一種含融合蛋白a1d3r1的結核病亞單位疫苗的製作方法

2023-10-05 17:44:54 1

一種含融合蛋白a1d3r1的結核病亞單位疫苗的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種含融合蛋白A1D3R1的結核病亞單位疫苗。所述結核病亞單位疫苗，其特徵在於，含有融合蛋白A1D3R1，其濃度為0.1mg/ml至1mg/ml，所述融合蛋白A1D3R1其編碼基因為Rv3407、PhoY2、Ag85A、Rv2626c以及RpfB基因按照Rv3407-PhoY2-Ag85A-Rv2626c-RpfB的順序串聯。所述疫苗佐劑，其特徵在於，所述疫苗佐劑為油包水樣溶液，含有0.4mg/ml至0.6mg/ml的單磷醯脂質A、0.4mg/ml至0.6mg/ml的海藻糖、體積分數2％至8％的角鯊烯油，體積分數2％至8％的司盤85以及體積分數0.2至0.8的吐溫-80。本發明提供的疫苗及疫苗佐劑，免疫應答效果好，接種風險低。
【專利說明】一種含融合蛋白A1D3R1的結核病亞單位疫苗

【技術領域】
[0001]本發明屬於生物醫藥領域，更具體地，涉及一種含融合蛋白A1D3R1的結核病亞單位疫苗。

【背景技術】
[0002]作為目前全球範圍唯一預防結核病的疫苗，卡介苗(BCG)能夠有效的預防嬰幼兒粟粒樣結核病及結核性腦膜炎的發生；但是，對於預防成人肺結核病的發生、發展的效果有限。因此，急需發展一種合適的BCG初免後的增強疫苗，以提高其對成人結核病的預防效果O
[0003]除此而外，BCG不適用於免疫力低下的人群，如HIV感染等免疫缺陷人群接種BCG後，反而引起死亡率的升高；BCG初免後，再次注射，增強免疫的效果有限，臨床上推薦僅免疫一次。因此，結核病亞單位疫苗因為成分明確、安全穩定，便於生產，在結核病疫苗研製上受到廣泛重視。但是，目前已知的結核病亞單位疫苗仍然存在免疫應答效果不理想的問題。


【發明內容】

[0004]針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本發明提供了一種含融合蛋白A1D3R1的結核病亞單位疫苗，其目的在於通過選擇抗原基因和融合順序製造出融合蛋白，配合本發明提供的疫苗佐劑，由此解決現有的結核病疫苗，有接種風險，免疫應答效果不理想的技術問題。
[0005]為實現上述目的，按照本發明的一個方面，提供了一種結核病亞單位疫苗，含有融合蛋白A1D3R1，其濃度為0.lmg/ml至lmg/ml，所述融合蛋白A1D3R1其編碼基因為Rv3407、PhoY2、Ag85A、Rv2626c 以及 RpfB 基因按照 Rv3407-PhoY2_Ag85A-Rv2626c-RpfB 的順序串聯。
[0006]優選地，所述結核病亞單位疫苗，其融合蛋白A1D3R1的序列為:
[0007](I)由SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；或
[0008](2)與序列SEQ ID N0.1限定的胺基酸序列同源性在80%至100%編碼相同功能蛋白質的胺基酸序列；或
[0009](3) SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列經增加、缺失或替換一個或多個胺基酸具有同等活性的由(I)衍生的蛋白。
[0010]優選地,所述結核病亞單位疫苗,還含有0.2mg/ml至0.3mg/ml的單磷醯脂質A、0.2mg/ml至0.3mg/ml的海藻糖、體積分數1%至4%的角S烯油、體積分數1%至4%的司盤85以及體積分數0.1%至0.4%的吐溫-80，所述結核病亞單位疫苗為油包水樣溶液。
[0011]優選地，所述結核病亞單位疫苗，其所述海藻糖為6，6』 - 二分枝菌酸。
[0012]按照本發明的另一方面，提供了一種疫苗佐劑，所述疫苗佐劑為油包水樣溶液，含有0.4mg/ml至0.6mg/ml的單磷醯脂質A、0.4mg/ml至0.6mg/ml的海藻糖、體積分數2%至8 %的角鯊烯油，體積分數2 %至8 %的司盤85以及體積分數0.2 %至0.8 %的吐溫-80。
[0013]優選地，所述疫苗佐劑，其所述海藻糖為6，6』 - 二分枝菌酸。
[0014]總體而言，通過本發明所構思的以上技術方案與現有技術相比，能夠取得下列有益效果:
[0015]1.細胞免疫是抗結核病的重要組成，其中⑶4+Thl型細胞免疫應答作用尤為重要。本發明中以融合蛋白A1D3R1刺激人群產生的IFN-Y水平較個亞組分蛋白單獨刺激後產生水平顯著提高，且在感染人群中水平顯著高於未感染人群，證實本發明提供的結核病亞單位疫苗所使用的融合蛋白A1D3R1是一種良好的Thl型抗原，具有良好的免疫應答效果;
[0016]2.本發明提供的亞單位疫苗，其產生免疫應答效果的融合蛋白A1D3R1，不存在致病的能力，因此相對於現有的結核病疫苗，本發明提供的亞單位疫苗接種風險大大降低。
[0017]3.本發明提供的免疫佐劑能誘導產生明顯的以IFN-Y和TNF-α為主的Thl型細胞免疫應答，增強疫苗效果；同時，所包含的單磷醯脂質Α、海藻糖為6，6』-二分枝菌酸以及角鯊烯等組成成分已應用於人體，安全性高，價格低廉且製備簡便。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是實施例2融合蛋白A1D3R1及各亞組分蛋白純化產物的Western-blotting鑑定;
[0019]圖2是實施例9比較融合蛋白A1D3R1及亞組分蛋白分別刺激M.tb感染人群(rCM-ffBIA-positive)和 M.tb 未感染人群(rCM-WBIA-negative)產生的 IFN-Y 水平；
[0020]圖3是實施例10亞單位疫苗A1D3R1/MT0免疫小鼠血清中特異性抗體水平；
[0021]圖4是實施例10亞單位疫苗A1D3R1/MT0免疫小鼠脾細胞分泌A1D3R1特異性細胞因子TNF- α和IFN- Y的水平；
[0022]圖5是實施例10亞單位疫苗A1D3R1/MT0免疫小鼠脾臟抗原特異性總IFN- Y分泌型T淋巴細胞；
[0023]圖6是實施例11亞單位疫苗A1D3R1/MT0免疫小鼠抗M.tb H37Rv標準毒株經尾靜脈感染後臟器荷菌量；
[0024]圖7是實施例11M.tb H37Rv感染小鼠肺臟病理圖。

【具體實施方式】
[0025]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。此外，下面所描述的本發明各個實施方式中所涉及到的技術特徵只要彼此之間未構成衝突就可以相互組合。
[0026]本發明提供的結核病亞單位疫苗，其特徵在於，含有融合蛋白A1D3R1，其濃度為
0.lmg/ml 至 lmg/ml,還含有 0.2mg/ml 至 0.3mg/ml 的單磷醯脂質 A、0.2mg/ml 至 0.3mg/ml的海藻糖、體積分數2%至8%的角鯊烯油、體積分數2%至8%的司盤85 (Span 85)以及體積分數0.2%至0.8%的吐溫-80，為油包水樣溶液。所述融合蛋白A1D3R1其編碼基因為Rv3407、PhoY2、Ag85A、Rv2626c 以及 RpfB 基因按照 Rv3407-PhoY2_Ag85A-Rv2626c-RpfB 的順序串聯。所述海藻糖為人工合成的6，6』 - 二分枝菌酸。
[0027]所述融合蛋白A1D3R1的序列為:
[0028](I)由SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；或
[0029](2)與序列SEQ ID N0.1限定的胺基酸序列同源性在80%至100%編碼相同功能蛋白質的胺基酸序列；或
[0030](3) SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列經增加、缺失或替換一個或多個胺基酸具有同等活性的由(I)衍生的蛋白。
[0031]本發明提供的疫苗佐劑，命名為ΜΤ0，所述疫苗佐劑為油包水樣溶液，含有0.4mg/ml至0.6mg/ml的單磷醯脂質A、0.4mg/ml至0.6mg/ml的海藻糖、體積分數2 %至8 %的角鯊烯油、體積分數2%至8%的司盤85(Span 85)以及體積分數0.2%至0.8%的吐溫-80 (Tween-80)。所述海藻糖為人工合成的6，6』 - 二分枝菌酸。
[0032]M.tb在感染人體過程中可分為原發感染、潛伏感染和原發後感染等不同階段，其代謝和轉錄表達的基因譜亦具有階段特異性。M.tb經呼吸道原發感染機體後，可抑制吞噬體成熟及自曬(autophagy)、凋亡(apoptosis),以逃避機體抗感染的固有免疫應答；同時阻止DC細胞移行到局部淋巴結進行抗原提呈，從而延緩適應性免疫應答(主要是⑶4+Thl細胞免疫應答)，使M.tb在體內大量複製並建立原發感染。原發感染階段，體內M.tb表達的代表基因為VII型分泌系統(ESX-1)和Ag85複合物等。DC細胞一旦到達局部淋巴結，即可致敏⑶4+Thl細胞並使其歸巢到感染病灶，通過分泌IFN-Y等細胞因子活化巨噬細胞併吞噬殺傷細菌，同時募集更多的巨噬細胞浸潤在感染部位形成肉芽腫，形成潛伏感染。體外模擬潛伏感染的厭氧狀態，揭示M.tb在潛伏階段由休眠調節基因DosR調控，編碼並表達48個基因，包括HspX、Rv2623和Rv2626c等。另外，有一些基因參與潛伏感染階段的M.tb代謝的調控，如PhoY2、Rv3407和Rv2660等。在免疫力下降(特別是合併感染HIV)、年老、糖尿病、器官移植、營養缺陷和使用免疫抑制劑等情況，LTBI體內處於潛伏狀態的細菌可能再次激活，形成內源性感染，進而發展為活動性TB患者。在此階段，M.tb的Rpf基因和Rip A是參與再激活的重要因素。特別重要的是，BCG免疫後對M.tb潛伏感染階段的特徵性抗原弱或無應答。這也是造成BCG對潛伏感染和成人TB保護性差的重要原因之一。但是，究竟這些不同階段性特徵性表達的蛋白中，尚不清楚哪些是重要的保護性抗原，適宜用於TB疫苗的發展。
[0033]因此，我們首先原核表達純化了 M.tb階段性表達的一系列抗原，從這些抗原中，經全血幹擾素釋放分析技術(WBIA)，篩選能夠被中國M.tb感染人群的T細胞識別的抗原。由於中國人群99%以上均被BCG免疫接種過，BCG免疫會影響全血幹擾素釋放分析的結果。我們前期研究中建立了一種基於M.tb特有的RD2區蛋白CFP21和MPT64的全血幹擾素釋放分析技術檢測方法(rCM-WBIA)，由於RD2區在BCG中國株中缺失，其特異性不受BCG中國株對中國人群免疫的影響。基於對健康未感染人群、結核感染人群(包括潛伏感染人群和結核病患者)兩種人群的臨床診斷結果，聯合rCM-WBIA檢查技術，可以排除BCG免疫對兩種人群的影響。採集M.tb感染人群和未感染人群的外周全血,通過WBIA試驗檢測和比較M.tb不同階段性抗原刺激兩種人群外周血後產生的IFN-Y水平。本發明中篩選出M.tb感染機體後在不同階段表達的特異性靶抗原，包括有快速增殖期分泌抗原Ag85A，潛伏期相關抗原Rv2626c、PhoY2、Rv3407以及復甦相關抗原RpfB，均能誘導感染人群產生高水平的IFN-Y，均能被中國M.tb感染人群的T細胞所識別，是可靶向預防中國M.tb感染人群的有效候選抗原。我們篩選出的這些抗原，部分已被以前的研究所證實，如:Ag85A是來自於Ag85複合體的一個分子量為32kDa的中分子量蛋白，M.tb、BCG以及其它分枝桿菌中均存在該蛋白，在分枝桿菌細胞壁結構形成過程中發揮重要作用，同時具有較強的免疫原性。以Ag85A為革巴抗原構建的已進入臨床試驗的腺病毒、痘病毒等不同載體的疫苗中，均證實Ag85A能夠在人體誘導強烈的細胞免疫及體液免疫水平，並能夠為免疫動物提供顯著的抗M.tb感染的保護效果。儘管Rv3407存在於BCG的基因組中，但是體外培養時的表達量極低，其功能可能與M.tb潛伏感染的代謝調節相關。Mollenkopf通過BCG初免-DNA疫苗增強免疫證實Rv3407能夠誘導小鼠產生高水平的特異性IFN- Y，並增強了 BCG誘導的保護效果。通過缺氧及低濃度NO誘導M.tb進入潛伏狀態，導致48個基因表達上調，並受DosR控制，因而DosR被認為與M.tb的潛伏狀態相關。Rv2626c屬於DosR調控的基因之一。通過動物模型及不同人群試驗均證實了 DosR編碼蛋白的免疫原性及其在潛伏感染中的重要調節作用；另外在潛伏感染人群中證實了 DosR部分上調基因產物能誘導機體產生高水平的特異性 T 細胞反應。復甦促進因子(resuscitat1n-promoting factor, rpf)是在 MicrococcusIuteus發現的可能與細菌再激活相關的基因，而RpfA-E是在M.tb中證實與其同源的五個基因。通過在M.tb感染模型以及BCG免疫模型試驗發現RpfB和RpfD是其中抗原性最強的兩個抗原；攜帶有RpfB的DNA疫苗經小鼠模型驗證其免疫原性及保護性，結果顯示疫苗能誘導產生明顯的細胞免疫，但是其抗結核病保護效果仍弱於BCG。PhoY2，作為E.coli PhoU的同源性基因，在M.tb感染後的長期飢餓模型中出現高表達；而抑制PhoY2的表達後，體內靜止狀態的持留菌能夠再度活躍，因此，PhoY2被認為與持留菌在體內的存活有關。通過我們研究發現，PhoY2也是一個重要的抗原。
[0034]在本發明中，我們以篩選出的這些抗原為基礎，通過人工設計方法構建了表達上述抗原的融合蛋白A1D3R1，並經全血幹擾素釋放分析技術證實了中國M.tb感染人群的T細胞能夠識別該融合蛋白，其外周血產生A1D3R1特異性的IFN-Y水平，顯著高於未感染人群，預示了該融合蛋白具有靶向預防M.tb感染的能力。
[0035]單獨的蛋白免疫被證實並不能誘導產生足夠的免疫應答，亞單位蛋白疫苗必須聯合一種乃至幾種佐劑成分來提高其免疫原性，不僅能節約抗原劑量，還可以靶向誘導抗原特異性T細胞亞群(Thl，Th2或Thl7等)，從而獲得理想的保護性。因此需要尋求一種能誘導產生強烈Thl型反應的佐劑。目前目前常用的佐劑形式有:鋁鹽、油包水乳狀液、免疫刺激複合體以及TLR配體等，其中鋁製劑、MF59、AS03、AS04以及脂質體是五種已獲認可應用於臨床的佐劑；此外尚有其它多種佐劑已在動物體內證實其安全性及有效性。可誘導Thl型細胞免疫應答的佐劑組分如單磷酯脂質A (MPL)是典型的TLR-4激動劑，為GSK公司3種複合型佐劑AS01、AS02和AS04的有效成分。其中ASOl為脂質體形式；AS02為油包水形式，作為M.tb亞單位疫苗M72的佐劑已進入臨床試驗2期；AS04為鋁鹽形式，已批准用於人類抗HBV和HPV的疫苗中。TDB是M.tb索狀因子成分海藻糖6，6』- 二分枝菌酸(TDM)的人工合成物，其受體為C型凝集素(Mincle),是已進入臨床I期的亞單位疫苗Hybrid-1中佐劑CAFOl的重要成分，能夠誘導Thl、Th2、Thl7細胞以及抗體的生成。此外，以角鯊烯為主的油包水形式佐劑MF59佐劑可誘導體液免疫應答，提高佐劑的整體穩定性及促進抗原被DCs處理和提呈，已被批准用於商品化流感疫苗的佐劑成分。
[0036]本發明中聯合MPL、TDB和MF59的有效成份，製成新型油包水佐劑MT0，輔助構建亞單位疫苗A1D3R1/MT0以誘導強烈的Thl型反應及免疫保護性。經小鼠感染模型，證實亞單位疫苗A1D3R1/MT0能產生優於PBS組和單獨MTO佐劑組的抗M.tb急性感染的保護效應。而且，疫苗誘導的保護效應與免疫小鼠體內誘導產生的抗原性特異性CD4+Thl型反應密切相關。
[0037]以下為實施例:
[0038]實施例1融合基因及引物的設計和合成
[0039]通過NCBI網站獲取Rv3407、PhoY2、Ag85A、Rv2626c以及RpfB基因的序列，使用DNAman軟體分析各序列酶切位點，對於特定位點進行同源突變，以保證蛋白質轉錄翻譯過程的正確性。序列拼接原則包括:1)若有信號肽的要去除信號肽，包括原來的起始密碼子，同時去除終止密碼子，拼接完畢的最後一個基因序列後加TAA ;2)無信號肽的基因序列則保留起始密碼子序列。若起始密碼子為GTG的，因其原始表達產物為Met而非Val，應將GTG作為非起始碼時必須也表達為Met，故需將GTG校正為ATG。按照Rv3407-PhoY2-Ag85A-Rv2626c-RpfB的順序將比對完成的序列串聯並命名為A1D3R1序列。
[0040]該融合序列由上海英駿生物公司合成並構建於pDC316質粒，經測序比對無誤。測序結果件序列表SEQ ID N0.2，其胺基酸序列見序列表SEQ ID N0.1。
[0041]實施例2融合蛋白原核表達載體的構建及蛋白純化
[0042]1、目的基因獲取:
[0043]根據融合基因的全序列及原核表達載體pET30b(+)上的多克隆位點設計引物，弓丨物序列由上海英駿生物公司合成，並按照說明將引物稀釋成lOOpmol/μ 1，_20°C保存備用。下述引物序列中的下劃線表示酶識別位點。
[0044]A1D3R1-Fwd: (Nde I)-TTCCATATGCGTGCTACCGTTGGGCTTGTGGAGG
[0045]A1D3R1-Rev: (Xho I)-ATCCTCGAGGCGCGCACCCGCTCGTGCAGCAC
[0046]以合成基因為模板，建立PCR反應體系，並進行PCR擴增。PCR反應體系如下:
[0047]

【權利要求】
1.一種結核病亞單位疫苗，其特徵在於，含有融合蛋白A1D3R1，其濃度為0.lmg/ml至lmg/ml，所述融合蛋白A1D3R1其編碼基因為Rv3407、PhoY2、Ag85A、Rv2626c以及RpfB基因按照 Rv3407-PhoY2-Ag85A-Rv2626c-RpfB 的順序串聯。
2.如權利要求1所述的結核病亞單位疫苗，其特徵在於，所述融合蛋白A1D3R1的序列為: (1)由SEQID N0.1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；或 (2)與序列SEQID N0.1限定的胺基酸序列同源性在80%至100%編碼相同功能蛋白質的胺基酸序列；或 (3)SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列經增加、缺失或替換一個或多個胺基酸具有同等活性的由(I)衍生的蛋白。
3.如權利要求1或2所述的結核病亞單位疫苗，其特徵在於，還含有0.2mg/ml至0.3mg/ml的單磷醯脂質A、0.2mg/ml至0.3mg/ml的海藻糖、體積分數I %至4%的角S烯油、體積分數1%至4%的司盤85以及體積分數0.1%至0.4%的吐溫-80,所述結核病亞單位疫苗為油包水樣溶液。
4.如權利要求3所述的結核病亞單位疫苗，其特徵在於，所述海藻糖為6，6』- 二分枝菌酸。
5.一種疫苗佐劑，其特徵在於，所述疫苗佐劑為油包水樣溶液，含有0.4mg/ml至0.6mg/ml的單磷醯脂質A、0.4mg/ml至0.6mg/ml的海藻糖、體積分數2%至8%的角S烯油，體積分數2%至8%的司盤85以及體積分數0.2%至0.8%的吐溫-80。
6.如權利要求5所述的疫苗佐劑，其特徵在於，所述海藻糖為6，6』- 二分枝菌酸。
【文檔編號】A61K39/04GK104174016SQ201410421621
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月25日 優先權日:2014年8月25日
【發明者】範雄林, 譚昆 申請人:華中科技大學