化學發光增強劑及化學發光免疫檢測試劑盒的製作方法

2023-10-25 15:09:02 3

本發明涉及分析檢測技術領域，尤其涉及一種化學發光增強劑及化學發光免疫檢測試劑盒。

背景技術：

化學發光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是將化學發光或生物發光體系與免疫反應相結合，用於檢測微量抗原或抗體的一種新型標記免疫測定技術。化學發光免疫分析是目前世界範圍內最主流的免疫檢測技術，具有靈敏度高、檢測範圍寬、反應時間短、全自動操作、重現性好、無汙染等優點，是繼放免技術、酶免技術、螢光免疫技術之後發展起來的一種超高靈敏度的微量檢測技術。化學發光的原理是當基態分子吸收化學反應中釋放的能量躍遷到激發態，處於激發態的分子以光輻射的形式返回到基態時產生的光。化學發光免疫分析將化學發光與免疫分析方法相結合，綜合了化學發光的高靈敏度和免疫分析的高選擇性。

在化學發光免疫分析中，常用的發光物質包括魯米諾、異魯米諾、3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧醯)-苯基-1,2-二氧環乙烷二鈉鹽(縮寫為AMPPD)、三聯吡啶釕和吖啶類發光物質。其中，異魯米諾、三聯吡啶釕和吖啶類發光物質可作為示蹤分子直接標記，屬於閃光型化學發光物質。魯米諾和AMPPD分別依靠過氧化物酶和鹼性磷酸酶作為示蹤分子標記，屬於酶促發光型化學發光物質。吖啶類類發光物質的發光反應具有不需催化劑，只要鹼性環境中就可以進行，並且發光反應迅速，背景發光低，信噪比高。發光反應幹擾因素少，試劑穩定性好，化學發光體系簡單，激發液成本低等優點，是理想的化學發光物質。

傳統的吖啶類全自動化學發光系統主要使用過氧化氫與酸性溶液以及鹼性溶液配合作為發光啟動試劑，有些在發光啟動試劑中加入增強劑聚乙二醇辛基 苯基醚(Triton X-100)和吐溫-20(Tween 20)以增強發光，但是傳統的增強劑加入後增強發光的效果並不明顯。綜上所述，傳統的吖啶類發光物質的發光強度較弱。

技術實現要素：

基於此，有必要提供一種可以增強吖啶類發光物質的發光強度的化學發光增強劑及化學發光免疫檢測試劑盒。

一種化學發光增強劑，用於增強吖啶類發光物質的發光強度，所述化學發光增強劑包括甜菜鹼類化合物。

在一個實施方式中，所述甜菜鹼類化合物的結構式為：

其中，R-為陰離子基團，R1為C5～C20的烷基醯胺基、C5～C20的烷基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R2為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R3為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基。

在一個實施方式中，所述甜菜鹼類化合物的結構式為：

其中，R1為C5～C20的烷基醯胺基、C5～C20的烷基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R2為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R3為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基。

在一個實施方式中，所述甜菜鹼類化合物的結構式為：

其中，R1為C5～C20的烷基醯胺基、C5～C20的烷基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R2為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R3為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基。

在一個實施方式中，所述甜菜鹼類化合物的結構式為：

其中，R1為C5～C20的烷基醯胺基、C5～C20的烷基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R2為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R3為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基。

在一個實施方式中，所述甜菜鹼類化合物的結構式為：

其中，R1為C5～C20的烷基醯胺基、C5～C20的烷基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R2為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R3為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基。

在一個實施方式中，所述甜菜鹼類化合物的結構式為：

其中，R1為C5～C20的烷基醯胺基、C5～C20的烷基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R2為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R3為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基。

一種化學發光免疫檢測試劑盒，包括上述任一項所述的化學發光增強劑和 吖啶類發光物質。

在一個實施方式中，所述吖啶類發光物質為吖啶酯或吖啶鹽。

在一個實施方式中，還包括化學發光預激發液和激發液，所述化學發光預激發液包括HNO3和H2O2溶液，激發液包括NaOH溶液。

甜菜鹼類化合物為具有季銨內鹽結構或稱作銨鎓結構的化合物，常用作滲透壓調節劑、清潔劑或殺菌劑等。發明人意外發現甜菜鹼類化合物具有增強吖啶類發光物質的發光強度的作用，可用於製備化學發光增強劑。實驗表明，該甜菜鹼類化合物可明顯增強吖啶類發光物質的發光強度，並且增強的倍數高於傳統的增強劑Triton X-100和Tween 20。

附圖說明

圖1為採用iFlash 3000全自動化學發光儀測定加入含有十四烷醯胺丙基羥丙基磺基甜菜鹼的化學發光增強劑後吖啶酯的發光強度曲線圖；

圖2為採用採用iFlash 3000全自動化學發光儀測定在無增強劑和分別加入化學發光增強劑以及Architect Trigger Solution(Abbott)商品發光液條件下吖啶鹽的發光強度曲線圖。

具體實施方式

為使本發明的上述目的、特徵和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖和具體實施例對本發明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節以便於充分理解本發明。但是本發明能夠以很多不同於在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似改進，因此本發明不受下面公開的具體實施的限制。

一實施方式的化學發光增強劑，該化學發光增強劑包括甜菜鹼類化合物，該化學發光增強劑可用於增強吖啶類發光物質的發光強度。當然，化學發光增強劑還可以包括溶解甜菜鹼類化合物的溶劑或可接受的雜質等。

甜菜鹼類化合物為具有季銨內鹽結構或稱作銨鎓結構的化合物。吖啶類發光物質是一類可用作化學發光標記物的化學物質，例如吖啶酯或吖啶鹽等。

具體的，甜菜鹼類化合物的結構式為：

其中，R-為陰離子基團，R1為C5～C20的烷基醯胺基、C5～C20的烷基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R2為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R3為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基。

R-為陰離子基團，與季銨內鹽結構配合形成甜菜鹼類化合物。

在一個實施方式中，甜菜鹼類化合物為化合物Ⅰ,化合物Ⅰ的結構式為：

其中，R1為C5～C20的烷基醯胺基、C5～C20的烷基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R2為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R3為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基。即本實施方式中，-R-為-COO-。

另一實施方式中，甜菜鹼類化合物為化合物Ⅱ,化合物Ⅱ的結構式為：

其中，R1為C5～C20的烷基醯胺基、C5～C20的烷基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R2為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R3為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基。即本實施方式中，-R-為

另一實施方式中，甜菜鹼類化合物為化合物Ⅲ,化合物Ⅲ的結構式為：

其中，R1為C5～C20的烷基醯胺基、C5～C20的烷基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R2為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R3為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基。即本實施方式中，-R-為-CH2-SO3-。

再一實施方式中，甜菜鹼類化合物為化合物Ⅳ,化合物Ⅳ的結構式為：

其中，R1為C5～C20的烷基醯胺基、C5～C20的烷基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R2為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R3為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基。即本實施方式中，-R-為-CH2-CH2-SO3-。

再一實施方式中，甜菜鹼類化合物為化合物Ⅴ,化合物Ⅴ的結構式為：

其中，R1為C5～C20的烷基醯胺基、C5～C20的烷基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R2為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R3為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基。即本實施方式中，-R-為-CH(OH)-CH2-SO3-。

在本文中，為特別說明，各結構式中的C5～C20的烷基可以為直鏈烷基或支鏈烷基。C2～C10的烯基可以為直鏈烯基或支鏈烯基。C2～C10的炔基可以為直鏈炔基或支鏈炔基。C1～C10的烷基可以為直鏈烷基或支鏈烷基。C1～C10的烷氧基可以為直鏈烷基或支鏈烷基。

進一步的，R1為C5～C20的烷基醯胺基、C10～C20的烷基，R2為C1～C5的烷基、C1～C5的烷氧基、C2～C5的烯基或C2～C5的炔基。R3為C1～C5的烷基、C1～C5的烷氧基、C2～C5的烯基或C2～C5的炔基。

具體的，烷基醯胺基是指烷基與醯胺基連接的基團，其結構式例如可以為C5H11-CONH-、C11H24-CONH-、C13H27-CONH-或C20H27-CONH-等。更進一步的，烷基醯胺基上的醯胺基還可以連接C1～C10的烷基，其結構式例如可以為C13H27-CONH-(CH2)3-或C11H24-CONH-(CH2)10-等。

具體的，R1可以為C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20的烷基。R1還可以為C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10的烯基。或者，R1還可以為C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10的炔基。

具體的，R2可以為C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10的烷基。R2可以為C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10的烷氧基。R2還可以為C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10的烯基。或者，R2還可以為C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10的炔基。

具體的，R3可以為C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10的烷基。R3可以為C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10的烷氧基。R3還可以為C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10的烯基。或者，R3還可以為C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10的炔基。

進一步的，R1、R2和R3可以相同也可以不同。當R1、R2及R3分別選自烯基或炔基時，烯基或炔基可以在相應的基團中的任意位置。

發明人意外發現甜菜鹼類化合物具有增強吖啶類發光物質的發光強度的作用，可用於製備化學發光增強劑。甜菜鹼類化合物具有兩性表面活性劑的性質，結構簡單、成分單一，批間差非常容易控制，有效減少了由於批次差異帶來的化學發光增強效果的不同的影響。通過該化學發光增強劑，可有效增強吖啶類發光物質的發光強度，發光信號明顯增強，而且重現性好，可廣泛應用於臨床診斷、科學研究、環境衛生檢測等領域。進一步的，具有上述通式結構的化合物可以將吖啶類發光物質的發光強度增強至少兩倍以上，增強的倍數高於傳統 的增強劑Triton X-100和Tween 20。

一種化學發光免疫檢測試劑盒，包括上述化學發光增強劑和吖啶類發光物質。

一般的，可將甜菜鹼類化合物溶解在溶劑中製成化學發光增強劑。溶劑可以為水、酸性溶液或鹼性溶液等。本實施方式中，將甜菜鹼類化合物溶解在水中製成化學發光增強劑。

具體的，吖啶類發光物質可以為吖啶酯。例如NSP-DMAE-NHS吖啶酯、NSP-DMAE-HEG-NHS吖啶酯等。

一實施方式的吖啶類發光物質的化學發光反應流程式如下所示：

其中，式1所示結構表示的吖啶類化合物，式1～式6中的R可以為H、烷 基或烷基磺基等，Ar可以為含有苯基的基團。具體發光過程為：式1所示的吖啶類化合物在酸性條件下通過過氧化氫加成吖啶環的9位碳原子，得到式2所示的化合物，然後在鹼性條件下生成過氧負離子，得到式3所示的化合物。之後通過分子內進攻羰基，離去基團離去，生成不穩定中間體1，2-二氧雜環丁烷酮(式6所示的化合物)，然後1,2-二氧雜環丁烷酮開環生成吖啶酮，同時釋放光子。

一般的，在化學發光免疫檢測試劑盒中，化學發光增強劑和吖啶類發光物質是分開放置的，使用時再混合。

本實施方式中，化學發光免疫檢測試劑盒還包括化學發光預激發液和激發液，化學發光預激發液包括HNO3和H2O2溶液，激發液為NaOH溶液。

具體的，HNO3溶液的濃度為0.05mol/L～0.3mol/L，H2O2溶液的體積百分含量為0.1％～1％。NaOH溶液的濃度為0.05mol/L～0.5mol/L。

本實施方式中，HNO3溶液的濃度為0.1mol/L，H2O2溶液的體積百分含量為0.5％。NaOH溶液的濃度為0.25mol/L。

化學發光預激發液和基礎激發液作為發光的啟動試劑，與化學發光增強劑配合，進一步提高啶類發光物質的發光強度。

具體的，可將化學發光增強劑加入基礎激發液中製得化學激發液，從而提高啶類發光物質的發光強度。

上述化學發光免疫檢測試劑盒，包括化學發光增強劑和吖啶類發光物質。將甜菜鹼類化合物作為化學發光增強劑，可有效增強吖啶類發光物質的發光強度，增強的倍數高於傳統的增強劑Triton X-100和Tween 20，而且重現性好。並且甜菜鹼類化合物具有兩性表面活性劑的性質，結構簡單、成分單一，批間差非常容易控制，有效減少了由於批次差異帶來的化學發光增強效果的不同的影響，提高化學發光免疫檢測試劑盒檢測靈敏度，該試劑盒可廣泛應用於臨床診斷、科學研究、環境衛生檢測等領域。

以下為實施例部分。

以下實施例中，如無特別說明，未註明具體條件的實驗方法，通常按照常 規條件，所用實驗材料甜菜鹼類化合物購於河南省道純化工技術有限公司。Tween20(sigma公司，貨號V900548)和Triton X-100(sigma公司，貨號V900502)。吖啶酯(NSP-DMAE-NHS)和吖啶鹽(NSP-SA-NHS)採購於上海邁拓崴化工。檢測化學發光的儀器為iFlash 3000全自動化學發光儀。

實施例1～實施例13

甜菜鹼類化合物對吖啶類發光物質的發光強度的影響

1)配置預激發液

用超純水配置含有HNO3和H2O2的預激發液，其中HNO3在預激發液中的終濃度為0.1mol/L，H2O2溶液在預激發液中的體積百分含量為0.5％。

2)配置基礎激發液

用超純水配置含有NaOH的基礎激發液，NaOH在基礎激發液中的終濃度為0.25mol/L。

3)配置化學激發液

向基礎激發液中分別加入化學發光增強劑，化學發光增強劑分別包括甜菜鹼類化合物Z1～Z13，得到化學激發液。化學發光增強劑的中各甜菜鹼類化合物Z1～Z13的原濃度均為10g/L，化學發光增強劑加入量為2μL～30μL。本實施例中分別加入10μL的分別含有Z1～Z13的化學發光增強劑到基礎激發液中得到化學激發液。化學發光增強劑包括的甜菜鹼類化合物Z1～Z13的結構式如下：

其中，R-為陰離子基團，具體有以下Y1～Y5四類，Y1～Y5具體結構如下：

R1為C5～C20的烷基醯胺基、C5～C20的烷基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R2為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基，R3為C1～C10的烷基、C1～C10的烷氧基、C2～C10的烯基或C2～C10的炔基。甜菜鹼類化合物Z1～Z13對應的具體的結構如表1所示。

表1：甜菜鹼類化合物Z1～Z13的名稱和結構式

4)化學發光信號的測定

以10μL、濃度為1pg/mL的吖啶溶液為樣品，本實施例中吖啶溶液為NSP-DMAE-HEG-NHS吖啶酯，其結構式如下：

向樣品中加入100μL預激發液，再分別加入100μL各化學激發液。化學激發液中分別含有基礎激發液中以及甜菜鹼類化合物Z1～Z13。在化學發光檢測儀上測量化學發光信號，並計算各發光液信號值與基礎發光液信號值的增強倍數。實施例5對應的發光曲線如圖1所示。實施例1～13的發光強度結果如表2所示。

表2：實驗對照組以及實施例1～13的發光強度

其中，實驗對照組除了不加化學發光增強劑，其餘與實施例1～13相同。從表2可以看出，加入含有甜菜鹼類化合物Z1～Z13的化學發光增強劑可以有效的增強吖啶酯的發光強度。增強倍數在4倍以上。

對比例1～對比例2

為進一步驗證甜菜鹼類化合物對吖啶酯的發光強度的影響。採用Tween 20和Triton X-100作為對比例。對比例中配置預激發液和配置基礎激發液的步驟與實施例1～13相同。不同的是配置化學激發液時，採用分別將10μL的原濃度為10g/L的Tween 20和Triton X-100加入基礎激發液中得到對比例的化學激發液。採用化學發光檢測儀上測量對比例的化學發光信號，並計算各發光液信號值與基礎發光液信號值的增強倍數，結果如表3所示。

表3：實驗對照組以及對比例1和2的發光強度

對比表2和表3的結果可知，使用甜菜鹼類化合物能起到增強吖啶類化合物化學發光作用，且增強效果優於Tween 20和Triton X-100。並且本實施例1～13的化學發光也發光信號穩定，發光效率高。

實施例14

為進一步比較甜菜鹼類化合物對吖啶類化合物化學發光增強作用，選用Architect Trigger Solution(Abbott公司，貨號：6C55-60)商品發光液作為對照。本實施例的樣品液為10μL濃度為1pg/mL的吖啶鹽(NSP-SA-NHS)溶液。預激發液和基礎激發液與實施例1～13相同。將10μL的含有Z5的化學發光增強劑加到基礎激發液中得到化學激發液。向樣品中加入100μL預激發液，再分別加入100μL的含有增強劑Z5對應的化學激發液或100μL的Architect Trigger Solution(Abbott)商品發光液。分別測定在無增強劑、有含有Z5的化學發光增強劑以及Architect Trigger Solution(Abbott)商品發光液條件下吖啶鹽的發光強度。結果如圖2所示，與商品發光液Architect Trigger Solution(Abbott)發光信號進行對比。在本發明增強劑作用下，吖啶的發光信號大大增強，增強發光液性能接近Architect Trigger Solution(Abbott)。

從實施例1～14以及對比1的結果可知，甜菜鹼類化合物對吖啶類化合物有很好的增強化學發光的效果，可提高診斷試劑盒的檢測靈敏度。

本文中的所有數據、圖像、儀器、試劑和步驟應理解為說明性而非限制性的。雖然已結合上述具體實施方案描述了本發明，許多修改和其它變化對於本領域技術人員是顯而易見的。所有這種修改和其它變化也落入本發明的精神和範圍內。

以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對本發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保護範圍。因此，本發明專利的保護範圍應以所附權利要求為準。