源於藍細菌的耐鹽性SyGT基因及其用途的製作方法

2023-10-05 18:49:44

專利名稱：源於藍細菌的耐鹽性SyGT基因及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及源於藍細菌的集胞藻屬葡糖基轉移酶(Synechocystis glucosyltransferase, SyGT)基因、將所述基因在植物體中過表達,從而增加植物體耐鹽性的方法，以及由所述方法製備的耐鹽性得到增加的植物體及其種子。
背景技術：
包含藍細菌的藻類被開發為有效遺傳資源、生物能源(紅藻類乙醇及海藻類生化柴油)及有效的生物材料(紅藻類漿料)。最近，通過應用海藻類生物工程拓寬了海藻類的應用性，正在進行有關海藻類方面的研究。例如利用分子育種的新產品開發、作為醫藥或者工業上重要的有效蛋白質或有效物質生產的生物反應器。最近報導有很多在藍藻類中發現的基因，成功應用於農作物的研究結果。源於藍細菌的基因具有能顯著增加脅迫抗性的功能，例如耐鹽性等，還發現若將其導入至植物時具有能增加植物的生產率等效果。這些意味著將源於藍細菌的有效基因導入植物體內，不僅能改良植物體特性，還能提高生產能力、且有效物質的生產及其實用化的可能性顯著提高。例如有以下報導，集胞藻屬(Synechocystis) sp.PCC6906的組氨酸激酶(histidine kinases)和同源反應調節器(cognate response regulators)能調節高滲脅迫(hyperosmotic stress)及鹽誘導性基因(salt-1nducible gene)的表達。集胞藻屬PCC6906與淡水種類不同，其是一種棲息於海洋，適應了海洋環境的種，被認為有可能具有發達的應對鹽脅迫(salt stress)的敏感性(sensitivity)或抵抗性(sensitivity)機制，因此推測它擁有很多與鹽脅迫調節及抵抗性相關的基因。為了栽培農作物而進行灌溉後，耕地內的鈉、鈣、鎂、鉀、硫酸鹽、氯等水溶性鹽的濃度會增加。這些鹽在土壤中蓄積至一定水平以上時，會損害農作物通過根部吸收水分的功能，從而使植物細胞無法進行正常的代謝活動。鹽的濃度越高，植物吸收的水分量越少，不僅會導致農作物的生產量減少，甚至還可能弓I起農作物的死亡。灌溉田的農作物產量是普通農田的3倍以上，且目前的情況為灌溉田的比率逐漸增加。因此持續性的使用灌溉用水，會引起土壤鹽分濃度的增加，農作物生產率顯著降低，種子使用量及施肥量也隨之增加。由於只能耕作流動性不高、具有高耐鹽性的農作物，因此導致其經濟性降低，並且鹽分引起的土壤腐蝕嚴重的灌溉田有機化，導致糧食資源的枯竭、而農作物生產率的降低，也同時導致勞動力的浪費。這些由於鹽分引起的損害，是嚴重製約農作物生產能力的主要原因之一，屬於農業領域不好解決的難題。據美國農業部(U.S.Dept, of Agriculture)的報告，由每年灌溉(irrigation)引起的鹽化作用，導致全世界1，000萬公頃面積農田消失。為解決農田鹽化的問題，許多科學家通過例如雜交的品種改良方法，試圖開發出耐鹽性農作物，但未取得顯著成果。因此，需要開發出一種能夠誘導重要植/農作物耐鹽性的新型、革新性的技術。很多科學家正在進行通過將外 源基因轉化至植/農作物，從而提高耐鹽性的研究。

發明內容
本發明要解決的技術問題本發明是依據上述要求提出的。本發明中分離源於藍細菌的SyGT基因，並確認將其在植物體中過表達時植物體耐鹽性會增加，從而完成了本發明。技術方案為了解決上述問題，本發明提供源於藍細菌PCC6906的SyGT蛋白質。並且，本發明提供編碼SyGT蛋白質的基因。並且，本發明提供包含SyGT基因的重組載體。並且，本發明提供用上述重組載體轉化的宿主細胞。並且，本發明提供一種增加植物體耐鹽性的方法，上述方法包括以下步驟:利用上述重組載體轉化植物細胞，使SyGT基因過表達。並且，本發明提供由上述方法製備的耐鹽性得到增加的轉化植物體及其種子。並且，本發明提供用於增加植物體耐鹽性的組合物，其包含SyGT基因。並且，本發明提供用於擴增SyGT基因的引物集。有益效果根據本發明的內容 ，通過將本發明的SyGT基因在植物體中過表達，能夠增加植物體的耐鹽性。上述耐鹽性得到增加的轉化植物，尤其在開墾地及山間坡地較多的韓國，其應用可能性非常高。


圖1為SyGT基因的喊基序列。圖2為SyGT基因的胺基酸序列。圖3表示多種藍細菌間的SyGT基因胺基酸序列的親緣關係(relationship) (A)及同源關係(B)。圖4是用於本發明的轉化載體。圖5不出了為篩選SyGT轉化菸草的PCR (A)及DNA印跡(southern blotting)(B)分析的結果圖片。圖6示出了 SyGT轉化擬南芥基因表達程度的實時定量PCR (Real-time PCR) (A)及耐鹽性(B =NaCl處理後的葉綠素含量)結果。圖7示出了為篩選SyGT轉化浮萍的PCR (A)及耐鹽性(B:轉化浮萍在含有IOOmMNaCl的培養基中生存及分化結果圖片。圖8示出了為篩選SyGT轉化白楊的PCR (A)及基因表達程度的實時定量PCR (B)結果。圖9為表示SyGT轉化白楊的耐鹽性結果(A C)及葉綠素含量變化(D)的圖片。A =SyGT基因轉化白楊在包含NaCl的培養基中的耐鹽性；B:SyGT基因轉化白楊在包含NaCl的新梢(shoot)再生培養基中的新梢再生結果；C:用450mM NaCl溶液處理24小時後，SyGT基因轉化白楊的耐鹽性(C-1)及Fv/Fm值變化(C-2) ；D:SyGT基因轉化白楊葉綠素含量的變化。
具體實施例方式為了實現本發明的目的，本發明提供源於藍細菌PCC6906的SyGT蛋白質，其由SEQID N0.2胺基酸序列構成。本發明的SyGT蛋白質範圍包含從藍細菌PCC6906分離，具有SEQ ID N0.2所示胺基酸序列的蛋白質及上述蛋白質的功能等同物。「功能等同物」是指由胺基酸的添加、取代或者缺失的結果，與上述SEQ ID N0.2所示胺基酸序列至少有70%以上的序列同源性，優選80%以上，更優選90%以上，最優選95%以上，且具有與SEQ ID N0.2所示蛋白質類似功能特性的蛋白質。並且，本發明提供編碼上述SyGT蛋白質的基因。本發明的基因包括編碼SyGT蛋白質的基因組DNA和cDNA。更優選地，本發明的基因可包含SEQ ID N0.1所表示的鹼基序列。並且，上述鹼基序列的變異體也包含在本發明的範圍內。更確切地說，上述基因可包含與SEQ ID N0.1的鹼基序列具有70%以上序列同源性的鹼基序列，優選80%以上，更優選為90%以上，最優選95%以上。 對於多聚核苷酸「序列同源性的％」是通過比較兩個以最優方式排列的序列和比較區域得以確認。比較區域中的部分多聚核苷酸序列與對於兩個序列的最優排列的參考序列(不包括添加或者刪除)相比，可包含添加或者刪除(即間隙(gap))。並且，本發明提供包含本發明的SyGT基因的重組載體。上述重組載體優選重組植物表達載體。更優選地，可為具有圖4所記載酶切圖的轉化載體。術語「重組」是指細胞複製異種核酸或表達上述核酸或表達由肽、異種肽或者異種核酸編碼的蛋白質的細胞。重組細胞能將在上述細胞的天然形態中不被發現的基因或者基因片段表達為正義引物或者反義引物形態中的一個。另外，重組細胞可表達從天然狀態的細胞中發現的基因，但上述基因是發生變形的，是通過人為手段再導入至細胞內的基因。術語「載體」是在表示向細胞內傳遞的DNA片段、核酸分子時使用。載體能夠複製DNA，並在宿主細胞中單獨再生產。術語「傳遞體」通常與「載體」互換使用。術語「表達載體」是指包括適當的核酸序列的重組DNA分子。所述適當的核酸序列為表達目標編碼序列、以及在特定宿主生物中表達可操作地連接的編碼序列所必需的核酸序列。本發明的載體可構建成典型的克隆或者表達的載體。並且，本發明中的載體可以原核細胞或真核細胞為宿主構建。例如，本發明的載體是表達載體，以原核細胞作為宿主時，一般包含能使其執行轉錄的強力啟動子(例如，pLA啟動子、trp啟動子、Iac啟動子、T7啟動子、tac啟動子等)，為翻譯起始的核糖體結合位點以及轉錄/翻譯終止序列。大腸桿菌(E.coli)作為宿主細胞時，E.coli色氨酸生物合成途徑的啟動子及操縱位點，還有入噬菌體的左向啟動子(pL λ啟動子)可被用作調節部位。此外，本發明可使用的載體可通過對本領域通常使用的質粒(例:pSC101、ColEl、pBR322、pUC8/9、pHC79、pGEX 系列、pET 系列及 pUC19 等)，噬菌體(例:λ gt4.λ B，λ -Charon，λ Λ ζ 及Μ13等)或者病毒(例:SV40等)進行操作製得。此外，本發明的載體為表達載體，以真核細胞作為宿主時,可以利用源於哺乳動物細胞基因組的啟動子(例:金屬硫蛋白啟動子)或者源於哺乳動物病毒的啟動子(例:腺病毒晚期啟動子、痘苗病毒7.5K啟動子、SV40啟動子、巨細胞病毒啟動子及HSV的tk啟動子)，且作為轉錄終止序列一般包含多聚腺苷酸化序列。依據本發明的一個具體例的植物表達載體中，啟動子可為CaMV35S、肌動蛋白、泛素、pEMU、組蛋白啟動子、源於水稻Clp啟動子。術語「啟動子」是指結構基因中DNA的上遊區域，是RNA聚合酶為了啟動轉錄而結合的DNA分子。「植物啟動子」是指能在植物細胞中啟動轉錄的啟動子。「組成型(constitutive)啟動子」是指在大部分的環境條件及生長狀態或者細胞分化條件下具有活性的啟動子。作為終止子，可採用通常使用的終止子，例如胭脂鹼合酶(N0S)、水稻α-澱粉酶RamylA終止子、菜豆鹼(phaseoline)終止子、根癌土壤桿菌的章魚鹼(Octopine)基因終止子、大腸桿菌rrnBl/B2終止子等。本發明的載體可包含本領域通常使用的抗生素抗性基因作為選擇性標記，例如有對於氨苄西林、慶大黴素、羧苄西林、氯黴素、鏈黴素、卡那黴素、遺傳黴素、新黴素、凱福隆及四環素的抗性基因。並且，本發明還提供利用本發明的重組載體轉化的宿主細胞。在本發明中可穩定、連續地克隆及表達載體的宿主細胞，可選用本領域公知的任何宿主細胞，例如E.CO I iJM109、E.coli BL2UE.coli RR1、E.coli LE392、E.coli Β、Ε.coli Χ1776、Ε.coli W3110、枯草芽孢桿菌、蘇雲金芽孢桿菌等病毒屬菌株，還有鼠傷寒沙門氏菌，粘質沙雷氏菌及多種假單胞菌等腸桿菌科菌株等。並且,將本發明的載體轉化至真核細胞時，可選用例如釀酒酵母(Saccharomycecerevisiae)、昆蟲細胞、人細胞(例如，CHO細胞系(中國倉鼠卵巢細胞)、W138、BHK、C0S-7、293、H印G2、3T3、RIN及MDCK細胞系)及植物細胞等作為宿主細胞。宿主細胞為原核細胞時，可通過CaC12方法(Cohen, S.N.et al., Proc.Natl.Acac.Sc1.USA,9:2110-2114 (1973)(科恩，S.N.等人，美國國家科學院院刊 USA，9:2110-2114 (1973)))、哈拿汗(Hanahan)方法(Hanahan，D.，J.Mol.Biol.,166:557-580(1983) (Hanahan,D.， 分子生物學雜誌，166:557-580 (1983)))及電穿孔法(Dower，W.J.etal.Nucleic.Acids Res.，16:6127-6145 (1988) (Dower,ff.J.等人核酸研究，16:6127-6145(1988)))等方法，將本發明的載體轉運至宿主細胞內。宿主細胞為真核細胞時，可通過顯微注射法(Capecchi，M.R.,Cell, 22:479 (1980) (Capecchi，M.R.，細胞，22:479 (1980)))、磷酸隹丐沉澱法(Graham, F.L.et al., Virology, 52:456 (1973) (Graham, F.L.等人，病毒學，52:456 (1973)))、電穿孔法(Neumann，E.et al.，EMBO J.,1:841 (1982)(諾依曼，E.等人，歐洲分子生物學雜誌，1:841 (1982)))、脂質體介導轉染法(Wong，T.K.et al.，Gene,10:87 (1980) (ffong,T.K.等人，基因，10:87 (1980)))、DEAE_ 葡聚糖轉染法(Gopal，Mol.Cell Biol.,5:1188-1190 (1985)(戈帕爾，分子與細胞生物學，5:1188-1190 (1985)))及基因槍轟擊法(Yang et al., Proc.Natl.Acad.Sc1., 87:9568-9572 (1990) (Yang 等人，美國國家科學院院刊，87:9568-9572 (1990)))等方法，將載體注入至宿主細胞內。並且，本發明還提供增加植物體耐鹽性的方法，所述方法包括以下步驟:利用本發明的重組載體轉化植物細胞，使SyGT基因過表達。植物的轉化是指將DNA轉移至植物的任意方法。這些轉化方法不一定需要經過再生及(或者)組織培養期。目前，植物種的轉化不僅對於雙子葉植物，包括單子葉植物量子的植物種也非常普遍。原則上，任意的轉化方法均可被用於將依據本發明的雜合DNA導入到祖細胞中。所述方法可選自對於原生質體的鈣/聚乙二醇方法(Krens，F.A.et al.，1982，Nature296, 72-74 ；Negrutiu 1.et al., Junel987, Plant Mol.Biol.8,363-373 (Krens,F.A.等人.，1982，自然296,72-74 ;Negrutiu 1.等人.，1987年6月，植物分子生物學8，363-373))、原生質體的電穿孔法(Shillito R.D.et al.，1985Bio/Technol.3，1099-1102(Shillito R.D.等人.，1985生物/技術3，1099-1102))、作為植物元素的顯微注射法(Crossway A.et al.，1986，Mol.Gen.Genet.202，179-185(克洛斯威Α.等人.，1986，分子遺傳學和基因組202，179-185))、各種植物元素的(DNA或者RNA-塗布的)微粒轟擊法(KleinT.M.et al., 1987,Nature327, 70 (Klein T.M.等人.，1987，自然 327，70))、依據植物的浸潤或者成熟花粉或者小孢子轉化的，根癌土壤桿菌介導的基因轉移(非完整性)中依據病毒的感染(EP0301316號)等。本發明的優選方法包含土壤桿菌介導的DNA轉移。更為優選的是利用EPA120516號及美國專利第4，940，838號所記載的所謂雙元載體技術的方法。本發明的轉化可由根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefiaciens)介導。並且,本發明的方法包含從上述轉化植物細胞再分化轉化植物的步驟。從轉化植物細胞再分化轉化植物的方法，可採用本領域公知的任意方法。為實現本發明的另一目的，本發明提供由本發明的方法製備的耐鹽性得到增加的轉化植物體。更具體地說，本發明的耐鹽性植物體可通過以下方法獲得。用包含SyGT基因的重組載體轉化植物體後，利用通常採用的方法經過新梢的誘導、生根及土壤馴化的過程獲得。即，將用包含SyGT基因的重組載體轉化的植物外植體接種於本領域公知的適當的培養基中，在適當條件下培養，誘導新梢的形成，新梢形成後將其轉至未添加激素的培養基中繼續培養。約2周後將上述新梢轉至生根用培養基，誘導根部的生成。誘導生根後將其移植到土壤，進行馴化從而可獲得耐鹽性植物體。本發明還提供耐鹽性得到增加的植物體種子。

本發明還提供用本發明中的載體進行轉化，耐鹽性得到增加的轉化植物體。本發明的一個具體例的方法中，上述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。上述單子葉植物包含例如水稻、小麥、大麥、竹筍、玉米、芋、蘆筍、洋蔥、蒜、蔥、韭菜、山蒜、山藥、生薑及浮萍，但不局限於此。雙子葉植物包含例如菸草、擬南芥、茄子、辣椒、番茄、馬鈴薯、牛蒡、茼蒿、生菜、桔梗、菠菜、葉用甜菜、紅薯、療菜、胡蘿蔔、水歐療、歐療、白菜、捲心菜、芥菜、蘿蔔、西瓜、甜瓜、黃瓜、南瓜、瓠瓜、草莓、大豆、綠豆、四季豆、豌豆及白楊等，但不局限於此。優選菸草、擬南芥、白楊或者浮萍。本發明還提供用於增加植物體耐鹽性的組合物，其包含SyGT基因。本發明的組合物包含SyGT作為有效成分，將上述SyGT基因導入到植物體內表達，能使植物體耐鹽性增力口。更有選地，上述SyGT基因可由SEQ ID N0.1的鹼基序列構成。並且，上述SyGT基因可包含SyGT基因序列中發生特定喊基序列的插入、取代、缺失的序列。本發明中的「耐鹽性」是指為了生長在滲透脅迫，或者水和土壤中鹽類或離子引起的脅迫下的某些植物的能力。具有耐鹽性的植物是指:使用包含對同種的其它植物不利的水和離子混合物的液體供給水分，或者用此類培養基耕種時，與同種及/或者變異植物相比生長速度增加的植物即具有耐鹽性。本發明還提供用於擴增SyGT基因的引物集。上述引物集由SEQ ID N0.3及4的寡核苷酸構成。
本發明的「引物」是指與需要複製的核酸鏈互補的單鏈寡核苷酸序列，可用作合成引物延長產物的起始點。上述引物的長度及序列應允許啟動延長產物的合成。本說明書中被用作引物的寡核苷酸還可包含核苷酸類似物，例如硫代磷酸(phosphorothioate )、燒基硫代磷酸酯或者肽核酸(peptide nucleic acid),或者插入劑(intercalating agent)。以下，將通過實施例詳細說明本發明。但下述實施例僅是為了例示本發明，本發明的內容不會被下述實施例所限定。實施例實驗方法1.核轉化載體的製備集胞藻屬(Synechocystis)PCC6906的SyGT基因是從集胞藻P CC6906基因組DNA中，利用引物 5』-gctctagaATGCAAATATTAAGC GGGTTGCAA-3』(引物 SEQ ID N0.3，XbaI 位點(8行6)用下劃線標出)和5』飛(^(^&8&1"^11^66六六六6666六六0^1'(:1'1'-3』(引物 SEQ ID N0.4,XbaI位點(site)用下劃線標出)，採用PCR技術擴增獲得。將擴增獲得的基因克隆到TA克隆載體(Solgent，韓國)上，確認鹼基序列。確認鹼基序列的SyGT基因用Xbal/Xbal酶切後在P HC21B中進行亞克隆化，並命名為pHC21B-SyGT。此時，基因的插入方向根據限制酶的切割大小及PCR結果所確定。利 用該載體，對各個植物體進行轉化，從而導入SyGT基因。2.植物的轉化和培養條件2-1.菸草核轉化及培養條件將導入SyGT基因的pHC21B:: SyGT轉化載體，用凍融(freeze thaw)方法轉化至土壤桿菌GV3101 (Agrobacterium GV3101)。將單一菌落接種於添加了 100mg/L利福平(Rifampicin)、50mg/L卡那黴素(Kanamycin)的YEP培養基中培養2天左右(28 °C，避光震蕩培養箱(dark shaking incubator))。將體外培養中的除了菸草葉子邊緣部位以外的部分切成約5 X 5mm2大小的外植體，並使其在稀釋成0.D0.4-0.6的Agro溶液IOmL中懸浮，且氣孔朝上，在黑暗條件下共培養2天左右。將共培養後的外植體用蒸餾水清晰2次、用添加了 500mg/L羧節青黴素(Carbenicillin)或者凱福隆(Claforan)的溶液清晰I次後，利用滅菌紙巾去除水分，後將其葉孔朝上地接種於新梢(shoot)再分化培養基(MS+2mg/L (或者lmg/L) BA+0.lmg/LNAA+500mg/L羧苄青黴素或者凱福隆+100mg/L卡那黴素)中，在25°C、16小時晝長條件下進行培養。培養3-4周後將外植體生成的新梢(shoot)切下，移至MS生根培養基中(MS+500mg/L羧苄青黴素或者凱福隆+100mg/L卡那黴素)，待其生根後移植到土壤中，並在植物生長人工氣候室(Phytotron)中培養。2-2.擬南芥的轉化以及培養條件將擬南芥(Arabidopsis thaliana)種子在4°C、黑暗條件下低溫處理4天後,播種於土壤，約4周後用導入了耐鹽性基因的根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101作為介質,通過真空滲透(vacuum inf i Itration)方法進行轉化。經轉化的擬南芥種子在含有卡那黴素作為篩選標記的MS篩選培養基(1/2MS，0.5g/L MES, 10g/L蔗糖，50mg/L卡那黴素，100mg/L頭孢噻肟)中進行篩選，僅選擇均質接合體用於實驗。所有的培養在25°C、16小時光周期的約80 μ mol IrTiV1冷白(cool-white)突光條件下進行。2-3.浮萍的轉化及培養條件利用浮萍(Lemnaceae)的葉狀體葉子和土壤桿菌對浮萍進行轉化。更具體地說，浮萍葉狀體置於將MS培養基的所有無機鹽類濃度降至1/2，並分別添加有lmg/L BA, 0.4mg/L 鹽酸硫胺(thiamine HCl), 100mg/L 肌醇(myoinositol), 30g/L 鹿糖(sucrose)以及 4g/L結冷膠(Ge Ir i te )的培養基(1/2MS1BA培養基)中，在25 °C條件下進行光照培養(約80 μ mo IHT2s-1光周期16/8時間)，從而誘導個體增值。用刀切開增值的浮萍葉狀體，添加導入了耐鹽性基因的根癌土壤桿菌GV3101培養液後，在室溫感染20分鐘。感染完成後去除根癌土壤桿菌，乾燥後的葉子移至添加了100 μ M乙醯丁香酮(Acetosyringon)的植物培養用固體培養基,在25°C條件下,在暗室共培養72小時。共培養的葉子用含有300mg/L羧苄青黴素的液體培養基(broth)清洗3-4次，充分去除粘附於表面的土壤桿菌後放置10-20分鐘使其乾燥。後將其移至添加了 250mg/L卡那黴素和300mg/L羧苄青黴素作為篩選標記的篩選培養基中篩選葉子。置於篩選培養基後分化的葉子，以3周的間隔進行繼代培養。2-4.白楊的轉化及培養條件為了白楊的轉化，分離使用了體外增值白楊(Populus alba X P.tremula var.glandulosa (銀白楊X P.歐洲山楊var.小化香)雄性不育突變株)的節間組織。具體地，在LB液體培養基中培養的根癌土壤桿菌中加入150 μ M的乙醯丁香酮後，感染4周齡的白楊節間組織20分鐘,感染完成的節間組織放入到0.85%NaCl中清洗,後放在濾紙(filterpaper)上吸附殘留的根癌土壤桿菌。反覆清洗3次後，在沒有抗生素的CIM培養基(MS、lmg/L2, 4-D、0.lmg/L ΝΑΑ、0.0lmg/LBA, ρΗ5.8)中，24°C條件的培養室中培養 2 天。後將培養的節間組織置於CM培養基(MS、50mg/L卡那黴素、300mg/L頭孢噻肟、lmg/L2, 4-D、0.lmg/L ΝΑΑ、0.0 lmg/L ΒΑ,ρΗδ.8)中3 4周，誘導愈傷組織(callus)。節間組織中形成愈傷組織後，將其移至SM培養基(WPM，50mg/L卡那黴素、300mg/L頭孢噻肟、lmg/L玉米素(zeatin),0.lmg/L BA,0.0 lmg/L NAA, pH5.5)，培養約8周的時間，誘導新梢的生成。誘導的新梢移植到RM培養基(MS，50mg/L卡那黴素、300mg/L頭孢噻肟、0.2mg/L IBA)，誘導其生根。從RM培養基(MS， 50mg/L卡那黴素、300mg/L頭孢噻肟、0.2mg/L IBA)中誘導生根的植物體葉子組織中提取基因組DNA,通過聚合酶連反應(PCR, polymerase chainreaction)篩選轉化植物體。將誘導生根後進行篩選的白楊從培養基中取出，利用蒸餾水將粘附在根部的培養基洗去。在密閉的容器中放入滅菌的土壤，用適量的蒸餾水使其溼潤，後種植誘導出的根部，種植時要注意不要損傷根部，之後重新密閉，在24°C的培養室(16小時光照培養，8小時暗培養)中培養約20天。3.DNA印跡雜交分析利用DNeasy 植物迷你試劑盒(DNeasy Plant Mini Kit) (Qiang en,德國希爾登)，從轉化植物體葉子中分離出了總基因組DNA，約4 μ g基因組DNA被EcoRV(菸草轉化體時)切割，在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳後轉至Zeta-探針GT印跡膜(Bio-Red, Hercules,加拿大)。從集胞藻屬PCC6906基因組中利用5』 -TCCATCGCCCAGCA AGATTATCCA-3』引物(SEQ ID N0.5)和 5，-ACCGCATCAATGA CATAGGGCAAC-3』 引物(SEQ ID N0.6)，通過 PCR 法擴增約500bp的片段，後用放射性同位素[32P]dCTP標記，從而確認SyGT基因的插入。預雜交(prehybridizaition)以及雜交(hybridization)在含有 7% (w/v) SDS 的 0.25M 憐酸鈉(Sodium Phosphate,pH7.2)緩衝液中，65°C條件下進行16小時，並在含有5% (w/v)SDS的0.2M磷酸鈉(Sodium Phosphate, pH7.2)緩衝液中，65°C條件下清洗2次，每次清洗30分鐘，後在X-線膠片上反應3小時進行確認。4.實時 PCR (Real-time PCR)利用試劑盒(Trizol Reagent) (GIBC0BRL，美國紐約)從菸草和白楊葉子中提取總 RNA。將 5 μ g 的總 RNA 利用 oligo dT15 和 M-MLV 逆轉錄酶(Reverse Transcriptase)(Enzynomics,韓國大田)合成cDNA。對擬南芥種子進行消毒後使其在MS培養基(1/2MS、0.5g/LMES、10g/L蔗糖、100mg/L頭孢噻廂)中發芽,後在25°C下，以16小時的光周期,40 μ moln^sec—1的冷白突光條件下培養7天。培養出的擬南芥用DNeasy植物迷你試劑盒(QIAGEN，德國希爾登)和脫氧核糖核酸內切酶(RNase-Free DNase Set) (QIAGEN，德國希爾登)提取出總RNA。利用oligo dtl5和M-MLV逆轉錄酶(Enzynomics,韓國大田)將6 μ g的總RNA合成cDNA。合成出的菸草、擬南芥、白楊的cDNA，利用SolGent 實時PCR試劑盒(Solgent，韓國大田)以及DNA Engine 0pticon2 (MJ研究(MJ Research),美國沃爾瑟姆)進行實時定量 PCR。實時定量PCR中使用的各個引物在下述表I中示出。表I
權利要求
1.一種源於藍細菌(Synechocystis) PCC6906的集胞藻屬葡糖基轉移酶(Synechocystis glucosyl transferase, SyGT)蛋白質,其特徵在於,其由 SEQ ID N0.2 的胺基酸序列構成。
2.一種編碼權利要求1所述SyGT蛋白質的基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特徵在於，所述基因由SEQID N0.1的鹼基序列構成。
4.一種包含權利要求2所述基因的重組載體。
5.一種利用權利要求4所述重組載體轉化的宿主細胞。
6.一種增加植物體耐鹽性的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟:利用權利要求4所述載體轉化植物細胞，使SyGT基因過表達。
7.一種由權利要求6所述的方法製備的耐鹽性得到增加的轉化植物體。
8.根據權利要求7所述的轉化植物體，其特徵在於，所述植物體為雙子葉植物或單子葉植物。
9.根據權利要求7所述的轉化植物體，其特徵在於，所述植物體為菸草、擬南芥、浮萍或白楊。
10.權利要求7所述植物體的種子。
11.轉化權利要求4所述載體的耐鹽性得到增加的轉化植物體。
12.一種用於增加植物體耐鹽性`的組合物，其特徵在於，其包含權利要求2所述的基因。
13.一種用於擴增SyGT基因的引物集，其由SEQ ID N0.3及SEQ ID N0.4的寡核苷酸構成。
全文摘要
本發明涉及對源於藍細菌PCC6906SyGT蛋白質進行編碼的基因、增加植物體耐鹽性的方法，以及由所述方法製備的耐鹽性得到增加的植物體及其種子。所述方法包括以下步驟用包含SyGT基因的重組植物表達載體轉化植物細胞，使SyGT過表達。
文檔編號C07K14/195GK103200813SQ201180052330
公開日2013年7月10日 申請日期2011年10月13日 優先權日2010年10月27日
發明者劉長烈, 金錫源, 金宗炫, 閔成蘭, 鄭元重, 安明淑, 樸英敏, 吳明珍, 樸祉泫 申請人:韓國生命工學研究院