一種利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法

2023-10-25 11:25:37 7

專利名稱：一種利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法
技術領域：
本發明屬於生物催化領域，涉及一種利用游離或固定化假絲酵母脂肪酶(Candida lipase)催化合成α-熊果苷的製備方法。
背景技術：
熊果苷(Arbutin)屬氫醌苷化合物，化學名為4_羥基苯基-D-吡喃葡萄糖苷，是源於綠色植物的天然活性皮膚脫色組分，存在於熊果、越橘等植物中，是一種新興的無刺激、無過敏、配伍性強的天然美白活性物質。熊果苷是國際上正在極力推廣的高功效醫藥、 化妝品添加劑，國際公認的高效祛斑美白劑，是美白化妝品理想的添加成份，國內外需求巨大，市場前景廣闊。熊果苷有兩種同分異構體，它們分別是α-熊果苷(α-arbutin)和β _熊果苷 (β-arbutin)，結構式如下α -arbutin β -arbutin為了比較了 α-熊果苷與其β-熊果苷的美白效果的差異，Masataka Fimayama等觀察了它們對來自磨菇及小鼠黑素瘤酪氨酸酶活性的影響。結果表明，β-熊果苷抑制來自蘑菇及小鼠黑素瘤的酪氨酸酶，α-熊果苷反抑制小鼠黑素瘤的酪氨酸酶，但α-熊果苷強度為β-熊果苷的10倍。而且Kazuhisa Sugimotod等通過比較α -熊果苷和β -熊果苷在人體黑素瘤細胞的實驗，發現α-熊果苷美白效果是熊果苷的10倍以上。研究還發現α -熊果苷的美白機理是直接抑制酪氨酸酶活性，從而達到減少黑色素的生成；而不是通過抑制細胞生長或酪氨酸酶基因表達的方式來達到減少黑色素的生成的目的，在這個實驗中還發現，濃度為ImM的α-熊果苷未見抑制細胞的生長，而β-熊果苷在同樣的濃度則出現有效地抑制，這進一步說明α -熊果苷不是通過殺死黑素細胞來實現人體皮膚的美白效果的，而是通過影響酪氨酸酶來抑制黑素的生成來達到美白效果的。此外，在α-熊果苷與人體黑素瘤細胞培養過程中未發現對苯二酚的存在。這不但說明了 α-熊果苷在使用過程中是穩定的，而且進一步說明α-熊果苷的美白作用是其本身的作用而不是其通過分解對苯二酚來實現。而熊果苷在使用過程中會抑制黑素細胞的生長，長期使用會導致黑素細胞衰退，黑素細胞是人體防禦紫外線傷害的一道屏障，所以如果長期使用熊果苷會使人體降低人體自身對紫外線的防禦。因此使用α-熊果苷作為化妝品添加劑比β-熊果苷更安全，且對人體沒有任何副作用。國內外已經有多家大型化妝品公司使用α-熊果苷代替熊果苷作為美白劑添加劑。酶固定化(Enzyme immobilization)技術是20世紀60年代發展起來的一門新興生物技術，在化工、發酵生產、能源、醫藥等行業，實際應用效果顯著。它是利用物理或化學的手段將游離酶定位於限定的空間區域，並使其保持活性反覆利用的方法。酶固定化技術與傳統的懸浮生物處理法相比，酶固定化有提高單位體積的酶密度，酶易回收，對環境的耐受力增強(如PH值、溫度、有機溶劑、有毒物質等)等優點。α -熊果苷和β -熊果苷的來源完全不同。β -熊果苷可以通過化學合成、植物提取、植物細胞培養和酶法合成四種方法來製備。α-熊果苷一般只能通過糖苷酶或微生物發酵製得，但因α-糖苷酶價格昂貴，目前只局限於實驗室研究，而微生物發酵工藝步驟繁多、生產過程產生大量高BOD的廢水，生產成本高居不下，限制了 α -熊果苷的大規模工業
化生產。為了克服這些問題，本發明首次採用商業化假絲酵母脂肪酶直接催化對苯二酚和糖合成α-熊果苷，具有催化劑價格低廉、反應條件溫和、脂肪酶可多次重複利用，生產過程不產生廢水，產物提取工藝簡單等優點，大大降低了生產成本。對α-熊果苷的酶法工業化生產具有重要的現實意義。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的缺陷，利用游離或固定化假絲酵母脂肪酶催化對苯二酚和糖合成α -熊果苷，該反應具有反應條件溫和、脂肪酶可多次重複利用、生產過程不產生廢水等優點，提高了 α-熊果苷的產率，降低α-熊果苷的生產成本，使大規模生產α-熊果苷成為了可能。本發明的整體技術構思是游離假絲酵母脂肪酶催化合成α -熊果苷的方法，該方法由下列工藝步驟組成a.游離脂肪酶催化合成α _熊果苷；b.游離脂肪酶的回收及多次重複使用；c.游離脂肪酶催化合成的α -熊果苷的分離純化；固定化假絲酵母脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，該方法由下列工藝步驟組成Α.固定化脂肪酶催化合成α -熊果苷；B.固定化脂肪酶的回收及多次重複使用；C.固定化脂肪酶催化合成的α-熊果苷的分離純化。本發明的具體工藝步驟及工藝條件是步驟a中反應條件為對苯二酚和糖按兩者摩爾比在1 1-1 3的範圍，加入到反應媒介中，反應以游離假絲酵母脂肪酶為催化劑，在溫度20-60°C，搖床轉速lOO-lSOr/min的條件下，反應 10-120小時，脂肪酶的用量是糖質量的0. 01-1倍；糖為葡萄糖、蔗糖或麥芽糖；反應媒介為水、有機溶劑、離子液體或混合溶劑；其中有機溶劑為正己烷、環己烷、石油醚、正庚烷、正辛烷、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、叔戊醇、二甲基亞碸、吡啶、四氫呋喃、 二氯甲烷或四氯甲烷；離子液體為[bmim]PF6、[nmim]PF6、[bmim]BF4、[nmim]BF4、[omim]BF4、 [4-mbp]BF4, [bmim]0Tf、[bmim]NTf2、[讓加]1116504或[emim]benzoate ；混合溶劑為有機溶劑之間的混合溶劑或有機溶劑與水之間的混合溶劑，如正己烷與環己烷的混合溶劑，正己烷與正辛烷的混合溶劑，正丁醇和叔丁醇的混合溶劑，叔丁醇和二甲基亞碸的混合溶劑，正己烷、正丁醇和吡啶的混合溶劑、正己烷和水的混合溶劑，叔丁醇和水的混合溶劑，叔丁醇、 二甲基亞碸和水的混合溶劑或正己烷、叔丁醇、二甲基雅芳和水的混合溶劑等。步驟A中反應條件為對苯二酚和糖按兩者摩爾比在1 1-1 3的範圍，加入到反應媒介中，反應以固定化假絲酵母脂肪酶為催化劑，在溫度20-60°C，搖床轉速100-180r/min的條件下，反應 10-120小時，脂肪酶的用量是糖質量的0. 01-5倍；糖為葡萄糖、蔗糖或麥芽糖；反應媒介為水、有機溶劑、離子液體或混合溶劑；其中有機溶劑為正己烷、環己烷、石油醚、正庚烷、正辛烷、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、叔戊醇、二甲基亞碸、吡啶、四氫呋喃、 二氯甲烷或四氯甲烷；離子液體為[bmim]PF6、[nmim]PF6、[bmim]BF4、[nmim]BF4、[omim]BF4、 [4-mbp]BF4, [bmim]0Tf、[bmim]NTf2、[讓加]1116504或[emim]benzoate ；混合溶劑為有機溶劑之間的混合溶劑或有機溶劑與水之間的混合溶劑，如正己烷與環己烷的混合溶劑，正己烷與正辛烷的混合溶劑，正丁醇和叔丁醇的混合溶劑，叔丁醇和二甲基亞碸的混合溶劑，正己烷、正丁醇和吡啶的混合溶劑、正己烷和水的混合溶劑，叔丁醇和水的混合溶劑，叔丁醇、 二甲基亞碸和水的混合溶劑或正己烷、叔丁醇、二甲基雅芳和水的混合溶劑等；脂肪酶固定化介質為固體顆粒、纖維織物或非織造布，如矽膠、硅藻土、樹脂、棉布、聚酯、尼龍或絲綢。步驟b中游離脂肪酶的回收及多次使用為回收方法板框過濾、濾紙過濾、微濾、超濾、納濾或離心；使用壽命5-10周期。步驟B中固定化脂肪酶的回收及多次使用為回收方法板框過濾、濾紙過濾、微濾、超濾、納濾或離心；使用壽命10-30周期。步驟c和步驟C中的α -熊果苷的分離純化包括以下四個步驟①將去除脂肪酶後的反應液真空濃縮回收反應媒介，真空濃縮真空度為0. IMpa, 溫度為30-65度；②把經過①步驟的濃縮液通過弱極性大孔吸附樹脂或極性大孔吸附樹脂柱進行分離純化；③把經過②步驟大孔吸附樹脂柱的流出液真空乾燥，即可得到純度為95%以上的α -熊果苷粗品，真空乾燥真空度為0. IMpa，溫度為40_65度，乾燥後的成品為白色粉末狀；④把經過③步驟的α -熊果苷粗品溶於水後進行結晶，即得到純度為99. 5%以上得α -熊果苷純品，結晶溫度為0-4度。本發明提供的利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其中脂肪酶酶活的定義為40°C條件下，ρΗ8.0的磷酸緩衝溶液中水解橄欖油，沒分鐘釋放出Ιμπιο 脂肪酸的酶量為一個酶活單位。本發明所用的脂肪酶的酶活單位為250-10000U/g。本發明所取得的技術進步在於(1)本發明為國內外首次利用商品化假絲酵母脂肪酶催化對苯二酚和糖合成α-熊果苷；(2)相對於傳統酶法和發酵法合成α -熊果苷，本發明具有反應條件溫和、工藝步驟簡單、不產生廢水、環境友好、容易大規模工業化生產等優點；(3)相對於傳統酶法合成α -熊果苷，本發明所用的假絲酵母脂肪酶為商業化脂肪酶，具有價格低廉、來源廣泛、可大規模工業化生產等優點；(4)本發明使用固定化假絲酵母脂肪酶，具有脂肪酶與底物和產物容易分離的特點，而且脂肪酶的使用壽命長，可重複利用和連續化生產，大大降低了生茶成本。實施例以下結合實施例對本發明做進一步描述。實施例1(a)游離脂肪酶催化合成α _熊果苷將對0. Ilg(Immol)對苯二酚和0. 18g(Immol)葡萄糖加入到IOml正己烷中，反應以0. 02g游離假絲酵母脂肪酶為催化劑，在溫度40°C，搖床轉速150r/min的條件下，反應 24小時，轉化率達60% ；(b)游離脂肪酶的回收及多次使用反應結束後，反應液在6000r/min離心15min即可把游離脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)對苯二酚和0. 18g(lmmol)葡萄糖的IOml正己烷反應體系中繼續進行反應；如此重複循環，實現游離脂肪酶多次催化合成α -熊果苷，在此條件下，游離脂肪酶轉化5周期，α -熊果苷的轉化率分別為60. 0%,59.0%,57. 5%,54. 2%, 51. 6%，所以游離脂肪酶在使用5次後，酶活仍保持在50%以上。(c) α -熊果苷的分離純化①將離心後的上清液真空濃縮回收正己烷，真空濃縮真空度為0. IMpa，溫度為40 度；②把經過①步驟的濃縮液通過弱極性大孔吸附樹脂或極性大孔吸附樹脂柱進行分離純化；③把經過②步驟大孔吸附樹脂柱的流出液真空乾燥，即可得到純度為95%的 α -熊果苷粗品，真空乾燥真空度為0. IMpa，溫度為45度，乾燥後的成品為白色粉末狀；④把經過③步驟的α -熊果苷粗品溶於水後進行結晶，即得到純度為99. 5%以上得α -熊果苷純品，結晶溫度為4度。實施例2(a)游離脂肪酶催化合成α _熊果苷將對0. Ilg(Immol)對苯二酚和0. 36g(2mmol)葡萄糖加入到IOml含二甲基亞碸體積份數為10%的叔丁醇中，反應以0. 05g游離假絲酵母脂肪酶為催化劑，在溫度40°C，搖床轉速150r/min的條件下，反應72小時，轉化率達86% ；(b)游離脂肪酶的回收及多次使用反應結束後，反應液在6000r/min離心15min即可把游離脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)對苯二酚和0. 36g(2mmol)葡萄糖的IOml含二甲基亞碸體積份數為10%的叔丁醇中繼續進行反應；如此重複循環，實現游離脂肪酶多次催化合成α -熊果苷，在此條件下，游離脂肪酶轉化8周期，α -熊果苷的轉化率分別為86. 0%, 84. 5%、83. 0%、81. 2%、78. 6%、76. 3%、73. 8%、71. 5%，所以游離脂肪酶在使用 8 次後，酶活仍保持在70%以上。(c) α -熊果苷的分離純化操作步驟同實施例1的步驟c。實施例3(a)游離脂肪酶催化合成α _熊果苷將對0. Ilg(Immol)對苯二酚和0. 54g(3mmol)葡萄糖加入到IOml含二甲基亞碸體積份數為10 %的叔戊醇中，反應以0. 2g游離假絲酵母脂肪酶為催化劑，在溫度40°C，搖床轉速150r/min的條件下，反應72小時，轉化率達95% ；(b)游離脂肪酶的回收及多次使用反應結束後，反應液在6000r/min離心15min即可把游離脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)對苯二酚和0. 54g(3mmol)葡萄糖的IOm]含二甲基亞碸體積份數為10%的叔戊醇中繼續進行反應；如此重複循環，實現游離脂肪酶多次催化合成α-熊果苷，在此條件下，游離脂肪酶轉化10周期，α-熊果苷的轉化率分別為95. 0%、 94. 5%,93. 0%,91. 8%,89. 5%,87. 5%,85. 0%,83. 5%,82. 2%,80. 5%，所以游離脂肪酶在使用10次後，酶活仍保持在80%以上。(c) α -熊果苷的分離純化操作步驟同實施例1的步驟C。實施例4(a)游離脂肪酶催化合成α _熊果苷將對0. Ilg(Immol)對苯二酚和0. 34g(Immol)蔗糖加入到IOml混合溶劑(混合溶劑由體積份數為10%二甲基亞碸和體積份數85%叔丁醇及體積份數5%水組成)中，反應以0. 05g游離假絲酵母脂肪酶為催化劑，在溫度45°C，搖床轉速150r/min的條件下，反應 96小時，轉化率達85. 5% ；(b)游離脂肪酶的回收及多次使用反應結束後，反應液在6000r/min離心15min即可把游離脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)對苯二酚和0. 34g(Immol)蔗糖的IOml混合溶劑(混合溶劑由體積份數為10%二甲基亞碸和體積份數85%叔丁醇及體積份數5%水組成)中繼續進行反應；如此重複循環，實現游離脂肪酶多次催化合成α-熊果苷，在此條件下，游離脂肪酶轉化6周期，α -熊果苷的轉化率分別為85. 5%,83. 0%,81. 5%,77. 2%,73. 8%, 72. 0%，所以游離脂肪酶在使用6次後，酶活仍保持在70%以上。(c) α -熊果苷的分離純化操作步驟同實施例1的步驟C。實施例5(a)游離脂肪酶催化合成α _熊果苷將對0. Ilg(Immol)對苯二酚和1. 082g(3mmol)蔗糖加入到IOml混合溶劑(混合溶劑由體積份數為10%二甲基亞碸和體積價數85%叔丁醇及體積份數5%吡啶組成)中， 反應以0. 25g游離假絲酵母脂肪酶為催化劑，在溫度45°C，搖床轉速150r/min的條件下，反應96小時，轉化率達94.5%;(b)游離脂肪酶的回收及多次使用
反應結束後，反應液在6000r/min離心15min即可把游離脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)對苯二酚和1. 02g(3mmol)蔗糖的IOml混合溶劑(混合溶劑由體積份數為10%二甲基亞碸和體積份數85%叔丁醇及體積份數5%吡啶組成)中繼續進行反應；如此重複循環，實現游離脂肪酶多次催化合成α -熊果苷，在此條件下，游離脂肪酶轉化9周期，α -熊果苷的轉化率分別為94. 5%、93. 0%、91. 5%、90. 2%、88. 8%、 86. 5%,85.0%,83.6%,82. 0%，所以游離脂肪酶在使用9次後，酶活仍保持在80%以上。(c) α -熊果苷的分離純化操作步驟同實施例1的步驟c。實施例6(a)游離脂肪酶催化合成α _熊果苷將對0. Ilg(Immol)對苯二酚和0. 72g(2mmol)麥芽糖加入到IOml混合溶劑(混合溶劑由體積份數為10%吡啶和體積份數85%正己烷及體積份數5%水組成)中，反應以 0. 20g游離假絲酵母脂肪酶為催化劑，在溫度45°C，搖床轉速150r/min的條件下，反應96 小時，轉化率達94. 0% ；(b)游離脂肪酶的回收及多次使用反應結束後，反應液在6000r/min離心15min即可把游離脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)對苯二酚和0. 72g(2mmol)麥芽糖的IOml混合溶劑(混合溶劑由體積份數為10%吡啶和體積份數85%正己烷及體積份數5%水組成)中繼續進行反應；如此重複循環，實現游離脂肪酶多次催化合成α -熊果苷，在此條件下，游離脂肪酶轉化 10 周期，α -熊果苷的轉化率分別為94. 0%、93. 5%、93. 5%、91. 8%、89. 0%、87. 3%、 85. 2%,84. 6%,82. 6%,80. 1%,所以游離脂肪酶在使用10次後，酶活仍保持在80 %以上。(C) α-熊果苷的分離純化操作步驟同實施例1的步驟C。實施例7(a)固定化脂肪酶催化合成α _熊果苷將對0. Ilg(Immol)對苯二酚和0. 36g(2mmol)葡萄糖加入到IOml水中，反應以 0. 30g固定化假絲酵母脂肪酶為催化劑，在溫度40°C，搖床轉速180r/min的條件下，反應72 小時，轉化率達75.0% ；(b)固定化脂肪酶的回收及多次使用反應結束後，反應液用濾紙過濾即可把固定化脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)對苯二酚和0. 36g(2mmol)葡萄糖的IOml水中繼續進行反應；如此重複循環，實現固定化脂肪酶多次催化合成α -熊果苷，在此條件下，固定化脂肪酶轉化 12 周期，α-熊果苷的轉化率分別為75. 0%、73. 5%,71. 5%,70. 0%,68. 3%,66. 1%, 65. 5%,62. 2%,56. 5%,54. 2%,52. 1 %、51. 0%、，所以固定化脂肪酶在使用12次後，酶活仍保持在50%以上。(c) α -熊果苷的分離純化①將過濾後的濾液真空濃縮，真空濃縮真空度為0. IMpa，溫度為45度；②把經過①步驟的濃縮液通過弱極性大孔吸附樹脂或極性大孔吸附樹脂柱進行分離純化；
③把經過②步驟大孔吸附樹脂柱的流出液真空乾燥，即可得到純度為95%的 α -熊果苷粗品，真空乾燥真空度為0. IMpa，溫度為45度，乾燥後的成品為白色粉末狀；④把經過③步驟的α -熊果苷粗品溶於水後進行結晶，即得到純度為99. 5%以上得α -熊果苷純品，結晶溫度為4度。實施例8(a)固定化脂肪酶催化合成α _熊果苷將對0. Ilg(Immol)對苯二酚和0. 68g(2mmol)蔗糖加入到IOml含二甲基亞碸體積份數為10%的叔丁醇中，反應以1.5g固定化假絲酵母脂肪酶為催化劑，在溫度40°C，搖床轉速180r/min的條件下，反應72小時，轉化率達92% ；(b)固定化脂肪酶的回收及多次使用反應結束後，反應液用濾紙過濾即可把固定化脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)對苯二酚和0. 68g(2mmol)蔗糖的IOml含二甲基亞碸體積份數為 10%的叔丁醇中繼續進行反應；如此重複循環，實現固定化脂肪酶多次催化合成α-熊果苷，在此條件下，固定化脂肪酶轉化25周期，α -熊果苷的轉化率分別為92. 0%,91. 5%, 91. 7%,91. 2%,89. 5%,89. 0%,87. 2%,87. 5%,86. 6%,86. 0%,84. 8%,84. 5%,83. 0%, 83. 3%,81. 2%,79. 5%,79. 5%,77. 8%,77. 5%,76. 5%,75. 0%,73. 2%,72. 5%,71. 2%, 82.0%,所以同定化脂肪酶在使用25次後，酶活仍保持在70%以上。(C) α-熊果苷的分離純化操作步驟同實施例7的步驟C。實施例9(a)固定化脂肪酶催化合成α _熊果苷將對0. Ilg(Immol)對苯二酚和0. 72g(2mmol)麥芽糖加入到IOml混合溶劑(混合溶劑由體積份數為10%二甲基亞碸和體積份數85%叔丁醇及體積份數5%水組成)中， 反應以3. Og固定化假絲酵母脂肪酶為催化劑，在溫度45°C，搖床轉速180r/min的條件下， 反應120小時，轉化率達96. 5% ；(b)固定化脂肪酶的回收及多次使用反應結束後，反應液用濾紙過濾即可把固定化脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)對苯二酚和0. 72g(2mmol)麥芽糖的IOml混合溶劑(混合溶劑由體積份數為10%二甲基亞碸和體積份數85%叔丁醇及體積份數5%水組成)中繼續進行反應；如此重複循環，實現固定化脂肪酶多次催化合成α-熊果苷，在此條件下，固定化脂肪酶轉化30周期，α-熊果苷的轉化率分別為96. 5%、95. 5%、96. 0%、95. 0%、94. 5%、 93. 8%,93. 2%,92. 5%,91. 6%,92. 0%,91. 2%,90. 5%,89. 0%,88. 3%,87. 5%,86. 8%, 85. 5%,83. 8%,81. 5%,80. 5%,79. 0%,77. 1%,77. 5%,76. 8%,75. 6%,74. 8%,74. 5%, 73. 2 %、71. 9 %、70. 2 %，所以固定化脂肪酶在使用30次後，酶活仍保持在70 %以上。(C) α-熊果苷的分離純化操作步驟同實施例7的步驟C。
權利要求
1.一種利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特徵在於用游離或固定化假絲酵母脂肪酶(Candida lipase)催化對苯二酚與糖合成α-熊果苷，其中游離假絲酵母肪酶催化合成α-熊果苷的方法，該方法由下列工藝步驟組成a.游離脂肪酶催化合成α-熊果苷；b.游離脂肪酶的回收及多次重複使用；c.游離脂肪酶催化合成的α-熊果苷的分離純化；固定化假絲酵母脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，該方法由下列工藝步驟組成Α.固定化脂肪酶催化合成α -熊果苷；B.固定化脂肪酶的回收及多次重複使用；C.固定化脂肪酶催化合成的α-熊果苷的分離純化。
2.根據權利要求1所述的一種利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特徵在於 所述的a步驟中反應條件為對苯二酚和糖按兩者摩爾比在1 1-1 3的範圍，加入到反應媒介中，反應以游離假絲酵母脂肪酶為催化劑，在溫度20-60°C，搖床轉速100-180r/min 的條件下，反應10-120小時，脂肪酶的用量是糖質量的0. 01-1倍。
3.根據權利要求1所述的一種利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特徵在於 所述的A步驟中反應條件為對苯二酚和糖按兩者摩爾比在1 1-1 3的範圍，加入到反映媒介中，反應以固定化假絲酵母脂肪酶為催化劑，在溫度20-60°C，搖床轉速IOO-ISOr/ min的條件下，反應10-240小時，脂肪酶的用量是糖質量的0. 01-5倍。
4.根據權利要求1或2或3所述的一種利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特徵在於所述的a和A步驟中的糖為葡萄糖、蔗糖或麥芽糖。
5.根據權利要求1或2或3所述的一種利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特徵在於所述的a和A步驟中的反應媒介為水、有機溶劑、離子液體或混合溶劑；其中有機溶劑為正己烷、環己烷、石油醚、正庚烷、正丁醇、叔丁醇、叔戊醇、二甲基亞碸、吡啶、四氫呋喃或四氯甲烷；離子液體為[bmim]PF6、[nmim]PF6、[bmim]BF4、[nmim]BF4、[omim]BF4、[4-mbp] BF4, [bmim]0Tf、[bmim]NTf2、[讓加]1^504或[emim]benzoate ；混合溶劑為有機溶劑之間的混合溶劑或有機溶劑與水之間的混合溶劑，如正己烷與環己烷的混合溶劑，正己烷與石油醚的混合溶劑，正丁醇和叔丁醇的混合溶劑，叔丁醇和二甲基亞碸的混合溶劑，正己烷、正丁醇和吡啶的混合溶劑，正己烷和水的混合溶劑，叔丁醇和水的混合溶劑，叔丁醇、二甲基亞碸和水的混合溶劑或正己烷、叔丁醇、二甲基亞碸和水的混合溶劑等。
6.根據權利要求1或3所述的一種利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特徵在於所述的A步驟中的固定化脂肪酶固定化介質為固體顆粒、纖維織物或非織造布，如矽膠、硅藻土、樹脂、棉布、聚酯、尼龍或絲綢。
7.根據權利要求1所述的一種利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特徵在於 所述的b步驟中游離脂肪酶的回收方法為離心、微濾、超濾、納濾或板框過濾。
8.根據權利要求1所述的一種利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特徵在於 所述的b步驟中游離脂肪酶的使用壽命為5-10周期。
9.根據權利要求1所述的一種利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特徵在於 所述的B步驟中固定化脂肪酶的使用壽命為10-50周期。
10.根據權利要求1所述的一種利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特徵在於所述的c和C步驟中的α-熊果苷的分離純化包括以下四個步驟①將去除脂肪酶後的反應液真空濃縮回收反應媒介，真空濃縮真空度為0.IMpa，溫度為30-65度；②把經過①步驟的濃縮液通過弱極性大孔吸附樹脂或極性大孔吸附樹脂柱進行分離純化；③把經過②步驟大孔吸附樹脂柱的流出液真空乾燥，即可得到純度為95%以上的 α -熊果苷粗品，真空乾燥真空度為0. IMpa，溫度為40_65度，乾燥後的成品為白色粉末狀；④把經過③步驟的α-熊果苷粗品溶於水後進行結晶，即得到純度為99. 5%以上得 α -熊果苷純品，結晶溫度為0-4度。
全文摘要
本發明涉及一種利用游離或固定化假絲酵母脂肪酶(candida lipase)催化合成α-熊果苷的製備方法，它包括反應體系的選擇，固定化脂肪酶的製備，反應條件的優化和產物的提取等工藝步驟；將對苯二酚和糖按兩者摩爾比在1∶1～1∶5的範圍，加入到反應媒介中，反應以脂肪酶為催化劑。在20～60℃的條件下，反應10-120小時，α-熊果苷的轉化率最高可達95％以上。脂肪酶的用量是糖質量的0.01-5倍。本發明首次通過游離脂肪酶或固定化脂肪酶催化合成α-熊果苷，具有反應條件溫和、脂肪酶可多次重複利用，生產周期短，產物提取工藝簡單等優點，大大降低了生產成本。
文檔編號C12R1/72GK102517362SQ20111043195
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月21日 優先權日2011年12月21日
發明者劉春巧, 曹熙, 王芳, 聶開立, 譚天偉, 鄧利 申請人:北京化工大學