一種重鏈可變區單域抗體強化融合蛋白vh－ldp－ae的製作方法

2023-10-25 21:48:37

專利名稱：一種重鏈可變區單域抗體強化融合蛋白vh－ldp－ae的製作方法
技術領域：
本發明涉及的強化融合蛋白VH-LDP-AE，是一種具有強烈腫瘤細胞殺傷活性和抗腫瘤療效的新型、小型、高效腫瘤靶向性治療劑。
背景技術：
IV型膠原酶降解IV型膠原等細胞外基質組分，破壞基底膜及細胞外基質的完整性，與腫瘤生長、侵襲和轉移的關係甚為密切。在人類前列腺癌、結直腸癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等腫瘤細胞和組織中均存在IV型膠原酶高表達，抑制其活性可以抑制腫瘤的生長和轉移。單域抗體(single domain antibody)是抗體的最小功能結合單位，相當於人抗體的重鏈或輕鏈可變區(VH/VL)，其分子量為11-13kD，約為完整抗體分子量(150kD)的十二分之一，是繼全抗、抗原結合片段(Fab)、單鏈抗體(scFv)之後的新一代治療抗體。單域抗體具有傳統抗體和小分子藥物的雙重優勢首先，不僅有更好的實體瘤細胞間隙穿透性，在腫瘤中更加均衡的生物分布，還具更低的免疫源性，從而在腫瘤靶向性治療中顯示更好的療效；其次，小分子不僅可與標準的抗體靶標結合，還可與傳統抗體不能到達的靶標如受體裂縫或酶活性位點相結合；第三，應用細菌和酵母發酵就可進行低成本大規模生產，避免了在哺乳動物細胞中的生產瓶頸。單域抗體作為腫瘤靶向藥物的載體具有誘人的前景。
高活性的「彈頭」藥物力達黴素(LDM)，亦稱C-1027或C1027，是從我國湖北省潛江縣土壤中分離得到的一株由球孢鏈黴菌(Streptiomyces globisporus，菌種保藏編號CGMCC No.0704)產生的烯二炔類抗生素，是迄今報導過的對腫瘤細胞殺傷作用最強的大分子肽類抗腫瘤抗生素。體內動物實驗表明，LDM對小鼠結腸癌26有非常顯著的療效，對移植裸鼠的人肝癌Bel-7402和盲腸癌Hce-8693等多種人體移植腫瘤均有較好療效[中國抗生素雜誌1994，19(2)164-168]。LDM由兩部分分子組成一為烯二炔結構的發色團(active enediyne，AE)，具有細胞毒作用，但不穩定；另一為110個胺基酸殘基組成的輔基蛋白(LDP)，對發色團的穩定起保護作用。發色團和輔基蛋白通過非共價鍵結合，兩者結合具有特異性和牢固性，LDM的輔基蛋白和發色團可以拆分和進行分子重建。LDM以其獨特的分子結構可以成為構建新型單抗導向藥物的理想「彈頭」藥物[中國醫學科學院學報2001，23(6)563-567]。
小型化、高效化是解決當前單抗治療劑所遇到問題的主要有效途徑。本發明所涉及的VH-LDP-AE是以抗IV型膠原酶單抗3G11的重鏈可變區(VH)單域抗體為載體，強效抗腫瘤抗生素LDM為「彈頭」，採用DNA重組和分子重建技術相結合而製備的腫瘤導向免疫融合蛋白。研究表明，VH-LDP-AE在體外對腫瘤細胞有強烈的殺傷活性，體內實驗對小鼠移植性肝癌22有非常顯著的療效，並且與羥基喜樹鹼或5-氟尿嘧啶聯用對人結腸癌HT-29細胞的增殖抑制作用存在明顯的協同作用。本發明所說的單域抗體融合蛋白VH-LDP-AE的分子量為26.2kD，是迄今已知的分子量最小的體內試驗有顯著療效的抗腫瘤免疫融合蛋白。本發明所說的單域抗體強化融合蛋白VH-LDP-AE目前亦未見有相關報導。

發明內容
本發明涉及的單域抗體強化融合蛋白VH-LDP-AE系由抗IV型膠原酶單抗3G11的重鏈可變區單域VH、力達黴素輔基蛋白LDP和力達黴素活性發色團AE組成，分子量為26.2kD，其融合蛋白VH-LDP的基因編碼序列和胺基酸組成如序列表所示。
本項發明的技術方案包括以下步驟1、抗IV型膠原酶抗體重鏈可變區單域VH基因和力達黴素輔基蛋白LDP基因的克隆和重組表達質粒pET-VH-LDP的構建重組質粒pKFv1027和pIJ1027GRGDS分別含有VH基因和LDP基因，由本實驗室構建(本實驗室可向公眾提供並出具相關證明)。pGEM-T載體為美國Promega公司產品，大腸桿菌菌種E.coli.DH5α本實驗室保存，大腸桿菌表達質粒pET-30a(+)為本實驗室保存的Invitrogen公司的產品。PCR引物由上海生工公司合成，分別引入相應酶切位點。
VH 5』端引物(PH1)5』GATACATATGCAGGTGAAGCTGCAGCAGTCT3』；NdeI VHVH3』端引物(PH2)
5』CATAGGATCCGCCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT3』BamHI spacer VHLDP 5』端引物(PLD1)GATAGGATCCGCGCCCGCCTTCTCCGTCAGT3』BamHI LDPLDP 3』端引物(PLD2)GTTACTCGAGGCCGAAGGTCAGAGCCACGTG3』XhoILDP以重組質粒pKFv1027為模板，PH1為5』端引物，PH2為3』端引物，進行PCR擴增，獲得C末端帶有一段編碼GGGGS序列的spacer小肽的重鏈可變區單域抗體VH基因；同時以重組質粒pIJ1027GRGDS為模板，PLD1為5』端引物，PLD2為3』端引物，進行PCR擴增，獲得LDP基因片段。PCR反應體系為94℃預變性2分鐘，然後94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，進行25個循環的擴增反應，最終一個循環後在72℃保溫10分鐘。
兩種PCR產物利用博大泰克公司的DNA片段玻璃奶回收試劑盒純化回收後，按Promega公司pGEM-T載體試劑盒提供的方法與pGEM-T載體相連，轉化大腸桿菌DH5α，篩選出重組克隆質粒，經上海生工公司測序確定序列正確後分別命名為pGEM-T-VH、pGEM-T-LDP。將質粒pGEM-T-LDP進行BamHI/XhoI雙酶切，釋放出的LDP基因片段亞克隆至pET-30a(+)載體，得到重組質粒pET-LDP。然後將pGEM-T-VH進行NdeI/BamHI雙酶切，釋放出的VH基因片段與進行同樣雙酶切的質粒pET-LDP連接，得到VH基因和LDP基因的融合基因重組表達質粒pET-VH-LDP，並進行酶切鑑定(圖1)和序列測定。結果表明，融合基因重組表達質粒pET-VH-LDP的酶切結果和測序結果與預期完全一致，融合蛋白的基因編碼序列為732bp，由243個胺基酸組成，序列正確。
本發明在力達黴素輔基蛋白LDP基因3』端引入了XhoI酶切位點，恰好可以利用質粒pET-30a(+)多克隆位點3』端的6個連續組氨酸標籤肽(His6-Tag)的密碼子，使得表達蛋白的3』端融合有His6-Tag，便於純化和鑑定。
2、融合蛋白VH-LDP在大腸桿菌BL21starTM(DE3)中的誘導表達本發明使用的大腸桿菌表達菌株BL21starTM(DE3)為Invitrogen公司產品。以構建好的重組質粒pET-VH-LDP轉化大腸桿菌BL21starTM(DE3)，得到重組轉化菌。挑取單克隆接種到含有30μg/ml卡那黴素的LB培養基中，37℃震蕩過夜；次日按1∶50接種，37℃震蕩培養至OD600為0.7，向培養物中加入終濃度為0.05mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，誘導培養3小時，按pET系統操作手冊(Novagen，第九版)分別製備全細胞蛋白組分、培養液上清組分、細胞周質腔組分、可溶性細胞質和不可溶性細胞質(包涵體)組分，然後在變性條件下進行15％聚丙烯醯胺凝膠電泳分析外源蛋白表達情況。結果表明，經誘導的重組菌株表達了大量外源蛋白，表達量佔全菌總蛋白的30％以上，且表達產物存在於細菌不可溶的包涵體中(圖2)。
用Western blot檢測方法對表達蛋白進行進一步確認，將電泳後的凝膠在Bio-Rad電轉槽中進行半乾電轉，條件為恆電流0.65mA/cm2，時間為1小時50分鐘。電轉結束後的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)與用封閉液2000倍稀釋的一抗即抗His6-Tag單抗孵育，以辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG抗體為二抗，進行顯色分析，結果表明，重組菌株表達的確為C-末端帶有His6-Tag的重組融合蛋白VH-LDP(圖2)。將表達VH-LDP融合蛋白的重組轉化菌株命名為CAMS/HLDFP，已於2004年04月09日送交中國專利局指定的菌種保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市海澱區中關村北一條13號保藏(保藏編號CGMCC No.1130，分類命名大腸埃希氏菌Escherichia coli)。
3、融合蛋白VH-LDP的純化和復性採用Novagen公司的His·Bind純化試劑盒於變性條件下純化融合蛋白樣品，按試劑盒說明書進行操作。對包涵體蛋白樣品和親和層析柱進行預處理後，樣品上柱，依次以10倍柱床體積的含6M尿素的結合緩衝液(5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)，6體積含6M尿素的洗滌緩衝液(60mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)洗滌層析柱，最後以含6M尿素的洗脫緩衝液(100mM EDTA，0.5M NaCl，20mMTris-HCl pH7.9)進行洗脫，收集洗脫組分獲得純化的融合蛋白VH-LDP(圖3)。融合蛋白VH-LDP的理論分子量為25.4kD。
對純化後的融合蛋白VH-LDP進行復性將純化後的樣品用含6M尿素的洗脫緩衝液稀釋至15μM，加入2-巰基乙醇至終濃度為10mM，室溫放置30分鐘，然後將樣品裝入透析袋，用至少50倍樣品體積的復性液I(50mM Tris-HClpH 8.0，1mM EDTA，200mM NaCl，6M尿素)透析過夜。再用與復性液I同樣組分但尿素濃度依次為3M、2M、1M、0.5M、0M的50倍體積的緩衝液進行分步透析，在尿素濃度為1M的階段加入750μM的氧化型穀胱甘肽(GSSG)和400mM的L-精氨酸。將最後一次透析所得樣品用50倍體積磷酸鹽緩衝液(PBS，pH7.4)透析，每12小時更換一次透析液，共兩次。以上透析操作均於4℃進行。將透析後的樣品以10,000g，4℃離心30分鐘，收集上清。將上清樣品進行濃縮後得到活性融合蛋白VH-LDP，置於-20℃備用。
4、融合蛋白VH-LDP的免疫學活性以酶聯免疫吸附分析方法(ELISA)進行測定。首先進行IV型膠原酶的包被或細胞的固定將IV型膠原酶以PBS配製成10μg/ml的溶液，以100μl/井包被96孔板，然後置4℃過夜；將對數生長期的人肝癌Bel-7402細胞或人口腔鱗癌KB細胞按2×104/井的密度接種於96孔培養板，培養24小時後PBS洗3次，加4℃預冷的0.05％的戊二醛固定15分鐘。然後將包被好的IV型膠原酶板或固定好的細胞96孔板用PBS洗3次後，加入含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS 200μl/井，4℃封閉過夜。PBS洗3次後，加入倍比稀釋的待測樣品50μl/井，37℃溫育2小時。再以含0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩衝液(PBST)200μl/井洗板3次，加入1∶1500倍稀釋的抗His6-Tag單克隆抗體50μl/井，37℃反應1小時。以PBST洗板3次，50μl/井加入1∶2000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG，37℃反應1小時。最後以PBST洗板6次，100μl/井加入鄰苯二胺(OPD)底物反應液，室溫暗處反應10分鐘。以2M硫酸100μl/井終止反應，在酶標儀上測定490nm吸光值。結果表明，和單抗3G11的單鏈抗體3G11-scFv類似，融合蛋白VH-LDP對IV型膠原酶(圖4)、人肝癌Bel-7402細胞(圖5)、人口腔鱗癌KB細胞(圖6)的免疫反應均呈陽性。
5、融合蛋白VH-LDP對IV型膠原酶活性的抑制作用採用明膠酶譜法。取對數生長期的人纖維肉瘤HT-1080細胞，按1×105/孔加於24孔培養板中，37℃，5％CO2培養24小時。然後吸棄培養液，加入1ml無血清RPMI 1640培養液輕輕衝洗2次。每孔加入120μl無血清RPMI 1640培養液和30μl樣品，對照孔加入30μl PBS，繼續培養24小時。吸取培養液，500g離心5分鐘，取上清進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳。電泳完畢後，取出凝膠，用蒸餾水漂洗3次。將凝膠放入100ml 2.5％的曲拉通X-100(TritonX-100)中，於搖床上低速搖動30分鐘。然後以蒸餾水漂洗2次，換100ml新的2.5％的TritonX-100溶液，低速搖動30分鐘。蒸餾水漂洗2次，加入100ml明膠酶緩衝液(50mM Tris-HCl，pH7.5，200mM NaCl，10mM CaCl2，1μM ZnCl2)，37℃孵育16-18小時。考馬斯亮藍R250染色，乙酸∶甲醇∶水(10∶45∶45)脫色後觀察負染明膠條帶。結果表明，免疫融合蛋白VH-LDP對腫瘤細胞分泌的IV型膠原酶的活性有明顯的抑制作用，能夠使人纖維肉瘤HT-1080細胞分泌的92kD MMP-9和72kD MMP-2的IV型膠原酶負染條帶明顯減弱，並且呈濃度依賴性(圖7)。
6、強化融合蛋白VH-LDP-AE的製備取高活性LDM凍幹品(本實驗室製備保存並可向公眾提供)10mg，加5ml冷甲醇振搖5分鐘，-20℃放置1小時，中間振搖1次；在0℃，12000轉/分鐘離心20分鐘，上清液含發色團，沉降物為肽鏈，重複提取2次。發色團甲醇液蒸發濃縮，-70℃儲存。發色團不穩定，實驗需低溫(4℃)、避光進行。然後取VH-LDP融合蛋白溶於PBS中，加入5倍分子量的發色團-甲醇溶液(體積比為50∶1)，混合振搖，室溫放置12小時。最後將混合液進行PD-10柱(商業化的Sephadex G-25柱，Pharmacia產品)層析，經A280nm和A343nm紫外監測後收集強化融合蛋白VH-LDP-AE(圖8)。VH-LDP-AE的理論分子量為26.2kD。
7、強化融合蛋白VH-LDP-AE對體外培養的腫瘤細胞的細胞毒作用以噻唑藍(MTT)法進行測定。取對數生長期的細胞消化、計數，3000/井鋪於96孔板，在37℃含5％CO2的培養箱中培養24小時後加入不同濃度的藥物，每個藥物濃度設3個平行孔。繼續培養72小時，每孔加入50μl無血清RPMI 1640培養液溶解的MTT(2mg/ml)，37℃繼續培養4小時，輕輕吸去培養液，加入150μl二甲基亞碸(DMSO)，室溫下搖床振搖15分鐘，酶標儀上測定560nm光吸收值。每次試驗均設無藥對照孔和無細胞對照孔各3孔。按公式細胞存活率＝(A加藥組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100％計算細胞的存活率及半數抑制濃度(IC50)值。強化融合蛋白VH-LDP-AE對HT-1080細胞、KB細胞、人巨細胞肺癌PG細胞均由有強烈的殺傷作用，其IC50值均小於10-11M(表1)。
表1、VH-LDP-AE對腫瘤細胞的殺傷作用IC50(M)組別HT-1080 KB PGLDM 2.21×10-121.08×10-126.30×10-12VH-LDP-AE7.65×10-134.35×10-141.49×10-13
8、強化融合蛋白VH-LDP-AE對小鼠移植性肝癌22腫瘤模型的治療作用領取生長狀態良好的體重為18-22克的昆明小鼠隨機分組，每組10隻。實驗第0天，取小鼠肝癌22腹水，以生理鹽水稀釋成細胞數為7.5×106/ml，按0.2ml/只接種於昆明小鼠腋窩皮下。實驗第1天(24小時後)開始治療，對照組靜脈注射生理鹽水0.2ml/只。其餘各組分別給予不同劑量的強化融合蛋白VH-LDP-AE，0.05mg/kg的LDM，1mg/kg的絲裂黴素(MMC)。均為尾靜脈注射，0.2ml/只。試驗期間，每三天測量一次腫瘤的長徑a和短徑b，並記錄動物體重。以公式V＝0.5ab2計算瘤體積，繪製腫瘤生長曲線，並計算抑瘤率。
強化融合蛋白VH-LDP-AE的治療結果表明，0.25mg/kg和0.125mg/kg兩個劑量的VH-LDP-AE均能顯著抑制或延遲小鼠移植性腫瘤H22的生長，並且表現出比0.05mg/kg耐受劑量游離力達黴素更強的腫瘤生長抑制作用，顯示VH-LDP-AE提高了力達黴素的治療效果(圖9)。在實驗第14天的結果顯示，兩個劑量的VH-LDP-AE的抑瘤率分別為95.9％和88.1％，均顯著強於LDM組的79.6％抑瘤率，而常用腫瘤化療藥絲裂黴素的抑瘤率僅為51.5％(表2)。在實驗治療期間，動物體重有所增加，一般狀況良好，表明動物可耐受所給劑量。
表2、VH-LDP-AE對小鼠移植性肝癌22的生長抑制作用腫瘤體積小鼠數量 體重(g)組別 劑量(cm3)抑制率(％)(mg/kg)開始/結束 開始/結束x±sControl 10/10 18.89/33.20 4.60±1.48LDM0.05 10/10 19.77/26.28 0.94±0.5379.6ΔΔ0.25 10/10 19.27/23.50 0.19±0.2195.9**ΔΔVH-LDP-AE0.125 10/10 19.01/27.59 0.55±0.2488.1*ΔΔMMC1 10/10 18.82/29.29 2.23±2.1551.5Δ*與LDM相比，P＜0.05，**與LDM相比P＜0.01；Δ與空白對照相比P＜0.05，ΔΔ與空白對照相比P＜0.01.
9、VH-LDP-AE與抗腫瘤藥物聯用對腫瘤細胞的增殖抑制作用用MTT法進行檢測。取對數生長期的人結腸癌HT-29細胞，用胰酶-EDTA進行消化後，按4000/井加入96井板，24小時後加入藥物。首先加入不同濃度的羥基喜樹鹼或5-氟尿嘧啶各20μl，8小時後加入不同濃度的VH-LDP-AE，然後繼續在37℃、5％CO2孵箱中培養72小時。加入2mg/ml MTT 50μl，於37℃繼續培養4小時。吸去上清，加入150μl二甲基亞碸，10分鐘後於570nm處測定吸光度值。腫瘤藥理中，藥物相互作用用藥物相互作用指數CDI進行評價，CDI值小於1表示存在協同作用，CDI值小於0.7表示存在非常顯著的協同作用。1μM羥基喜樹鹼和3ng/ml強化融合蛋白VH-LDP-AE聯用時，其CDI＜0.7，說明二者能協同抑制人結腸癌HT-29細胞的增殖(圖10)；5-氟尿嘧啶和VH-LDP-AE聯合應用，其中10μM5-氟尿嘧啶和3ng/ml強化融合蛋白對HT-29細胞增殖的CDI＜0.7，說明5-氟尿嘧啶和VH-LDP-AE聯用存在明顯的協同作用(圖11)。單抗藥物的應用常常與已知抗腫瘤藥物聯用，本結果表明，強化融合蛋白VH-LDP-AE與羥基喜樹鹼或5-氟尿嘧啶聯用存在明顯的協同作用。
發明效果本發明的優點與積極效果在於應用基因重組和分子重建相結合的方法，製備了抗IV型膠原酶單抗3G11的重鏈可變區單域抗體與抗腫瘤抗生素力達黴素的強化融合蛋白VH-LDP-AE，不僅保留了完整抗體對IV型膠原酶的結合和抑制活性，還具有強烈的腫瘤細胞殺傷活性，在體內實驗中也顯示了良好的抗腫瘤療效。它是迄今為止已報導分子量最小的具強烈抗腫瘤作用的單域抗體融合蛋白，在腫瘤靶向免疫治療藥物的小型化方面達到一個新水平，具有良好的應用前景。


圖1重組表達質粒pET-VH-LDP的限制性內切酶分析其中1-DNA分子量標準(DL15,000)2-質粒pET-30a(+)3-重組質粒pET-VH-LDP 4-pET-30a(+)/NdeI+XhoI5-pET-VH-LDP/NdeI+XhoI 6-pET-VH-LDP/NdeI+BamHI7-pET-VH-LDP/BamHI+XhoI 8-DNA分子量標準(DL2,000)圖2融合蛋白VH-LDP表達產物的SDS-PAGE(左)和Western Blot(右)分析其中1-低分子量蛋白標準2-BL21starTM(DE3)/pET-30a(+)菌株經IPTG誘導後的全菌蛋白3-重組菌株CAMS/HLDFP未經IPTG誘導的全菌蛋白4-重組菌株CAMS/HLDFP經IPTG誘導後的全菌蛋白5-重組菌株CAMS/HLDFP經IPTG誘導後的培養上清組分6-重組菌株CAMS/HLDFP經IPTG誘導後的細胞周質腔組分7-重組菌株CAMS/HLDFP經IPTG誘導後的可溶性細胞質組分8-重組菌株CAMS/HLDFP經IPTG誘導後的不可溶包涵體組分圖3融合蛋白VH-LDP經金屬螯合層析純化的SDS-PAGE分析其中1-低分子量蛋白標準2-全菌蛋白樣品3-上柱前樣品4-不與親和層析柱結合的雜蛋白5-6-經結合緩衝液洗滌下來的雜蛋白7-經洗滌緩衝液洗滌下來的雜蛋白8-9-經洗脫緩衝液洗脫下來的融合蛋白VH-LDP圖4融合蛋白VH-LDP對IV型膠原酶的免疫反應性其中○融和蛋白VH-LDP；▲抗IV型膠原酶單鏈抗體蛋白3G11-scFv圖5融合蛋白VH-LDP對人肝癌Bel-7402細胞的免疫反應性其中○融和蛋白VH-LDP；▲抗IV型膠原酶單鏈抗體蛋白3G11-scFv圖6融合蛋白VH-LDP對人口腔鱗癌KB細胞的免疫反應性其中○融和蛋白VH-LDP；▲抗IV型膠原酶單鏈抗體蛋白3G11-scFv圖7融合蛋白VH-LDP對人纖維肉瘤HT-1080細胞的明膠酶譜分析其中1-PBS 2-25μM VH-LDP融合蛋白3-50μM VH-LDP融合蛋白 4-100μM VH-LDP融合蛋白5-20μM 3G11-scFv
圖8強化融合蛋白VH-LDP-AE的製備其中▲280nm光吸收值■343nm光吸收值圖9強化融合蛋白VH-LDP-AE對小鼠肝癌22生長的抑制作用其中□對照組 ▲LDM組ΔVH-LDP-AE0.25mg/kg組×VH-LDP-AE 0.125mg/kg組+絲裂黴素1mg/kg組圖10強化融合蛋白VH-LDP-AE和羥基喜樹鹼聯用對HT-29細胞增殖作用的影響其中■羥基喜樹鹼●羥基喜樹鹼+VH-LDP-AE(1ng/ml)▲羥基喜樹鹼+VH-LDP-AE(3ng/ml)*CDI＜0.9；**CDI＜0.8；***CDI＜0.7圖11強化融合蛋白VH-LDP-AE和5-氟尿嘧啶聯用對HT-29細胞增殖作用的影響其中■5-氟尿嘧啶●5-氟尿嘧啶+VH-LDP-AE(1ng/ml)*CDI＜0.9；**CDI＜0.8；***CDI＜0.7
序列表110中國醫學科學院醫藥生物技術研究所120一種重鏈可變區單域抗體強化融合蛋白VH-LDP-AE16022101211732212DNA213人工序列220
223抗IV型膠原酶重鏈可變區基因和力達黴素輔基蛋白基因的重組融合序列4001atgcaggtga agctgcagca gtctggaact gaagtggtaa agcctggggc ttcagtgaag60ttgtcctgca aggcttctgg ctacatcttc acaagttatg atatagactg ggtgaggcag120acgcctgaac agggacttga gtggattgga tggatttttc ctggagaggg gagtactgaa180tacaatgaga agttcaaggg cagggccaca ctgagtgtag acaagtcctc cagcacagcc240tatatggagc tcactaggct gacatctgag gactctgctg tctatttctg tgctagaggg300gactactata ggcgctactt tgacttgtgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca360ggcggtggcg gatccgcgcc cgccttctcc gtcagtcccg cctcgggtct gagtgacgga420cagagcgtgt cggtgtcggt cagcggtgcc gccgccggcg agacctacta catcgcccag480tgcgctccgg tcggtggcca ggacgcgtgc aacccggcga ccgcgacgtc cttcaccacg540gacgcgtccg gagcggcgtc gttcagcttc gtcgtgcgca agtcgtacac gggctccacg600cccgaaggca cgccggtcgg cagcgtcgac tgcgccacgg ccgcctgtaa cctcggcgcc660ggcaactccg ggctcgacct cggccacgtg gctctgacct tcggcctcga gcaccaccac720caccaccact ga7322102211243213人工序列212PRT220
223抗IV型膠原酶重鏈可變區單域抗體和力達黴素輔基蛋白的融合序列
4002Met Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Val Val Lys Pro Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser20 25 30Tyr Asp Ile Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp35 40 45Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Asn Glu Lys50 55 60Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala65 70 75 80Tyr Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe85 90 95Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala115 120 125Phe Ser Val Ser Pro Ala Ser Gly Leu Ser Asp Gly Gln Ser Val Ser130 135 140Val Ser Val Ser Gly Ala Ala Ala Gly Glu Thr Tyr Tyr Ile Ala Gln145 150 155 160Cys Ala Pro Val Gly Gly Gln Asp Ala Cys Asn Pro Ala Thr Ala Thr165 170 175Ser Phe Thr Thr Asp Ala Ser Gly Ala Ala Ser Phe Ser Phe Val Val180 185 190Arg Lys Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Pro Glu Gly Thr Pro Val Gly Ser195 200 205Val Asp Cys Ala Thr Ala Ala Cys Asn Leu Gly Ala Gly Asn Ser Gly210 215 220Leu Asp Leu Gly His Val Ala Leu Thr Phe Gly Leu Glu His His His225 230 235 240His His His
權利要求
1.一種強化融合蛋白VH-LDP-AE，其特徵是所說VH-LDP-AE系由抗IV型膠原酶單抗3G11的重鏈可變區單域VH、力達黴素輔基蛋白LDP和力達黴素活性發色團AE組成，其分子量為26.2kD，融合蛋白VH-LDP的基因編碼序列為序列表中的序列1。
2.強化融合蛋白VH-LDP-AE的製備方法，其特徵是所說方法包括以下步驟a)抗IV型膠原酶抗體重鏈可變區單域VH基因和力達黴素輔基蛋白LDP基因的克隆及重組表達質粒pET-VH-LDP的構建；b)融合蛋白VH-LDP在大腸桿菌中的誘導表達；c)融合蛋白VH-LDP的純化及復性；d)融合蛋白VH-LDP的生物學活性測定；e)強化融合蛋白VH-LDP-AE的製備。
3.如權利要求2所述的製備方法，其特徵是運用基因工程技術分別克隆得到力達黴素輔基蛋白LDP基因和抗IV型膠原酶抗體重鏈可變區單域VH基因並將LDP基因亞克隆至大腸桿菌表達質粒pET-30a(+)，構建重組質粒pET-LDP；然後將VH基因連入pET-LDP中，構建融合基因重組表達質粒pET-VH-LDP。
4.如權利要求2所述的製備方法，其特徵是將pET-VH-LDP轉化入大腸桿菌宿主菌中，經IPTG誘導表達獲得包涵體形式的融合蛋白VH-LDP。
5.如權利要求2所述的製備方法，其特徵是通過親和層析純化融合蛋白VH-LDP，再通過分步透析復性、超濾濃縮製備活性融合蛋白VH-LDP。
6.如權利要求2所述的製備方法，其特徵是ELISA法檢測融合蛋白VH-LDP對IV型膠原酶和腫瘤細胞的免疫反應性，明膠酶譜法測定融合蛋白VH-LDP對人纖維肉瘤HT-1080細胞分泌IV型膠原酶活性的抑制作用。
7.如權利要求2所述的製備方法，其特徵是融合蛋白VH-LDP與經甲醇提取法製備的力達黴素活性發色團AE進行分子組裝，獲得強化融合蛋白VH-LDP-AE。
8.強化融合蛋白VH-LDP-AE在製備抗腫瘤導向藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種強化融合蛋白VH－LDP－AE，通過構建抗IV型膠原酶抗體重鏈可變區單域(VH)基因與力達黴素輔基蛋白(LDP)基因的融合基因並在大腸桿菌CAMS/HLDFP中高效表達製備活性融合蛋白VH－LDP，進一步將VH－LDP與力達黴素的活性發色團AE進行分子重建，得到強化融合蛋白VH－LDP－AE，它在體外具有強烈腫瘤細胞殺傷作用，在體內試驗對小鼠移植性肝癌22有非常顯著的療效，抑瘤率達到95.9％，是迄今已構建的最小的單域抗體強化融合蛋白，在腫瘤靶向性免疫治療藥物的小型化方面達到一個新水平，具有良好的應用前景。
文檔編號C07K16/44GK1569900SQ20041003405
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月23日 優先權日2004年4月23日
發明者苗慶芳, 陳淑珍, 甄永蘇, 尚伯楊, 劉小雲 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所