一種可分泌纖維素酶的菌株及其纖維素酶提取方法與應用的製作方法

2023-10-26 03:17:47 1

專利名稱：一種可分泌纖維素酶的菌株及其纖維素酶提取方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物領域，具體地說是一種可分泌纖維素酶的菌株的分離方法、該菌株產纖維素酶及其提取方法及應用。
背景技術：
纖維素是自然界中分布最廣泛的多糖類物質。如能合理利用使其降解為可利用的糖類，可解決當前人類社會所面臨的糧食與能源問題。纖維素酶是水解纖維素為可發酵性糖的關鍵酶，纖維素被水解後可得到還原性糖，從而通過發酵工藝進一步轉化為生物能源等物質。在草料中添加纖維素酶，可增加飼料的利用率，提高飼養動物的產肉率。目前纖維素酶還被廣泛用於多紡織、造紙等工業領域。 用於產纖維素酶的真菌多為裡氏木黴。當前纖維素酶多由微生物發酵生產。但酶活產量低，成為纖維素酶工業化的最大阻力。尋找高效纖維素酶產生菌極為重要。

發明內容
本發明的目的是為了解決上述技術問題，提供一種可分泌酶活高、產量高的纖維素酶的產酶菌株。本發明的另一目的還提供上述菌株的分離方法。本發明的同時還提供一種上述菌株分泌的纖維素酶的提取方法及其應用。本發明可分泌纖維素酶的菌株為綠木黴ZY-01,保藏名稱為綠木黴(Trichodermavirens ZY-01)，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC No: M 2012205，保藏日期為2012年6月5日，該菌株18s rDNA序列如序列表SEQ ID NO. I所示。Trichoderma virens ZY-Ol (CCTCC No M 2012205)的具體特徵如下(I)菌落形態菌絲層較厚，緻密叢束狀，初期為白色，平坦，後期因產生孢子，而成綠色。菌落背面無色，或逐漸呈暗黃色。(2)水解圈特性在剛果紅培養基上有較大明顯水解圈。⑶細胞形態菌絲透明至淺綠色，壁光滑，分生孢子梗由菌絲側面生出，基部通常不育，且不分枝，向頂分枝不規則，整體像樹枝。厚垣孢子呈卵圓形，光滑，淡綠色。18s rDNA序列分析表明該菌株(Trichoderma viride ZY-OI)與模式菌株Trichoderma atroviride [Μ] 206040 和 Trichoderma virens Gv29_8 的序列同源性為 99%,結合形態學特徵和培養特徵分析，該菌有綠木黴的特性，該菌歸為木黴屬(Trichodermasp.)。上述可分泌纖維素酶的菌株的分離方法，包括下述步驟I)從秸杆作物農田取得土壤，加水振蕩後使土壤與無菌水充分混合散開，靜置使其澄清，取上清液；土壤和無菌水的混合質量體積比優選為I :9。2)將上清液滴加於剛果紅選擇培養基上，塗布均勻，30- 40 1恆溫培養3- 5天；所述剛果紅選擇培養基成分為=KH2PO4 O. 2- I. O g, MgSO4 · 7H20 O. 2- O. 5 g，瓊脂10- 20 g, CMC Na I- 5 g，剛果紅O. 20 g，2 %去氧膽酸鈉溶液20 mL，3- 5 mL鏈黴素溶液，蒸餾水定容至1000 mL ；3)在剛果紅選擇培養基上培養3- 5天後，觀察水解圈情況，當菌落周圍培養基相對無菌落部分的剛果紅著色較淺或接近於無色時，則該水解圈指示得到可分泌纖維素酶的菌株。由於該菌株可分泌出胞外纖維素酶並水解菌落周圍培養基中纖維素成分，致使菌落周圍培養基相對無菌落部分的剛果紅著色較淺或接近於無色，由該水解圈指示即說明已得到可分泌纖維素酶的菌株綠木黴ZY-Oi。由纖維素酶的產酶及純化提取方法包括下述步驟 (I)發酵產酶將所述的菌株接種入發酵產酶培養基中發酵產酶，所述發酵產酶培養基成份為羧甲基纖維素鈉(CMC Na)，酵母抽提物，NaCl，MgSO4 7H20和K2HPO4,發酵溫度為30- 40°C，發酵時間為3- 5天，得到發酵液；(2)纖維素酶提取將發酵液離心分離得到上清液，對上清液進行乙醇￠0- 85%)沉澱，再利用葡聚糖凝膠G-75層析，得到純化後的纖維素酶。所述步驟(I)中發酵培養基組成比例為0.5- 2 g酵母抽提物，5- 20 gCMC Na, 20- 30 g NaCl, O. 3- I g K2HPO4,0. 3- I g MgSO4 7H20，蒸餾水定容至 1000mL。將菌種接入該培養基30- 40 °C培養3- 5天。本發明纖維素酶由上述提取方法得到。上述纖維素酶用於甘蔗渣、玉米秸杆及、稻草或小麥秸杆等高纖維素含量的生物質(以下簡稱生物質)的高效降解。所述降解方法為將生物質粉碎後用I %_ 3 % (w/v) NaOH預處理，其中固液質量體積比為I :20，隨後每I g預處理後的生物質中加入50-70 IU (國際酶活單位)的所述纖維素酶，加入緩衝液調節PH值到4. O- 6.0,40- 60°C恆溫酶解20-50 h0所述預處理可採用機械粉碎後NaOH溶液浸泡的方法，其目的是為了破壞纖維素和半纖維素與木質素之間對鹼不穩定的化學鍵，溶解半纖維素和一部分木質素，使纖維暴露易於分解。所述緩衝液可以為常用的Tirs緩衝液、檸檬酸緩衝液、磷酸緩衝液或醋酸緩衝液
坐寸ο所述酵母抽提物(如0X0ID 酵母抽提物)的提取方法為現有技術，不作詳述。所述甘蔗渣或、玉米秸杆粉碎後過40-80目，所述稻草、小麥秸杆粉碎至5 mm以下，優選為不大於3mm。有益效果(I)本發明從秸杆作物農田(如玉米、水稻或小麥作物農田)的土壤中篩選得到一種可分泌纖維素酶的綠木黴ZY-Ol (Trichoderma viride ZY-01,保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC No Μ 2012205，)，該菌株的分離方法簡單、來源廣泛、可由秸杆作物農田中的土壤中分離獲得。(2)對由綠木黴的分泌物中提取的纖維素酶酶進行酶學研究得知，該酶在45- 55°C, pH 4.6- 5. 6時酶活性最高，而其耐受範圍為30- 80 1和pH 3.6- 7，其中30- 50 V和pH 5- 6時穩定性最高，具有酶活高，反應適應的條件範圍廣，易於製備的優點。(3)本發明纖維素酶具有很高的纖維素降解活性，其中以該酶的內切葡聚糖酶(EG)活性最為顯著。用其作為催化劑對甘蔗渣渣、玉米秸杆、稻草和小麥秸杆進行降解20-
40h，產糖率分別高達質量百分數29. 2 %、23. 8 %、21. 3 %和22. 2 %，隨著反應時間的延長，產糖率會進一步增加，具有廣泛的工業應用前景。


圖I為本發明綠木黴Trichoderma virens ZY-01的基因組DNA和18s rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖，其中I為marker，2為18s rDNA，3基因組DNA。 圖2為纖維素葡聚糖G-75凝膠層析圖。圖3為圖2中峰2的葡聚糖G-75凝膠層析圖。
具體實施例方式實施例中所涉及的培養基為[I]剛果紅選擇培養基=KH2PO4 O. 2- I. O g, MgSO4 7H20 O. 2_ O. 5 g，瓊脂 10-20 g, CMC Na I- 5 g，剛果紅O. 20 g，2 %去氧膽酸鈉溶液20 mL，3- 5 mL鏈黴素溶液、蒸餾水定容至1000 mL ；[2]發酵培養基0.5- 2 g 酵母抽提物，5- 20 g CMC Na, 20- 30 g NaCl, O. 3-
1g K2HPO4,0. 3- I g MgSO4 7H20，蒸餾水定容至 1000 mL。實施例I :菌株的篩選本發明的綠木黴(Trichoderma virens ZY-01,保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC No M 2012205，保藏日期為2012年6月5日)是一種屬於真菌類的菌株，該菌株從土壤中分離，經過以底物羧甲基纖維素鈉(CMC Na)為唯一碳源從土壤樣品中富集篩選的方法獲得。篩選產高效纖維素酶菌株的方法為(I)稱取10 g土壤樣品(本實施例中土壤取自於玉米秸杆作物農田)，加入90 mL無菌水，振蕩均勻呈懸浮液。靜置為上清液澄清，備用；(2)取I mL靜置後的上清液，在無菌條件下接種於剛果紅選擇培養基中30- 40°C°C 培養 3-5 d ；(3)培養3-5 d後，該菌株可分泌出胞外纖維素酶並水解菌落周圍培養基中纖維素成分，致使菌落周圍培養基相對無菌落部分的剛果紅著色較淺或接近於無色，由該水解圈指示得到可降解纖維素的菌株-綠木黴(Trichoderma virens ZY-01)。實施例2 :菌株鑑定(I)實施例I中所分離菌株採用CTAB法提取其基因組DNA 取10 mL菌液於離心管4 °C, 10000 r/min離心10 min，得到菌絲；菌絲加入4 mLCTAB和O. 8 mL巰基乙醇混合均勻，並分裝與I. 5 mL離心管中水浴保持30 min ;加入等體積酚/氯仿異戊醇(其中氯仿/異戊醇體積比例為24 :1)，震蕩搖勻，4 °C, 12000 r/min離心10 min;上清液中加入2 μ L RNA酶，混勻後37 1水浴保持20- 30 min ;水浴後將混合液分裝至I. 5 mL離心管中，每管約400 μ L ;再加入2倍體積無水乙醇和1/10體積NaAC溶液，沉澱；沉澱徹底後離心棄上清，75 %乙醇洗滌2- 3次；晾乾加入TE緩衝液溶解，-20 V保存。(2)菌株18s rDNA序列分析對菌株18s rDNA基因克隆和序列分析；其中使用真菌18s rDNA通用引物，其上遊引物為NSl GTAGTCATATGCTTGTCTC (如序列表SEQ ID NO. 2所示)，下遊引物為NS8 TCCGCAGGTTCACCTACGGA (如序列表SEQ ID NO. 3所示)。PCR反應條件為94 °C預變性5min ； 94 °C變性30 s ； 52 °C退火45 s ； 72 °C延伸90 s ；重複2- 4步30個循環，72°C保持 10 min。
以基因組為模板進行並使用通用引物對其18s rDNA進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖I。擴增產物由生工生物工程(上海)有限公司測序，18s rDNA序列見SEQ IDNO. 1，並在NCBI (美國國立生物技術信息中心)上進行比對。實施例3-5 :菌株發酵產酶將實施例I中得到的菌株轉入發酵培養基中進行發酵產酶，得到粗酶液。實施例中所述菌種的發酵培養基成分主要涉及碳源、氮源、無機鹽。其發酵培養基成分中碳源為羧甲基纖維素鈉(CMC Na)，氮源為酵母抽提物(英國OXOID公司)，無機鹽為NaCl、MgSO4 7H20和K2HPO4。具體步驟如表I所示
權利要求
1.一種可分泌纖維素酶的菌株，保藏名稱為綠木黴ZY-Ol (Trichoderma virensZY-01)，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC No: M 2012205，該菌株18srDNA序列如序列表SEQ ID NO. I所示。
2.如權利要求I所述的可分泌纖維素酶的菌株的分離和鑑定方法，其特徵在於 1)從秸杆作物農田取得土壤，加水振蕩後使土壤與無菌水充分混合散開，靜置使其澄清，取上清液； 2)取上清液滴加於剛果紅選擇培養基上，塗布均勻，30-40 1恆溫培養3- 5天； 所述剛果紅選擇培養基成分為KH2PO4 0.2- 1.0 g，MgSO4 7H20 0.2- 0.5 g，瓊脂10- 20 g, CMC Na 1-5 g，剛果紅0. 20 g，2 %去氧膽酸鈉溶液20 mL，3- 5 mL鏈黴素溶液，蒸懼水定容至1000 mL ； 3)在剛果紅選擇培養基上培養3-5天後，觀察水解圈情況，當菌落周圍培養基相對無菌落部分的剛果紅著色較淺或接近於無色時，則該水解圈指示得到可分泌纖維素酶的菌株。
3.一種由纖維素酶的產酶及純化提取方法，其特徵在於，包括下述步驟 (1)發酵產酶 將權利要求I所述的菌株接種入發酵產酶培養基中發酵產酶，所述發酵產酶培養基主要成份包括羧甲基纖維素鈉(CMC Na)，酵母抽提物，NaCl，MgSO4 7H20和K2HPO4,發酵溫度為30- 40 °C，發酵時間為3- 5天，得到發酵液； (2)纖維素酶純化提取 將發酵液離心分離得到上清液，對上清液採用乙醇沉澱法及葡聚糖凝膠G-75層析法純化，得到純化後的纖維素酶。
4.如權利要求3所述的由綠木黴生產纖維素酶的方法，其特徵在於，所述步驟(I)的發酵產酶培養基成分比例為0.5- 2 g酵母抽提物，5- 20 g羧甲基纖維素鈉(CMC Na)，20- 30 g NaCl,0. 3- I g K2HPO4,0. 3- I g MgSO4 7H20，蒸餾水定容至 1000 mL。
5.一種纖維素酶，由權利要求3或4所述的提取及純化方法得到。
6.權利要求5所述纖維素酶的應用，所述纖維素酶用於高纖維素含量的生物質的高效降解。
7.如權利要求6所述的纖維素酶的應用，所述高纖維素含量的生物質為甘蔗渣、玉米稻杆、稻草或小麥稻杆。
8.如權利要求6或7所述的纖維素酶的應用，其特徵在於，所述降解方法為將高纖維素含量的生物質粉碎後用I %_ 3 % (w/v) NaOH預處理，其中固液質量體積比為I :20，隨後每I g預處理後的高纖維素含量的生物質中加入50-70 IU的權利要求5所述的纖維素酶，加入緩衝液調節pH值到4. 0- 6. 0,40- 60°C恆溫酶解20- 50 h。
9.如權利要求8所述的纖維素酶的應用，其特徵在於，所述粉碎步驟中，甘蔗渣或玉米秸杆粉碎後過40- 80目，稻草或小麥秸杆粉碎至5 mm以下。
全文摘要
本發明公開了一種可分泌纖維素酶的菌株及其纖維素酶提取方法與應用，解決了現有產纖維素酶菌株酶活產量低的問題，提供一種可分泌纖維素酶的菌株，保藏名稱為綠木黴ZY-01 (Trichoderma virens ZY-01)，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NoM 2012205，該菌株18s rDNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示，並描述了上述菌株的分離方法及纖維素酶的產酶及純化提取方法，以及用於甘蔗渣及秸稈的高效降解的應用方法。本發明菌株具有酶活高，反應適應的條件範圍廣，易於製備的優點，分泌的纖維素酶具有很高的纖維素降解活性。
文檔編號C12R1/885GK102807958SQ201210295819
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月16日 優先權日2012年8月16日
發明者楊忠華, 趙燕, 陳庚華, 周衛, 侯亞利 申請人:武漢科技大學