葡糖澱粉酶變體和編碼它們的多核苷酸的製作方法

2023-10-25 12:54:27

葡糖澱粉酶變體和編碼它們的多核苷酸的製作方法
【專利摘要】本發明涉及具有對蛋白酶切口的減小的敏感度的多種葡糖澱粉酶變體。本發明還涉及編碼這些變體的多核苷酸，包含這些多核苷酸的核酸構建體、載體以及宿主細胞；以及使用這些變體的方法。
【專利說明】葡糖澱粉酶變體和編碼它們的多核苷酸[0001 ] 對序列表的引用
[0002]本申請含有處於計算機可讀形式的序列表，將其通過引用結合在此。
[0003]發明背景
發明領域
[0004]本發明涉及一種葡糖澱粉酶變體、編碼該變體的多核苷酸、產生這些變體的方法、以及使用這些變體的方法。
[0005]相關技術說明[0006]葡糖澱粉酶(1，4- a -D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)是催化D-葡萄糖從澱粉或相關寡糖和多糖分子的非還原端釋放的一種酶。葡糖澱粉酶由若干絲狀真菌和酵母產生，其中來自麴黴菌屬(Aspergillus)的那些在商業上最為重要。
[0007]在商業上，葡糖澱粉酶用於將已經由α-澱粉酶部分水解的澱粉轉化成葡萄糖。然後可以使用發酵有機體將葡萄糖直接或間接轉化成發酵產品。商業發酵產品的實例包括醇類(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1，3-丙二醇);有機酸類(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸鹽、乳酸、丁二酸、2，5-二酮-D-葡糖酸)；酮類(例如，丙酮)；胺基酸(例如，穀氨酸)；氣體(例如，H2和CO2);以及更複雜的化合物，包括例如抗生素(例如，盤尼西林和四環素)；酶；維生素(例如，核黃素、Β12、β-胡蘿蔔素)；激素以及難以合成生產的其他化合物。發酵過程通常還用於可食用酒精(例如，啤酒和酒)工業、乳製品(例如，在酸乳和奶酪的生產中)工業中。
[0008]最終產品還可以是糖漿。例如，最終產品可以是葡萄糖，但是還可以被葡萄糖異構酶轉化成果糖或者由幾乎均等的葡萄糖與果糖組成的一種混合物。這種混合物或者進一步富含果糖的一種混合物是全世界商業化的最常用的高果糖玉米糖漿(HFCS)。
[0009]本發明的一個目的是提供具有葡糖澱粉酶活性的多肽和編碼這些多肽的多核苷酸，並且這些多肽和多核苷酸在發酵產品的生產過程中提供高產量，這些生產過程例如乙醇生產過程，包括從未糊化的生澱粉(或者未蒸煮的澱粉)的一步乙醇發酵過程。共同未決的專利申請W02011/127802披露了來自草酸青黴菌的野生型葡糖澱粉酶。
[0010]本發明提供了與其親本相比具有改進的特性的葡糖澱粉酶變體。
[0011]發明概述
[0012]本發明涉及一種葡糖澱粉酶變體，該葡糖澱粉酶變體至少在與SEQ IDN0:2的成熟多肽的位置79相對應的一個位置處包含一個取代，其中該變體具有葡糖澱粉酶活性。
[0013]在另外的方面，本發明涉及一種變體葡糖澱粉酶催化域，該變體葡糖澱粉酶催化域至少在與SEQ ID NO: 2的成熟多肽的位置79相對應的一個位置處包含一個取代，其中該變體具有葡糖澱粉酶活性。
[0014]在另一方面，本發明涉及一種包含本發明的多肽的組合物。
[0015]本發明還涉及編碼這些變體的分離的多核苷酸，包含這些多核苷酸的核酸構建體、載體以及宿主細胞；以及產生這些變體的方法。[0016]本發明還涉及在糖漿和/或一種發酵產品的生產中使用本發明的多肽的方法。
[0017]定義
[0018]葡糖澱粉酶:術語葡糖澱粉酶(1，4- a -D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)被定義為催化D-葡萄糖從澱粉或相關寡糖和多糖分子的非還原端釋放的一種酶。出於本發明的目的，根據在此的『材料與方法』部分所述的程序來確定葡糖澱粉酶活性。
[0019]本發明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20%、優選至少40%、優選至少45%、更優選至少50%、更優選至少55%、更優選至少60%、更優選至少65%、更優選至少70%、更優選至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、甚至更優選至少90%、最優選至少95%以及最優選至少100%的葡糖澱粉酶活性。
[0020]等位基因變體:術語「等位基因變體」意指佔據相同染色體基因座的基因的兩種或更多種替代形式中的任一種。等位基因變異通過突變而天然存在，並且可導致群體內的多態性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中沒有變化)或者可以編碼具有改變的胺基酸序列的多肽。一個多肽的等位基因變體是由一個基因的等位基因變體編碼的多肽。
[0021]cDNA:術語「cDNA」意指可以通過從成熟的、剪接的mRNA分子反轉錄製備的DNA分子，該mRNA分子是從真核細胞或原核細胞中獲得。cDNA缺乏可以存在於對應基因組DNA中的內含子序列。起始的初級RNA轉錄物是通過一系列步驟加工的mRNA的前體，這些步驟包括在作為成熟剪接的mRNA出現之前進行剪接。
[0022]編碼序列:術語「編碼序列」意指直接指定一個變體的胺基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界一般是通過以起始密碼子(例如ATG、GTG或TTG)開始並以終止密碼子(例如TAA,TAG或TGA)結束的一個開放讀碼框來決定。編碼序列可以是一個基因組DNA、cDNA、合成的DNA或其組合。
[0023]控制序列:術語「控制序列」意指對於表達編碼本發明的變體的多核苷酸所必需的核酸序列。每個控制序列針對編碼該變體的多核苷酸來說可以是原生的(即，來自相同基因)或者外源的(即，來自不同基因)，或者相對於彼此是原生的或外源的。這類控制序列包含但不局限於前導子、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、以及轉錄終止子。這些控制序列至少包含一個啟動子以及轉錄和翻譯終止信號。出於引入有利於將這些控制序列與編碼一種變體的多核苷酸的編碼區連接的特異性限制酶切位點的目的，這些控制序列可以提供有多個接頭。
[0024]表達:術語「表達」包括涉及在一個變體的產生中的任何步驟，包括但不局限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾、以及分泌。
[0025]表達載體:術語「表達載體」意指包含編碼一種變體的一種多核苷酸並可操作地連接至提供其表達的控制序列的線性或環形DNA分子。
[0026]片段:術語「片段」意指使一個或多個(例如，若干個)胺基酸從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺少的多肽，其中該片段具有葡糖澱粉酶活性。在一方面，一個片段含有至少465個胺基酸殘基(例如，SEQ ID NO:2的胺基酸30至494)。 [0027]高嚴格條件:術語「高嚴格條件」意指對於至少100個核苷酸長的探針來說，按照標準DNA印跡法程序，在42°C下於5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切且變性的蛙魚精DNA以及50%甲醯胺中進行12至24小時的預雜交和雜交。最終，使用2X SSC、0.2%SDS在65°C下洗滌運載體材料三次,每次持續15分鐘。[0028]宿主細胞:術語「宿主細胞」意指易於用包含本發明的多核苷酸的核酸構建體或表達載體進行轉化、轉染、轉導、等的任何細胞類型。術語「宿主細胞」涵蓋了由於在複製過程中存在的突變而與親本細胞不相同的親本細胞的任何子代。
[0029]改進的特性:術語「改進的特性」意指與一種變體相關的相對於親本有所改進的特徵。這類改進的特性包括但不局限於改進的對由宿主蛋白酶所引起的降解或切口的穩定性。改進的穩定性相當於減小的敏感度。優選地，該敏感度減小至少10%、優選至少20%、更優選至少30%、優選至少40%、優選至少45%、更優選至少50%、更優選至少55%、更優選至少60%、更優選至少65%、更優選至少70%、更優選至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、甚至更優選至少90%、更優選至少95%、並且甚至最優選至少100%。
[0030]分離的:術語「分離的」意指處於非天然存在的形式或環境中的一種物質。分離的物質的非限制實例包括(I)任何非天然存在的物質；(2)至少部分地從與其在自然界中相關聯的一種或多種或全部天然存在的組分中除去的任何物質，包括但不局限於任何酶、變體、核酸、蛋白、肽或輔因子；(3)相對於自然界中發現的那種物質通過人工手動改性的任何物質；或者(4)通過增加該物質相對於與其天然相關聯的其他組分的量來改性的任何物質(例如，編碼該物質的一個基因的多個拷貝；比與編碼該物質的基因天然相關聯的啟動更強的啟動子的使用)。一種分離的物質可以存在於發酵液樣品中。
[0031]低嚴格條件:術語「低嚴格條件」意指對於至少100個核苷酸長的探針來說，按照標準DNA印跡法程序，在42°C下於5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切且變性的蛙魚精DNA以及25%甲醯胺中進行12至24小時預雜交和雜交。最終，使用2X SSC、0.2%SDS在50°C下洗滌運載體材料三次，每次持續15分鐘。
[0032]成熟多肽:術語「成熟多肽」意指在翻譯和任何翻譯後修飾(例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化、等)之後處於其最終形式的一種多肽。在一方面，基於預測SEQID NO: 2的胺基酸I至21是一個信號肽的程序SignalP (尼爾森(Nielsen)等人，1997，蛋白工程(Protein Engineering)10:1-6),成熟多肽是 SEQ ID NO:2 的胺基酸 22 至 616。在本領域中已知的是，一個宿主細胞可以產生由相同多核苷酸表達的兩種或更多種不同成熟多肽(即，具有一個不同的C-末端和/或N-末端胺基酸)的混合物。
[0033]成熟多肽編碼序列:術語「成熟多肽編碼序列」意指編碼具有葡糖澱粉酶活性的一種成熟多肽的一種多核苷酸。在一方面，基於預測SEQ ID NO:1的核苷酸I至63編碼信號肽的SignalP(上文的尼爾森等人，1997)，這一成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO:1的核苷酸64 至 1848。
[0034]中等嚴格條件:術語「中等嚴格條件」意指對於至少100個核苷酸長的探針來說，按照標準DNA印跡法程序，在42°C下於5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切且變性的蛙魚精DNA以及35%甲醯胺中進行12至24小時預雜交和雜交。最終，使用2X SSC、0.2%SDS在55°C下洗滌運載體材料三次，每次持續15分鐘。
[0035]中-高嚴格條件:術語「中-高嚴格條件」意指對於至少100個核苷酸長的探針來說，按照標準DNA印跡法程序，在42°C下於5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切且變性的蛙魚精DNA以及35%甲醯胺中進行12至24小時預雜交和雜交。最終，使用2X SSC、0.2%SDS在60°C下洗滌運載體材料三次，每次持續15分鐘。
[0036]突變體:術語「突變體」意指編碼一種變體的一種多核苷酸。[0037]核酸構建體:術語「核酸構建體」意指單鏈亦或雙鏈的一種核酸分子，該核酸分子是從天然存在的基因中分離的，或者以一種否則將不存在於自然界中的方式被修飾成含有核酸的區段，或者是合成的，該核酸分子包含一個或多個控制序列。
[0038]可操作地連接:術語「可操作地連接」意指其中一個控制序列位於相對於一個多核苷酸的編碼序列的適當位置處，這樣使得該控制序列指導該編碼序列的表達的配置。
[0039]親本或親本葡糖澱粉酶術語「親本」或「親本葡糖澱粉酶」意指對其做出改變以產生本發明的酶變體的一種葡糖澱粉酶。該親本可以是天然存在的(野生型)多肽或其變體或片段。在一個實施例中，該親本葡糖澱粉酶是SEQID N0:2的成熟多肽。
[0040]序列一致性:兩個胺基酸序列之間或者兩個核苷酸序列之間的關聯度通過參數「序列一致性」來描述。
[0041]出於本發明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼&翁施，1970，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.) 48:443-453)來確定兩個胺基酸序列之間的序列一致性，該算法如EMBOSS軟體包(EMBOSS:歐洲分子生物學開放軟體套件(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite),賴斯(Rice)等人,2000,遺傳學趨勢(TrendsGenet.) 16:276-277)(優選5.0.0版或更新版本)的Needle程序所實施的。使用的參數是10的空位開放罰分、0.5的空位擴展罰分以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。將標記為「最長一致性」的Needle的輸出(使用非簡化選項(nobrief option)獲得)用作百分比一致性並且計算如下:
[0042](一致性殘基xl OO)/ (比對的長度-比對中的空位總數)
[0043]出於本發明的目的，使用尼德曼-翁施算法(上文的尼德曼&翁施，1970 )來確定兩個脫氧核苷酸序列之間的序列一致性，該算法如EMBOSS軟體包(EMB0SS:歐洲分子生物學開放軟體套件，上文的賴斯等人，2000)(優選5.0.0版或更新版本)的Needle程序所實施的。使用的參數是10的空位開放罰分、0.5的空位擴展罰分以及EDNAFULL (NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。將標記為「最長一致性」的Needle的輸出(使用非簡化選項(nobrief option)獲得)用作一致性百分比並且計算如下:
[0044](一致性脫氧核苷酸xlOO)/ (比對的長度-比對中的空位總數)
[0045]子序列:術語「子序列」意指使一個或多個(例如，若干個)核苷酸從成熟多肽編碼序列的5』端和/或3』端缺少的多核苷酸，其中該子序列編碼具有葡糖澱粉酶活性的一個片段。在一方面，一個子序列包含至少1395個核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸88至1482)。
[0046]變體:術語「變體」意指具有葡糖澱粉酶活性的、包含一個改變(即在一個或多個(例如，若干)位置處的一個取代、插入和/或缺失)的一個多肽。取代意指用一個不同的胺基酸替換佔據某一位置的胺基酸；缺失意指去除佔據某一位置的胺基酸；並且插入意指鄰近並且緊跟在佔據某一位置的胺基酸之後添加一個胺基酸。本發明的這些變體具有SEQ IDNO:2的成熟多肽的至少20%、例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%的葡糖澱粉酶活性。
[0047]非常高嚴格條件:術語「非常高嚴格條件」意指對於至少100個核苷酸長的探針來說，按照標準DNA印跡法程序，在42°C下於5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切且變性的蛙魚精DNA以及50%甲醯胺中進行12至24小時預雜交和雜交。最終，使用2X SSC、0.2%SDS在70°C下洗滌運載體材料三次，每次持續15分鐘。
[0048]非常低嚴格條件:術語「非常低嚴格條件」意指對於至少100個核苷酸長的探針來說，按照標準DNA印跡法程序，在42°C下於5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切且變性的蛙魚精DNA以及25%甲醯胺中進行12至24小時預雜交和雜交。最終，使用2X SSC、0.2%SDS在45°C下洗滌運載體材料三次，每次持續15分鐘。
[0049]野生型葡糖澱粉酶:術語「野生型葡糖澱粉酶」意指由天然存在的微生物(例如在自然界中發現的細菌、酵母或絲狀真菌)表達的一種葡糖澱粉酶。
[0050]用於變體表示的常規[0051]出於本發明的目的，將包括在SEQ ID N0:2中的成熟多肽用於確定另一種葡糖澱粉酶中的對應胺基酸殘基。將另一種葡糖澱粉酶的胺基酸序列與SEQ ID N0:2的披露為胺基酸22至616的成熟多肽進行比對，並且基於該比對，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼&翁施，1970，分子生物學雜誌48:443-453)來確定與SEQ ID NO:2中所披露的成熟多肽的任何胺基酸殘基相對應的胺基酸位置編號，該算法如EMBOSS軟體包(EMBOSS:歐洲分子生物學開放軟體套件，賴斯等人，2000，遺傳學趨勢16:276-277)(優選5.0.0版或更新版本)的Needle程序所實施的。使用的參數是10的空位開放罰分、0.5的空位擴展罰分、以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。因此，如果例如該變體在位置79處具有一個取代，則這與如SEQ ID N0:2所披露的全長多肽中的位置100相對應，因為胺基酸I至21是信號肽並且位置22將與這一成熟多肽中的位置I相對應。
[0052]通過使用若干電腦程式、使用它們相應的默認參數來比對多個多肽序列可以確定在另一種葡糖澱粉酶中的對應胺基酸殘基的鑑別，這些電腦程式包括但不局限於MUSCLE (通過期望值的對數的多序列比較(multiple sequence comparison bylog - expectation) ；3.5 版或更新版本；埃德加(Edgar), 2004,核酸研究(Nucleic AcidsResearch)32:1792-1797),MAFFT (6.857 版或更新版本；加藤(Katoh)& 庫瑪(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066 ;加藤等人，2005，核酸研究33:511-518 ;加藤&都(Toh)，2007，生物信息學(Bioinformatics) 23:372-374 ;加藤等人,2009,分子牛.物學方法(MethodsinMolecular Biology) 537:39-64:加藤 & 都，2010,牛物信息學 26:1899-1900)以及採用ClustalW的EMBOSS EMMA (1.83或更新版本；湯普森(Thompson)等人，1994,核酸研究22:4673-4680)。
[0053]當從SEQ ID N0:2的成熟多肽中分叉分出其他酶，這樣使得傳統的基於序列的比較不能檢測它們的關係(林達爾(Lindahl) &埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物學雜誌295:613-615)時，則可以使用其他逐對序列比較算法。在基於序列的搜索中的更大靈敏度可以使用搜索程序來獲得，這些搜索程序利用多肽家族的概率表示(輪廓(profile))來搜索資料庫。例如，PS1-BLAST程序通過一個迭代資料庫搜索過程來產生多個輪廓並且能夠檢測遠距離同源物(阿特休爾(Atschul)等人，1997，核酸研究25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白結構資料庫中具有一個或多個代表，則可以實現甚至更大的靈敏度。程序(例如GenTHREADER)(瓊斯(Jones)，1999，分子生物學雜誌287:797-815 ;麥谷芬(McGuffin) &瓊斯，2003，生物信息學19:874-881)利用來自多種來源(PS1-BLAST，二級結構預測、結構比對輪廓以及溶劑化可能性)的信息作為對預測查詢序列的結構摺疊的神經網絡的輸出。類似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物學雜誌313:903-919的方法可以用於比對未知結構的序列與存在於SCOP資料庫中的超家族模型。這些比對進而可以用於產生多肽的同源性模型，並且使用出於該目的而開發的多種工具可以評定這類模型的準確度。
[0054]對於已知結構的蛋白，若干工具和資源可用於檢索並產生結構比對。例如，蛋白的SCOP超家族已經在結構上進行比對，並且那些比對是可訪問的並且可下載的。使用多種算法(例如距離比對矩陣(赫爾姆(Holm) &桑德爾(Sander), 1998,蛋白雜誌(Proteins)33:88-96)或者組合擴展(辛迪亞洛夫(Shindyalov) &伯恩(Bourne), 1998,蛋白工程11:739-747))可以比對兩個或更多個蛋白結構，並且可以額外利用這些算法的實施來隨所感興趣的結構查詢結構資料庫以便發現可能的結構同源物(例如，赫爾姆&帕克(Park)，2000，生物信息學 16:566-567)。
[0055]在描述本發明的變體中，以下所述的命名法適於方便參考。採用了已接受的IUPAC
單個字母和三字母的胺基酸縮寫。
[0056]取也對於一個胺基酸取代，使用了以下命名法:原始胺基酸、位置、取代的胺基酸。因此，在位置226上的蘇氨酸被丙氨酸取代被表示為「Thr226Ala」或者「T226A」。多個突變由加號(「 + 」)分開，例如「Gly205Arg+Ser411Phe」或者「G205R+S411F」代表分別在位置205和位置411上甘氨酸(G)被精氨酸(R)並且絲氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。
[0057]跡失對於一個胺基酸缺失，使用了以下命名法。原始胺基酸、位置、*。因此，在位置195上的甘氨酸缺失被表示為「Glyl95*」或者「G195*」。多個缺失由加號(「 + 」)分開，例如 「Glyl95*+Ser411*，，或者 「G195*+S411*，，。
[0058]通A對於一個胺基酸插入，使用了以下命名法:原始胺基酸、位置、原始胺基酸、插入的胺基酸。因此，在位置195上的甘氨酸之後插入賴氨酸被表示為「Glyl95GlyLys」或者「G195GK」。多個胺基酸的插入被表示為「原始胺基酸、位置、原始胺基酸、插入的胺基酸#1、插入的胺基酸#2」；等。例如，在位置195上的甘氨酸之後插入賴氨酸和丙氨酸被表示為 「Glyl95GlyLysAla」 或者 「G195GKA」。
[0059]在這類情況下，通過將小寫字母添加到在所插入的一個或多個胺基酸殘基之前的胺基酸殘基的位置編號中來對所插入的一個或多個胺基酸殘基進行編號。在以上實例中，該序列因此將是:
[0060]
【權利要求】
1.一種葡糖澱粉酶變體，該變體至少在與SEQ ID NO: 2的成熟多肽的位置79相對應的一個位置處包含一個取代，其中該變體具有葡糖澱粉酶活性。
2.如權利要求1所述的葡糖澱粉酶變體，該變體選自下組，該組由以下各項組成: a)與SEQID NO:2的成熟多肽具有至少65%的序列一致性的一種多肽； b)由在低嚴格條件下與(i)SEQID NO:1的成熟多肽編碼序列、或者(ii)⑴的全長補體雜交的一種多核苷酸編碼的一種多肽； c)由與SEQID NO:1的這一成熟多肽編碼序列具有至少65%的一致性的一種多核苷酸編碼的一種多肽；以及 d)SEQ ID NO: 2的這一成熟多肽的具有葡糖澱粉酶活性的一個片段。
3.如權利要求1或2所述的葡糖澱粉酶變體，該變體是選自下組的親本葡糖澱粉酶的一種變體，該組由以下各項組成: a)與SEQID NO:2的這一成熟多肽具有至少65%的序列一致性的一種多肽； b)由在低嚴格條件下與(i)SEQID NO:1的這一成熟多肽編碼序列、或者(ii)⑴的該全長補體雜交的一種多核苷酸編碼的一種多肽； c)由與SEQID NO:1的這一成熟多肽編碼序列具有至少65%—致性的一種多核苷酸編碼的一種多肽；以及 d)SEQ ID NO: 2的這一成熟多肽的具有葡糖澱粉酶活性的一個片段。
4.如權利要求1-3中任一項所述的葡糖澱粉酶變體，其中取代的數目是1-20個，例如1-10 個和 1-5 個，如 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或者 10 個取代。
5.如權利要求1-4中任一項所述的葡糖澱粉酶變體，其中該變體包含選自K79V、K79A、K79G、K791、K79L、K79S、K79T 的一個取代。
6.如權利要求1-5中任一項所述的葡糖澱粉酶變體，其中該變體包含取代K79V。
7.如權利要求1-6中任一項所述的葡糖澱粉酶變體，該變體相對於該親本具有一個改進的特性，其中這一改進的特性是對蛋白酶降解的減小的敏感度。
8.一種變體葡糖澱粉酶催化域，該催化域至少在與SEQ ID NO: 2的成熟多肽的位置79相對應的一個位置處包含一個取代，其中該變體具有葡糖澱粉酶活性。
9.如權利要求8所述的變體葡糖澱粉酶催化域，該催化域選自下組，該組由以下各項組成:(a)與SEQID NO:2的胺基酸30至494具有至少65%的序列一致性的一個催化域； (b)由在中等嚴格條件下與(i)SEQID NO:1的核苷酸88至1482、或者(ii)⑴的全長補體雜交的一種多核苷酸編碼的一個催化域； (c)由與(i)SEQID NO:1的核苷酸88至1482具有至少65%的序列一致性的一種多核苷酸編碼的一個催化域；以及 (d)SEQID NO: 2的胺基酸30至494的一種變體，該變體在一個或多個(例如若干個)位置處包含一個取代、缺失和/或插入； 並且其中該催化域具有葡糖澱粉酶活性。
10.一種組合物，該組合物包含如權利要求1-9中任一項所述的葡糖澱粉酶變體。
11.一種如權利要求1-9中任一項所述的葡糖澱粉酶變體用於生產糖漿和/或一種發酵產品的用途。
12.—種如權利要求1-9中任一項所述的葡糖澱粉酶變體用於釀造的用途。
13.一種用於由含澱粉的材料來生產發酵產品的過程，該過程包括以下步驟: (a)在一種α-澱粉酶存在下使含澱粉的材料液化； (b)使所液化的材料糖化；並且 (C)使用一種發酵有機體進行發酵； 其中使用如權利要求1-9中任一項所述的至少一種葡糖澱粉酶變體進行步驟(a)和/或步驟(b)。
14.一種用於由含澱粉的材料來生產發酵產品的過程，該過程包括以下步驟: (a)在低於所述含澱粉的材料的初始糊化溫度的溫度下使含澱粉的材料糖化；並且 (b)使用一種發酵有機體進行發酵， 其中使用如權利要求1-9中任一項所述的至少一種葡糖澱粉酶變體進行步驟(a)。
15.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼如權利要求1-9中任一項所述的葡糖澱粉酶變體。
16.—種核酸構建體或表達載體,該核酸構建體或表達載體包含如權利要求15所述的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至指導葡糖澱粉酶變體在一種表達宿主中的產生的一個或多個控制序列。
17.—種重組宿主細胞，這一重組宿主細胞包含如權利要求15所述的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至指導葡糖澱粉酶變體的產生的一個或多個控制序列。
18.—種產生如權利要求1-9中任一項所述的葡糖澱粉酶變體的方法，該方法包括: (a)在有益於產生該多肽的條件下培養如權利要求22所述的宿主細胞；並且 (b)回收該葡糖澱粉酶變體。
19.一種包含如權利要求15所述的多核苷酸的核酸構建體。
20.—種包含如權利要求15所述的多核苷酸的表達載體。
21.—種包含如權 利要求15所述的多核苷酸的宿主細胞。
【文檔編號】C12N9/24GK103930543SQ201280043431
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年9月5日 優先權日:2011年9月6日
【發明者】松井知子, S.克拉克 申請人:諾維信公司, 諾維信北美公司