中間蒼白桿菌及微生物菌劑和它們的應用的製作方法

2023-10-09 10:26:44

中間蒼白桿菌及微生物菌劑和它們的應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種中間蒼白桿菌，其保藏編號為CGMCC?NO.8839。本發明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑含有菌體和培養基，所述菌體包括保藏編號為CGMCC?NO.8839的中間蒼白桿菌。本發明還提供了如上所述的中間蒼白桿菌和如上所述的微生物菌劑在降解菸鹼類農藥中的應用。通過上述技術方案，本發明可以更加有效地降低土壤中菸鹼類農藥的殘留量。
【專利說明】中間蒼白桿菌及微生物菌劑和它們的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及農業生物【技術領域】，具體地，涉及一種中間蒼白桿菌、一種微生物菌劑和它們的應用。
【背景技術】
[0002]菸鹼類殺蟲劑是乙醯膽鹼酶受體抑制劑，作用於昆蟲中樞神經系統，高效、有選擇性、對哺乳動物安全，且與多數傳統的農藥之間不存在交互抗性。其中，具有殺蟲活性的菸鹼類化合物最早由殼牌公司發現，隨後對該結構進行了不斷的優化並得到了具有高殺蟲活性的噻蟲醛，其後該類化合物受到了廣泛的開發和研究。目前已經商品化的菸鹼類殺蟲劑包括吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、氯噻啉、噻蟲啉、噻蟲嗪、噻蟲胺和呋蟲胺。
[0003]菸鹼類農藥的產量佔到了全球農藥產量的15-20%。菸鹼類農藥的大量使用，對土壤和地下水造成了一 定的汙染。因此，降解菸鹼類農藥是急需實施的環保措施。
[0004]應用微生物降解法來降解菸鹼類農藥，具有環境友好的優勢，但是，目前，現有的微生物菌株降解菸鹼類農藥的效果仍然較差。

【發明內容】

[0005]本發明的發明人分離了一株中間蒼白桿菌，發現其具有優異的降解菸鹼類農藥的效果，由此得到了本發明。為了克服菸鹼類農藥降解能力較低的缺陷，本發明提供了一種中間蒼白桿菌，該中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)的保藏編號為CGMCC N0.8839。
[0006]本發明還提供了一種微生物菌劑,該微生物菌劑含有菌體和培養基，所述菌體包括保藏編號為CGMCC N0.8839的中間蒼白桿菌。
[0007]本發明還提供了如上所述的中間蒼白桿菌和如上所述的微生物菌劑在降解菸鹼類農藥中的應用。
[0008]通過上述技術方案，本發明可以更加高效地降解菸鹼類農藥，從而有助於有效地降低土壤和地下水中菸鹼類農藥的殘留。
[0009]本發明的其他特徵和優點將在隨後的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
[0010]生物材料保藏
[0011]本發明的中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)是本發明的發明人從山東煙臺採集的規模化沼氣工程沼液樣品中分離的純培養物，其保藏編號為CGMCC N0.8839，保藏日期為2014年2月21日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址位於北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，分類命名為中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)。
【具體實施方式】
[0012]以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用於說明和解釋本發明，並不用於限制本發明。[0013]本發明提供了一種中間蒼白桿菌，該中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)的保藏編號為CGMCC N0.8839。
[0014]本發明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑含有菌體和培養基，所述菌體包括保藏編號為CGMCC N0.8839的中間蒼白桿菌。
[0015]其中，所述微生物菌劑中含有的菌體的量可以在很大範圍內改變，例如每克所述微生物菌劑中，保藏編號為CGMCC N0.8839的中間蒼白桿菌的活菌數可以為(5-200) X IO7CFU,優選情況下，每克所述微生物菌劑中，保藏編號為CGMCC N0.8839的中間蒼白桿菌的活菌數 可以為(20-120) X 107CFU。
[0016]根據本發明，所述培養基的種類可以在很大範圍內改變，可以將各種能夠用於培養中間蒼白桿菌的培養基，例如，可以為牛肉膏蛋白腖培養基、肉湯培養基、LB培養基等常用培養基作為種子培養基，用於菌種的保存；而發酵的培養基一般用於生產，這些培養基的種類也為本領域技術人員所公知。上述培養基能夠商購得到或者根據「微生物培養基手冊」(Microbiology Culture Media Manual)的記載製備得到。例如，種子培養基可以為牛肉膏蛋白腖培養基，其含有l_3g/L的牛肉膏、5-15g/L的蛋白腖、3-8g/L的氯化鈉和15-20g/L的瓊脂。例如發酵培養基可以含有:40-150g/L的玉米粉、40_150g/L的澱粉、40-150g/L的蔗糖、10-100g/L的豆油、0.5_8g/L的氯化鈉、0.5_5g/L的碳酸鈣、2_10g/L的磷酸二氫鉀和l-10g/L的硫酸亞鐵。
[0017]其中，上述各種培養基可以按照常規的滅菌方法進行滅菌後備用，例如在115-125°C和1.5-2個標準大氣壓的條件下滅菌10_30分鐘。
[0018]其中，為了方便所述微生物菌劑的貯藏和使用，所述微生物菌劑可以製成固體顆粒劑，優選地，所述微生物菌劑還含有惰性固體載體和粘結劑；所述惰性固體載體包括粘土、二氧化矽、硅藻土、高嶺土、凹凸棒土、蒙脫土、膨潤土、滑石粉、白碳黑和碳酸鈣中的至少一種；所述粘結劑包括麥芽糖和/或糊精。
[0019]其中，優選地，所述微生物菌劑中，惰性固體載體的含量為30-90重量所述粘結劑的含量為5-20重量％。
[0020]其中，所述微生物菌劑的製備方法可以包括:將CGMCC N0.8839的中間蒼白桿菌接種於發酵培養基中進行培養。優選情況下，通過培養使得到的每克所述微生物菌劑中，保藏編號為CGMCC N0.8839的中間蒼白桿菌的活菌數可以為(5-200) X IO7CFU,更優選為(20-120) X 107CFU。其中，培養的溫度可以為28-35°C，培養的時間可以為10-50小時。
[0021]優選地，所述微生物菌劑的製備方法還可以包括:將在發酵培養基中進行培養後得到的物料與惰性固體載體和粘結劑混合；所述惰性固體載體包括粘土、二氧化矽、硅藻土、高嶺土、凹凸棒土、蒙脫土、膨潤土、滑石粉、白碳黑和碳酸鈣中的至少一種；所述粘結劑包括麥芽糖和/或糊精。優選地，惰性固體載體和粘結劑的用量使得所述微生物菌劑中，惰性固體載體的含量為30-90重量％ ;所述粘結劑的含量為5-20重量％。其中，混合後的物料可以進一步乾燥制粒為顆粒劑。
[0022]本發明還提供了如上所述的中間蒼白桿菌和如上所述的微生物菌劑在降解菸鹼類農藥中的應用。
[0023]其中，所述菸鹼類農藥可以包括吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、氯噻啉、噻蟲啉、噻蟲嗪、噻蟲胺和呋蟲胺中的至少一種[0024]以下通過實施例進一步詳細說明本發明:
[0025]實施例1
[0026]本實施例用於說明本發明的中間蒼白桿菌的培養及微生物菌劑的製備。
[0027]將保藏編號為CGMCC N0.8839 的中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)接種到LB培養基(含10g/L的胰蛋白腖、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30°C和200轉/分振蕩下培養至菌密度OD6tltl值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0028]將IOOmL上述種子菌液加入100L發酵培養基中(發酵培養基含有80g/L的玉米粉、80g/L的澱粉、80g/L的鹿糖、40g/L的豆油、3g/L的氯化鈉、3g/L的碳酸鈣、5g/L的磷酸二氫鉀和5g/L的硫酸亞鐵)，在30°C下培養，在培養過程中進行取樣並通過顯微鏡直接計數法進行觀察，直至每克培養液中的中間蒼白桿菌的活菌數為IO9CFU,所得的培養液即為本實施例的微生物菌劑。
[0029]實施例2[0030]本實施例用於說明本發明的中間蒼白桿菌的培養及微生物菌劑的製備。
[0031]將保藏編號為CGMCC N0.8839 的中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)接種到LB培養基(含10g/L的胰蛋白腖、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30°C和200轉/分振蕩下培養至菌密度OD6tltl值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0032]將IOOmL上述種子菌液加入100L發酵培養基中(發酵培養基含有80g/L的玉米粉、80g/L的澱粉、80g/L的鹿糖、40g/L的豆油、3g/L的氯化鈉、3g/L的碳酸鈣、5g/L的磷酸二氫鉀和5g/L的硫酸亞鐵)，在30°C下培養，在培養過程中進行取樣並通過顯微鏡直接計數法進行觀察，直至每克培養液中的中間蒼白桿菌的活菌數為IO9CFU,在所得到的培養液(實測含水約65重量％)中加入硅藻土和粘結劑(糊精)，相對於每升的培養液，加入的硅藻土為500g，粘結劑為140g，然後將混合物在造粒機上過16目篩造粒，再用60°C的熱空氣烘乾，實時測定水份含量，直至水份含量為4重量％左右，即得到本實施例的微生物菌劑，測得該微生物菌劑中，活菌數為7 X 108CFU/g。
[0033]實施例3
[0034]按照實施例1的方法製備微生物菌劑，不同的是，所用的發酵培養基為含有60g/L的玉米粉、100g/L的澱粉、50g/L的鹿糖、80g/L的豆油、2g/L的氯化鈉、4g/L的碳酸鈣、3g/L的磷酸二氫鉀和3g/L的硫酸亞鐵的培養基。
[0035]對比例I
[0036]將購自中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)的商品號為1511C0001ACCC02996 的蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)接種到 LB 培養基(含 IOg/L的胰蛋白腖、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30°C和90轉/分振蕩下培養至菌密度OD6tltl值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0037]將IOOmL上述種子菌液加入100L發酵培養基中(發酵培養基含有80g/L的玉米粉、80g/L的澱粉、80g/L的鹿糖、40g/L的豆油、3g/L的氯化鈉、3g/L的碳酸鈣、5g/L的磷酸二氫鉀和5g/L的硫酸亞鐵)，在30°C下培養，在培養過程中進行取樣並通過顯微鏡直接計數法進行觀察，直至每克培養液中的蒼白桿菌的活菌數為IO9CFU,所得到的培養液即為本對比例的微生物菌劑。
[0038]測試實施例1[0039]本測試實施例中，在實驗室環境測試實施例1-3和對比例I的微生物菌劑的降解菸鹼類農藥的效果。
[0040]分別配製添加有100mg/L菸鹼類農藥的LB培養基(含10g/L的胰蛋白腖、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)，其中吡菸鹼類農藥分別為吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、氯噻啉、噻蟲啉、噻蟲嗪、噻蟲胺和呋蟲胺。然後測定實施例1-3和對比例I的微生物菌劑的溶磷圈和溶磷量。然後對IOOmL添加了每一種菸鹼類農藥的LB培養基中，將實施例1_3和對比例I的微生物菌劑各取0.05g分別加入，30°C培養2天後，高效液相色譜法測量培養基上清中的菸鹼類農藥的殘餘量，並計算降解率。結果如表1所示。
[0041]表1
[0042]
【權利要求】
1.一種中間蒼白桿菌，其特徵在於:該中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)的保藏編號為CGMCC N0.8839。
2.一種微生物菌劑，該微生物菌劑含有菌體和培養基，其特徵在於:所述菌體包括保藏編號為CGMCC N0.8839的中間蒼白桿菌。
3.根據權利要求2所述的微生物菌劑，其特徵在於:每克所述微生物菌劑中，保藏編號為CGMCC N0.8839的中間蒼白桿菌的活菌數為(5-200) X 107CFU。
4.根據權利要求2或3所述的微生物菌劑，其特徵在於:所述培養基包括牛肉膏蛋白腖培養基、肉湯培養基和LB培養基中的至少一種。
5.根據權利要求2或3所述的微生物菌劑，其特徵在於:所述培養基含有40-150g/L的玉米粉、40-150g/L的澱粉、40-150g/L的蔗糖、10_100g/L的豆油、0.5_8g/L的氯化鈉、.0.5-5g/L的碳酸鈣、2-10g/L的磷酸二氫鉀和l-10g/L的硫酸亞鐵。
6.根據權利要求2或3所述的微生物菌劑，其特徵在於:所述微生物菌劑還含有惰性固體載體和粘結劑；所述惰性固體載體包括粘土、二氧化矽、硅藻土、高嶺土、凹凸棒土、蒙脫土、膨潤土、滑石粉、白碳黑和碳酸鈣中的至少一種；所述粘結劑包括麥芽糖和/或糊精。
7.根據權利要求6所述的微生物菌劑，其特徵在於:所述微生物菌劑中，惰性固體載體的含量為30-90重量％ ;所述粘結劑的含量為5-20重量％。
8.權利要求1所述的中間蒼白桿菌和權利要求2-7中任意一項所述的微生物菌劑在降解菸鹼類農藥中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述菸鹼類農藥包括吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、氯噻啉、噻蟲啉、噻蟲嗪、噻蟲胺和呋蟲胺中的至少一種。
【文檔編號】B09C1/10GK103937722SQ201410167736
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月24日 優先權日:2014年4月24日
【發明者】趙君才, 阮志勇, 趙秉強, 王慧敏, 趙文勇, 呂昭輝, 劉慧 , 宋昭, 王彥偉, 劉小飛 申請人:煙臺海上傳奇生物科技有限公司