007) Plant Phys 143:732-744)。
[0021]使用組成型表達的玉米泛素啟`動子,在兩個稻栽培種(Taipei309和Jarrah)中過表達了來自稻的編碼AMTl的核酸序列。與野生型相比，轉基因株系的嫩枝和根的生物量在幼苗和早期營養階段出現下降，特別是在高銨營養下培養時(Hoque等(2006)FunctionalPlant Biol 33:153-163)。作者推斷，轉基因植物在早期生長階段的生物量下降可能是因為由於銨同化不能與更高的銨攝取相匹配而導致銨在根中積累。
[0022]美國專利6，620, 610描述了編碼來自擬南芥的AMTl多肽的核酸序列、包含所述編碼AMTl之核酸序列的用於在酵母和細菌中表達的載體。
[0023]美國專利6，833，492描述了編碼來自大豆、玉米、小麥和稻的AMTl多肽的核酸序列。描述了編碼AMTl多肽或者與分離的大豆AMTl多肽具有90%胺基酸序列同一性之AMT多肽的核酸序列。描述了包含編碼這些多肽序列的重組核酸序列的植物和種子，以及產生這些植物的方法。
[0024]意想不到的是，現在發現提高編碼AMT多肽之核酸序列的表達給予植物與對照植物相比提高的產量相關性狀。
[0025]根據一個實施方案，提供了在植物中與對照植物相比提高產量相關性狀的方法，包括在植物中提高編碼本文所述AMT多肽之核酸序列的表達。提高的產量相關性狀包括以下一種或多種:提聞的早期活力、提聞的地上部分生物量、提聞的根生物量、提聞的每株植物種子總廣量、提聞的種子飽滿率、提聞的飽滿種子數、提聞的每花序花數和提聞的收穫指數。
[0026]定義[0027]多肽/蛋白質
[0028]術語「多肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用，指處於任意長度聚合形式中的通過肽鍵連接在一起的胺基酸。
[0029]多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
[0030]術語「多核苷酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」、「核酸」在本文中可互換使用並且指處於任意長度聚合無分支形式中的核苷酸，即核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或這二者組
口 ο
[0031]對照植物
[0032]選擇合適的對照植物是實驗設置的慣用部分並且可以包括對應的野生型植物或無目的基因的對應植物。對照植物一般是與待評價植物相同的植物物種或甚至是相同的品種。對照植物也可以是待評價植物的失效合子。如本文中所用的「對照植物」不僅指整株植物，還指植物部分，包括種子及種子部分。
[0033]同源物
[0034]蛋白質的「同源物」包括這樣的肽、寡肽、多肽、蛋白質及酶，它們相對於非修飾的所討論蛋白質具有胺基酸替換、缺失和/或插入並且與衍生其的非修飾蛋白質具有相似生物學活性和功能活性 。
[0035]缺失指從蛋白質中移除一個或多個胺基酸。
[0036]插入指一個或多個胺基酸殘基在蛋白質中預定位點內的引入。插入可以包含單個或多個胺基酸的氨基端融合和/或羧基端融合以及序列內插入。通常，在胺基酸序列內部的插入會比氨基端融合或羧基端融合更小，約1-10個殘基級別。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的實例包括如酵母雙雜交系統中所用轉錄激活物的結合結構域或激活結構域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)-6-標籤、穀胱甘肽S-轉移酶-標籤、蛋白A、麥芽糖結合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag.100表位、c-myc表位、FLAG -表位、lacZ、CMP (鈣調蛋白結合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
[0037]替換指以具有相似特性(如相似疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞α -螺旋結構或摺疊結構的傾向)的其它胺基酸替換蛋白質的胺基酸。胺基酸替換一般是單個殘基的，不過可以是簇集性的，這取決於置於多肽的功能性約束；插入通常會是約1-10個胺基酸殘基級別。胺基酸替換優選地是保守性胺基酸替換。保守性替換表是本領域眾所周知的(見例如 Creighton (1984) Proteins W.H.Freeman and Company 編輯和下表 I)。
[0038]表1:保守性胺基酸替換的實例
[0039]
~j保守性替換j殘基j保守性替換
Ala SerLeu He ；Val
Arg LysLys Arg ；Gln

Asn Gln ；His Met Leu ；Ile
Asp GluPhe Met ；Leu ；Tyr
【權利要求】
1.與對照植物相比在植物中提高產量相關性狀的方法，其包括:在植物中提高編碼銨轉運蛋白(AMT)多肽之核酸序列的表達；以及任選地選擇具有提高的產量相關性狀的植物，其中所述AMT多肽包含與SEQ ID NO: 33所示保守結構域(⑶)以遞增優選順序具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高胺基酸序列同一性的結構域，其中所述AMT多肽與SEQ ID NO:4所示AMT多肽以遞增優選順序具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高胺基酸序列同一性。
2.根據權利要求1的方法，其中所述編碼AMT多肽的核酸序列為SEQID NO: 3所示的核酸序列，或者是能夠與SEQ ID NO:3所示的核酸序列雜交的序列。
3.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述提高的表達通過以下任何一種或多種來實現:T-DNA激活標籤化、TILLING或同源重組。
4.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述提高的表達通過在植物中引入並表達編碼AMT多肽的核酸序列來實現。
5.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述提高的產量相關性狀為以下一種或多種:提聞的早期活力、提聞的地上部分生物量、提聞的根生物量、提聞的每株植物種子總廣量、提聞的種子飽滿率、提聞的飽滿種子數或提聞的收穫指數。
6.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述核酸序列與組成型啟動子有效連接，優選與植物組成型啟動子有效連接，更優選與GOS2啟動子有效連接，最優選與如SEQ IDNO: 34所示的來自稻的GOS2啟動子有效連接。
7.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述編碼AMT多肽的核酸序列來自不等鞭毛門，優選來自硅藻綱，更優選來自羽紋目，最優選來自三角褐指藻。
8.構建體，其包含: (a)編碼權利要求1或2所定義AMT多肽的核酸序列； (b)能驅動(a)的核酸序列表達的一種或多種控制序列；和任選的 (C)轉錄終止序列。
9.根據權利要求8的構建體，其中所述控制序列為植物組成型啟動子，優選GOS2啟動子，更優選如SEQ ID NO:34所示的GOS2啟動子。
10.根據權利要求8或9的構建體在用於產生與對照植物相比具有提高的產量相關性狀之植物的方法中的用途，其中所述提高的產量相關性狀為以下一種或多種:提高的早期活力、提聞的地上部分生物量、提聞的根生物量、提聞的每株植物種子總廣量、提聞的種子飽滿率、提高的飽滿種子數或提高的收穫指數。
11.用於產生與對照植物相比具有提高的產量相關性狀的轉基因植物的方法，其包括: (i)在植物、植物部分或植物細胞中引入並表達編碼權利要求1或2所定義AMT多肽的核酸序列，其處於植物組成型啟動子的控制之下；和 (ii)在促進植物生長和發育的條件下培養所述植物細胞、植物部分或植物。
12.編碼權利要求1或2所定義AMT多肽的核酸序列在提高植物產量相關性狀中的用途，所述提高的產量相關性狀包括以下一種或多種:提高的早期活力、提高的地上部分生物量、提聞的根生物量、提聞的每株植物種子總廣量、提聞的種子飽滿率、提聞的飽滿種子數和提聞的收穫指數。
【文檔編號】C12N15/82GK103773795SQ201310734030
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2008年11月21日 優先權日:2007年11月22日
【發明者】V·弗蘭卡德, A·艾倫, C·鮑勒 申請人:克羅普迪塞恩股份有限公司