一種檢測超低含量黃麴黴毒素的方法
2023-10-26 04:32:57 2
一種檢測超低含量黃麴黴毒素的方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測超低含量黃麴黴毒素的方法，該方法包括以下步驟：準備玻碳電極，在玻碳電極上採用化學法修飾一層單壁碳納米管，利用連接劑共價鍵合；牛血清蛋白-黃麴黴毒素偶聯形成抗原AFB1-BSA；抗原AFB1-BSA與單壁碳納米管上的活化羧基反應連接；採用夾心法競爭法利用抗原抗體反應與同時加入的黃麴黴毒素單體來競爭吸附一抗，獲得二抗；性磷酸酶標記二抗；測定鹼性磷酸酶標記的二抗電化學信號，繪製標準曲線，得到實測樣品黃麴黴毒素濃度。本發明提供的檢測超低含量黃麴黴毒素的方法操作簡單、選擇性高、特異性高，能簡單快速的檢測含量黃麴黴毒素，所需設備簡易，成本低，具有極大的實際使用價值和良好的發展空間。
【專利說明】一種檢測超低含量黃麴黴毒素的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於黃麴黴毒素檢測領域，尤其涉及一種檢測超低含量黃麴黴毒素的方法。
【背景技術】
[0002]黃麴黴毒素(aflatoxin, AFT)主要是由黃麴黴(Aspergillus flavus)和寄生麴黴(Aspergillus parasiticus)等真菌產生的次生代謝產物。黃麴黴毒素分為BI,B2,Gl,G2以及Ml，M2幾個亞型，其中AFBl被國際癌症研究機構列為I級致癌劑，毒性最大，是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，低劑量長期攝入或大劑量一次暴露均可引發多種動物肝臟發生癌變或急性中毒。低劑量長期攝入或大劑量一次暴露均可引發多種動物肝臟發生癌變或急性中毒。
[0003]AFBl的理化性質非常穩定，在高溫268?269 °C時才分解，高壓
0.103MPa(120°C ) 4h處理毒性才降低一半，分子質量為312.06u。AFBl可以通過食物鏈富集到人體，危害人體健康，因而世界各國都將AFBl作為強制性監控指標。
[0004]目前黃麴黴毒素的檢測方法主要有:
[0005]1、生物鑑定法(利用黃麴黴毒素能影響微生物、水生動物、家禽等生物體的細胞代謝來鑑定黃麴黴毒素的存在。該方法專一性差、靈敏度低，一般只作為化學分析法的佐證，其特點是待檢樣品不需很純，主要用於定性)；
[0006]I1、化學分析法(最常用的為薄層層析法(TLC)，主要是半定量)；
[0007]II1、儀器分析法(高效液相色譜法(HPLC)和毛細管電泳技術，具有自動化、高分離效能、高檢測效能，缺點是需要昂貴的儀器設備，操作複雜)；
[0008]IV、免疫分析法(放射免疫法、親和層析法、酶聯免疫法和免疫膠體金技術，具有操作簡單、高選擇、高特異性等特點，是較成熟的快速診斷方法，但是有時檢測靈敏度不十分理想。
【發明內容】
[0009]本發明實施例的目的在於提供一種檢測超低含量黃麴黴毒素的方法，旨在解決目前檢測黃麴黴毒素的方法靈敏度不高、檢測範圍比較窄的問題。
[0010]本發明實施例是這樣實現的，一種檢測超低含量黃麴黴毒素的方法，該方法包括以下步驟:
[0011]準備玻碳電極，在玻碳電極上採用化學法修飾一層單壁碳納米管，利用連接劑共價鍵合；
[0012]牛血清蛋白-黃麴黴毒素偶聯形成抗原AFBl-BSA ；
[0013]抗原AFBl-BSA與單壁碳納米管上的活化羧基反應連接；
[0014]採用夾心法競爭法利用抗原抗體反應與同時加入的黃麴黴毒素單體來競爭吸附一抗，獲得二抗；
[0015]鹼性磷酸酶標記二抗；
[0016]測定鹼性磷酸酶標記的二抗電化學信號，繪製標準曲線，得到實測樣品黃麴黴毒素濃度。
[0017]進一步，利用連接劑共價鍵合的方法為:利用3-二甲基氨基丙基亞胺(EDC)/N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)連接劑共價鍵合法。
[0018]進一步，抗原AFBl-BSA與單壁碳納米管上的活化羧基反應連接的方法為:
[0019]抗原AFBl-BSA通過蛋白質氨基端與單壁碳納米管上的活化羧基反應連接。
[0020]進一步，標記二抗的鹼性磷酸酶可採用(EC3.1.3.1):戊二醛交聯標記法
[0021]本發明提供的檢測超低含量黃麴黴毒素的方法操作簡單、選擇性高、特異性高，能簡單快速的檢測含量黃麴黴毒素，所需設備簡易，成本低，具有極大的實際使用價值和良好的發展空間。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1是本發明實施例提供的檢測超低含量黃麴黴毒素的方法流程圖。
[0023]圖2是本發明實施例提供的檢測超低含量黃麴黴毒素的化學反應過程示意圖；
[0024]圖3是本發明實施例提供的黃麴黴毒素BI含量測定標準曲線示意圖。
【具體實施方式】
[0025]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
[0026]圖1示出了本發明提供的檢測超低含量黃麴黴毒素的方法的流程。為了便於說明，僅僅不出了與本發明相關的部分。
[0027]如圖1所示，本發明的實施例提供的檢測超低含量黃麴黴毒素的方法包括以下步驟:
[0028]準備玻碳電極，在玻碳電極上採用化學法修飾一層單壁碳納米管，利用連接劑共價鍵合；
[0029]牛血清蛋白-黃麴黴毒素偶聯形成抗原AFBl-BSA ；
[0030]抗原AFBl-BSA與單壁碳納米管上的活化羧基反應連接；
[0031]採用夾心法競爭法利用抗原抗體反應與同時加入的黃麴黴毒素單體來競爭吸附一抗，獲得二抗；
[0032]鹼性磷酸酶標記二抗；
[0033]測定鹼性磷酸酶標記的二抗電化學信號，繪製標準曲線，得到實測樣品黃麴黴毒素濃度。
[0034]作為本發明實施例的一優化方案，利用連接劑共價鍵合的方法為:利用3- 二甲基氨基丙基亞胺(EDC)/N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)連接劑共價鍵合法。
[0035]作為本發明實施例的一優化方案，抗原AFBl-BSA與單壁碳納米管上的活化羧基反應連接的方法為:
[0036]抗原AFBl-BSA通過蛋白質氨基端與單壁碳納米管上的活化羧基反應連接。
[0037]作為本發明實施例的一優化方案，標記二抗的鹼性磷酸酶可採用:戊二醛交聯標記法。
[0038]表1花生加標回收率測定
[0039]
【權利要求】
1.一種檢測超低含量黃麴黴毒素的方法，其特徵在於，該檢測超低含量黃麴黴毒素的方法包括以下步驟: 準備玻碳電極，在玻碳電極上採用化學法修飾一層單壁碳納米管，利用連接劑共價鍵合； 牛血清蛋白-黃麴黴毒素偶聯形成抗原AFBl-BSA ； 抗原AFBl-BSA與單壁碳納米管上的活化羧基反應連接； 採用夾心法競爭法利用抗原抗體反應與同時加入的黃麴黴毒素單體來競爭吸附一抗，獲得二抗； 鹼性磷酸酶標記二抗； 測定鹼性磷酸酶標記的二抗電化學信號，繪製標準曲線，得到實測樣品黃麴黴毒素濃度。
2.如權利要求1所述的檢測超低含量黃麴黴毒素的方法，其特徵在於，利用連接劑共價鍵合的方法為:利用3-二甲基氨基丙基亞胺/N-羥基琥珀醯亞胺連接劑共價鍵合法。
3.如權利要求1所述的檢測超低含量黃麴黴毒素的方法，其特徵在於，抗原AFBl-BSA與單壁碳納米管上的活化羧基反應連接的方法為: 抗原AFBl-BSA通過蛋白質氨基端與單壁碳納米管上的活化羧基反應連接。
4.如權利要求1所述的檢測超低含量黃麴黴毒素的方法，其特徵在於，標記二抗的鹼性磷酸酶(EC3.1.3.1)可採用:戊二醛交聯標記法。
【文檔編號】G01N33/551GK104181294SQ201310626655
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年12月2日 優先權日:2013年12月2日
【發明者】李朝睿, 張弦, 邱景富 申請人:重慶醫科大學