纖維狀脫鈣骨基質的製備方法

2023-06-11 14:03:06 3

纖維狀脫鈣骨基質的製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種纖維狀脫鈣骨基質的製備方法，其包括下述步驟：（a）將分離到體外的骨在酸性溶液中進行1-5小時的第1次脫鈣；（b）將從步驟（a）得到的骨切成0.1-3mm厚的片狀骨；（c）將從步驟（b）得到的片狀骨在酸性溶液中進行2-6小時的第2次脫鈣；及（d）將從步驟（c）得到的經過脫鈣的骨進行粉碎。
【專利說明】纖維狀脫鈣骨基質的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及纖維狀脫鈣骨基質的改善的製備方法，具體地，涉及包括部分脫鈣、切害I]、完全脫鈣及粉碎步驟的纖維狀脫鈣骨基質的改善的製備方法。
【背景技術】
[0002]將骨浸潰在酸中去除骨中的礦物質成分的部分稱為脫鈣骨基質(demineralizedbone matrix, DBM)。脫鈣骨基質大部分由高度交聯的骨膠原構成,殘存的非骨膠原性蛋白質包括轉化生長因子_β (TGF - β)、血小板源性生長因子(PDGF)、骨橋蛋白、骨粘連蛋白、骨形態生成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)等。脫鈣骨基質以用於修復骨缺損等為目的的骨移植用組合物的形態使用。
[0003]脫鈣骨基質對分離到體外的骨進行脫鈣步驟之後，將此粉碎為適當的大小，製備成顆粒形態。本發明發明人公開過具有0.05-250μπι顆粒大小的脫鈣骨基質；具有250-2000 μ m的顆粒大小的脫鈣骨基質；及以特定比例混合水合物的骨再生用組合物，所述組合物具有優異的注入性及形態維持性(處理性)(韓國授權專利第10-1041784號)。
[0004]另外，皮質骨(cortical bone)平行於骨的長軸並由骨膠原纖維束(fiber bundles)構成，已知由此得到的纖維狀脫鈣骨基質在骨修復及其它整形外科的移植方面具有有用的性質。纖維狀脫鈣骨基質通過將分離到體外的皮質骨利用特殊粉碎機(例如，美國專利第5，607，269號)粉碎至得 到纖維狀顆粒，然後進行脫鈣而製備。但是這種製備方法由於受到粉碎儀器的機械方面的限制，只能使用天然的皮質軸(intact cortical shafts)作為骨原料，且得到的纖維狀脫鈣骨收率低。為了改善上述問題，美國專利第7，323，193號及第7，939，108號中公開了將分離到體外的骨切斷成適當大小，並在酸性溶液中進行6小時的脫鈣後，再在酸性溶液中進行2天的脫鈣，然後將其進行粉碎，從而製備纖維狀脫鈣骨基質的方法。但是上述美國專利第7，323，193號及第7，939，108號中公開的製備方法，需要進行長達2日，即48小時的長時間的脫鈣步驟。

【發明內容】

[0005]發明目的
[0006]本發明發明人為了開發出具有有用的性質的纖維狀脫鈣骨基質的製備方法，尤其是能夠改善長時間的脫鈣步驟的製備方法，進行了多種研究。結果將部分脫鈣而得到的骨進行切割製備成薄片狀形態後，將此進行脫鈣時，驚奇地發現能夠將脫鈣步驟顯著縮短至約6小時左右，且脫鈣骨基質具有纖維狀形態的同時能夠以高收率獲得。
[0007]從而，本發明的目的在於通過依次進行部分脫鈣、切割、完全脫鈣及粉碎步驟的纖維狀脫鈣骨基質的製備方法。
[0008]技術方案
[0009]本發明涉及一種纖維狀脫鈣骨基質的製備方法，其包括下述步驟:(a)將分離到體外的骨在酸性溶液中進行1-5小時的第1次脫鈣；(b)將從步驟(a)得到的骨切割(slicing)成0.l_3mm厚的片狀骨；(c)將從步驟(b)得到的片狀骨在酸性溶液中進行2-6小時的第2次脫鈣；及((1)將從步驟(c)得到的經過脫鈣的骨進行粉碎。
[0010]根據本發明的纖維狀脫鈣骨基質的製備方法，所述步驟(a)和步驟(C)的所述酸性溶液可以相互獨立地為0.1-3N的HCl水溶液，優選所述步驟(a)和步驟(c)的所述酸性溶液可以為0.6N的HCl水溶液。此外，可以以獲得具有1000-5000 μ m範圍長度的纖維狀脫鈣骨基質來實施所述粉碎。
[0011]發明效果
[0012]根據本發明，依次進行部分脫鈣、切割、完全脫鈣及粉碎步驟時，發現能夠將脫鈣步驟顯著縮短至約6小時左右。尤其通過引入切割步驟，不僅縮短了脫鈣步驟的時間，而且還能夠使最終得到的脫鈣骨基質以具有纖維形態的脫鈣骨基質高收率地獲得。因此，本發明的製備方法能夠適用於工業規模的大量生產。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是表示將部分脫鈣的骨進行切割後得到的骨(A)及將脫鈣的骨進行粉碎後得到的骨(B)。
[0014]圖2是表示纖維狀脫鈣骨基質(A)和顆粒狀脫鈣骨基質(B)的形態的光學顯微鏡測定照片。
【具體實施方式】
[0015]本發明提供一種纖維狀脫鈣骨基質的製備方法，其包括下述步驟:(a)將分離到體外的骨在酸性溶液中進行1-5小時的第1次脫鈣；(b)將從步驟(a)得到的骨切割成
0.1-3mm厚的片狀骨；(c)將從步驟(b)得到的片狀骨在酸性溶液中進行2_6小時的第2次脫鈣；及((1)將從步驟(c)得到的經過脫鈣的骨進行粉碎。
[0016]本發明的製備方法依次進行部分脫鈣、切割、完全脫鈣及粉碎步驟，尤其是通過部分脫鈣及切割步驟，不僅能夠將接下來的脫鈣步驟顯著縮短至約6小時左右，還能夠高收率製備具有纖維形態的脫鈣骨基質。
[0017]本發明的製備方法包括部分脫鈣步驟，即將分離到體外的骨在酸性溶液中進行1-5小時的第1次脫鈣的步驟(即步驟(a))。所述分離到體外的骨可以是包括人類的哺乳動物的骨。所述分離到體外的骨優選按照通常的方法將附著於骨的軟組織、脂肪、骨髓等去除之後使用。所述去除通常可以使用60-90重量％的乙醇溶液進行，根據需要可以額外使用表面活性劑。所述酸性溶液通常可以使用HCl水溶液，可以使用0.1-3N的HCl水溶液，優選使用約0.6N的HCl水溶液。所述第1次脫鈣時間可以是1-5小時，優選約3小時。
[0018]本發明的製備方法包括將部分脫鈣的骨切割成片狀形態的切片步驟，即，將從部分脫鈣步驟中得到的骨切割成0.l_3mm厚的片狀骨的步驟(即步驟(b))。所述切割只要是能夠將骨切成薄片的機器均可使用，例如可以使用骨切割機(Bone Slicer) (YOU IL MC/C0.KR)等的骨切片器(bone slicer)。通過所述切割步驟得到的片狀骨的厚度為0.l_3mm，優選0.2-1.0mm,更優選0.3-0.6mm,最優選約為0.5mm。厚度超過3.0mm時,骨形態為粉碎的顆粒形態而不是片狀；厚度小於0.1mm時，雖然能夠得到片狀，但即使脫鈣也無法得到纖維狀而只能夠得到顆粒狀。[0019]本發明包括將部分脫鈣的片狀骨完全脫鈣的步驟，即將上述得到的片狀骨在酸性溶液中進行2-6小時的第2次脫鈣的步驟(即步驟(C))。所述酸性溶液通常可以使用HCl水溶液，可以使用0.1-3N的HCl水溶液，優選使用約0.6N的HCl水溶液。本發明公開了以下內容，第2次脫鈣，即完全脫鈣可以以相比以往的脫鈣時間顯著縮短的2-6小時，優選約3小時以內的時間進行。
[0020]本發明包括將完全脫鈣的骨進行粉碎的步驟(即步驟(d))。所述粉碎步驟可以使用通常的粉碎機實施。其中，優選地以獲得具有1000-5000μπι，更優選地以獲得2000-4000 μ m範圍長度的纖維狀脫鈣骨基質來實施所述粉碎，所述粉碎可以根據粉碎機的種類來設定適合的粉碎條件，從而獲得上述纖維狀脫鈣骨基質。
[0021]下面，通過實施例詳細說明本發明。但是，以下實施例僅是例示本發明，本發明並不僅限於此。 [0022]實施例1
[0023]將來自人供體的骨(重量:約172g)利用手術器械去除附著在骨上的軟組織，使用含有表面活性劑的組織洗滌劑去除軟組織、脂肪及骨髓等雜質，然後切斷成兩半。將切斷的骨在相對於每克骨重量為20ml的0.6N的HCl水溶液中浸潰3小時，從而進行部分脫鈣。將部分脫鈣的骨進行回收，在相對於每克骨重量為20ml的蒸餾水中浸潰，從而去除骨中的脫鈣溶液。將得到的骨利用骨切片器(bone slicer, YOU IL MC/C0.KR)切片成0.5mm厚度的片狀。得到的片狀骨如圖1A所示。將得到的片狀骨在相對於每克骨重量為0.6N的HCl水溶液30ml中浸潰3小時，進行完全脫鈣。將脫鈣骨基質進行沉澱而分離後，放入粉碎機(ΙΚΑ，M20通用粉碎機(Univeral mill), GR)中粉碎約10分鐘，然後使用磷酸緩衝液(PBS)進行中和，用蒸餾水洗滌，然後進行冷凍乾燥得到約31g的脫鈣骨基質。利用光學顯微鏡觀察得到的脫鈣骨基質的照片如圖2A所示。從圖2A中可以確認得到的脫鈣骨基質為纖維狀脫鈣骨基質。
[0024]比較例I
[0025]將來自人供體的骨(重量:約165g)利用手術器械去除附著在骨上的軟組織，使用含有表面活性劑的組織洗滌劑去除軟組織、脂肪及骨髓等雜質，然後切斷成兩半。將切斷的骨在相對於每克骨重量為0.6N的HCl水溶液20ml中浸潰3小時，從而進行部分脫鈣。將部分脫鈣的骨進行回收，在相對於每克骨重量的蒸餾水20ml中浸潰，從而去除骨中的脫鈣溶液。將得到的骨在相對於每克骨重量為0.6N的HCl水溶液30ml中浸潰3小時，再次進行脫鈣步驟，但是脫鈣幾乎沒有進行，無法得到脫鈣骨基質。
[0026]比較例2
[0027]將來自人供體的骨(重量:約192g)利用手術器械去除附著在骨上的軟組織，使用含有表面活性劑的組織洗滌劑去除軟組織、脂肪及骨髓等雜質，然後切斷成兩半。將切斷的骨在相對於每克骨重量為0.6N的HCl水溶液20ml中浸潰3小時，從而進行部分脫鈣。將部分脫鈣的骨進行分離，在相對於每克骨重量的蒸餾水20ml中浸潰，從而去除骨中的脫鈣溶液。將得到的骨放入粉碎機(ΙΚΑ, M20通用粉碎機，GR)中粉碎約60分鐘得到粉碎的骨，其形態如圖1B所示。將上述粉碎的骨在相對於每克骨重量為0.6N的HCl水溶液30ml中浸潰3小時，進行完全脫鈣。脫鈣骨基質進行沉澱分離後，使用磷酸緩衝液(PBS)進行中和，用蒸餾水洗滌，然後進行冷凍乾燥得到約36.4g的脫鈣骨基質。利用光學顯微鏡觀察得到的 脫鈣骨基質的照片如圖2B所示。從圖2B中可以確認得到的脫鈣骨基質為顆粒狀脫鈣骨基質。
【權利要求】
1.一種纖維狀脫鈣骨基質的製備方法，其特徵在於，該方法包括下述步驟:(a)將分離到體外的骨在酸性溶液中進行1-5小時的第1次脫鈣；(b)將從步驟(a)得到的骨切割成.0.1-3mm厚的片狀骨；(c)將從步驟(b)得到的片狀骨在酸性溶液中進行2_6小時的第2次脫鈣；及((1)將從步驟(c)得到的經過脫鈣的骨進行粉碎的步驟。
2.根據權利要求1所述的纖維狀脫鈣骨基質的製備方法，其中，所述步驟(a)和步驟(c)的所述酸性溶液相互獨立地為0.1-3N的HCl水溶液
3.根據權利要求2所述的纖維狀脫鈣骨基質的製備方法，其中，所述步驟(a)和步驟(c)的所述酸性溶液為0.6N的HCl水溶液。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的纖維狀脫鈣骨基質的製備方法，其中，以獲得具有1000-5000 μ m範圍長度的纖維狀脫鈣骨基質來實施所述粉碎。
【文檔編號】A61L27/38GK103998070SQ201180073750
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2011年10月11日 優先權日:2011年9月29日
【發明者】宋錫範, 鄭求源, 蘇怔援, 徐漢率, 柳眩承, 金貴南, 金炳奭 申請人:Cg生物技術有限公司