一種纖維素酶和它的編碼基因與應用的製作方法

2023-10-05 18:33:34 1

專利名稱：：一種纖維素酶和它的編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種纖維素酶和它的編碼基因與應用。
背景技術：
：纖維素主要是植物利用二氧化碳和水在太陽能作用下通過光合作用合成的地球上最豐富的可再生的生物質(biomass)資源。據報導，全球每年通過光合作用產生的纖維素高達1.55x109噸，其中89。/。尚未被人類利用(DunlapC,ChiangGC.Utilizationandrecycleofagriculturewastesandresidues.ShulerML.BocaRaton,Florida.USA:CRCPressInc.1980.19)。纖維素是多個葡萄糖殘基以P_l，4-糖苷鍵連接而成的多聚物，其基本重複單位為纖維二糖。天然纖維素的基本結構是由原纖維構成的微纖維束集合而成。原纖維是由15-40根有結晶區和非結晶區構成的纖維素分子長鏈所組成。纖維素的結晶部分是由纖維素分子進行非常整齊規則地折迭排列形成。在天然纖維素中，木質素和半纖維素形成牢固結合層，緊密地包圍纖維素。纖維素酶是能將纖維素轉化成葡萄糖的一系列酶的總稱，包括三類酶即內切一(3—1,4一葡聚糖酶(endo-(3-l,4-glucanase,EC3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，又叫纖維二糖水解酶cellobiohydrolase,EC3.2丄91)和卩一葡萄糖苷酶(卩-glucosidase,EC3.2.1.21)，這三種酶協同作用能將纖維素轉化成葡萄糖。內切葡聚糖酶作用於纖維素長鏈分子的內部將長纖維切成短纖維，外切葡聚糖酶作用於纖維素分子的一端，以兩個葡萄糖殘基為單位進行切割生成纖維二糖，(3—葡萄糖苷酶切割纖維二糖生成葡萄糖(TommeP,WarrenRAJ,GilkesNR.1995.Cellulosehydrolysisbybacteriaandfungi.Adv.Microbiol.Physiol"37:1-81.1995;BhatMK,BhatS.1997.Cellulosedegradingenzymesandtheirpotentialindustrialapplications.BiotechnologyAdvances，l5:583-620)。葡萄糖可作為重要的工業原料生產酒精、丙酮等化工產品。纖維素的利用與轉化對於解決世界能源危機、糧食和飼料短缺、環境汙染等問題具有重要意義。纖維素酶可廣泛應用於釀酒、飼料、食品、紡織、造紙等行業。如纖維素酶作為飼料添加劑可增加詞料的可消化性，減少排洩的糞便量。纖維素酶可取代浮石進行牛仔褲的"石洗"處理，也可處理其它含纖維織物以降低粗糙度和增加光亮。纖維素酶可添加到洗滌劑中以提高洗滌劑的清潔能力(BhatMK.2000.Cellulasesandrelatedenzymesinbiotechnology.BiotechnologyAdvances,18:355-383)。由於纖維素酶的廣泛用途以及針對不同的用途需要使用不同性質的纖維素酶，更由於纖維素酶的效率低、價格高而使以纖維素為原料生產燃料酒精的成本太高以至於無法真正實現產業化，因此，需要新的纖維素酶。纖維素酶屬於糖基水解酶類(glycosylhydrolases),許多糖基水解酶由一個催化功能域和一個或更多個其它的功能域如碳水化合物結合組件(carbohydrate-bindingmodules,CBMs)組成，根據催化功能域的胺基酸序列相似性，糖基水解酶類被劃分成不同的家方矣(families)(DaviesG"HenrissatB.1995.Structuresandmechanismsofglycosylhydrolases.Structure3:853-859;HenrissatB.1991.Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities.Biochem.J.280:309-316;HenrissatB.,BairochA.1993Newfamiliesintheclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities.Biochem.J.293:781-788;HenrissatB.,BairochA.1996.Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases.Biochem.J.316:695-696)。根據Cazy伺服器(server)(http:〃afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)上所列糖基水解酶類的最新清單，目前糖基水解酶類有108個家族，纖維素酶分屬於糖基水解酶類家族l、3、5、6、7、8、9、10、12、26、44、45、48、51、61、74。將未知的纖維素酶與己知的纖維素酶做序列同源性比較可對其進行分類。人類所克隆的大部分纖維素酶基因都是從純培養的微生物中來的，但並不是自然界中所有微生物都是可以被分離、培養的，一般認為可培養的微生物種類只佔自然界中微生物種類的1%(AmannRI,LudwigW,SchleiferKH.1995.Phylogeneticidentificationandinsitudetectionofindividualmicrobialcellswithoutcultivation.Microbiol.Rev.59:143-169)，那麼剩餘的99%的不可培養的微生物中蘊藏著大量的基因資源。近年來從環境樣品未培養微生物提取基因組DNA然後構建混合基因組DNA文庫以分離基因已是成熟技術(LorenzP,SchleperC.2002.Metagenome-achallengingsourceofenzymediscovery.JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic19-20:13-19)。目前世界上已克隆得到來源於不同環境的未培養微生物的纖維素酶基因，其中包括Healy等(HealyFG,RayRM,AldrichHC，WilkieAC，IngramLOandShanmugamKT.1995.Directisolationoffunctionalgenesencodingcellulasesfromthemicrobialconsortiainathermophilic,anaerobicdigestermaintainedonlignocellulose.ApplMicrobiolBiotechnol.43:667-674.)報導從木質纖維降解的厭氧環境中克隆到了一個纖維素酶基因；Rees等(ReesHC,GrantS，JonesB,GrantWD,HeaphyS.2003.DetectingcellulaseandesteraseenzymeactivitiesencodedbynovelgenespresentinenvironmentalDNAlibraries.Extremophiles.7(5):415-421)報導從湖水和湖床沉積物未培養微生物中克隆到2個纖維素酶基因CRATCEL和HKCEL，Voget等(VogetS,LeggewieC,UesbeckA，RaaschC,JaegerKE，StreitWR.2003.Prospectingfornovelbiocatalystsinasoilmetagenome.ApplEnvironMicrobiol.，69(10):6235-6242;VogetS,SteeleHL,andStreitWR.2006.Characterizationofametagenome-derivedhalotolerantcellulase.J.Biotechnol.126:26-36)報導從土壤未培養微生物中克隆到3個纖維素酶基因gnuB、uvs080和cel5A;Ferrer等(FerrerM，GolyshinaOV,ChemikovaTN,KhachaneAN，Reyes-DuarteD,SantosVA,StromplC，ElboroughK,JarvisG,NeefA，YakimovMM，TimmisKN,andGolyshinPN.2005.Novelhydrolasediversityretrievedfromametagenomiclibraryofbovinerumenmicroflora.EnvironMicrobiol.7:1996-2010)從牛瘤胃未培養微生物中鑑定了9個纖維素酶基因。Feng等(FengY,DuanCJ，PangH,MoXC,WuCF，YuY,HuYL,WeiJ,TangJL，andFengJX.2007.Cloningandidentificationofnovelcellulasegenesfromunculturedmicroorganismsinrabbitcecumandcharacterizationoftheexpressedcellulases.Appl.Microbiol.Biotechnol.75:319-328)從兔子盲腸未培養微生物中克隆和鑑定了ll個纖維素酶基因。
發明內容本發明的目的是提供一種纖維素酶和它的編碼基因與應用本發明所提供的纖維素酶，名稱為Umcel5N，來源於水牛瘤胃未培養細菌，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)自序列表中的SEQIDW2.2的胺基酸殘基序列；2)將自序列表中的SEQIDW.2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有纖維素酶活性的蛋白質。其中，序列表中序列2由345個胺基酸殘基組成。自序列2的氨基端的第15—329位胺基酸為家族5糖基水解酶(glycosylhydrolase)功能域。Umcel5N與一個來自熱纖維梭菌的內切葡聚糖酶(GenBank索引號ABN54006.1)的同源性最高，具有44%的一致性和60%的相似性。所述一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多於十個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。為了使(a)中的Umcel5N便於純化，可在由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質的N端或C端連接上如表1所示的標籤。表l.標籤的序列tableseeoriginaldocumentpage6上述(b)中的Umcel5N可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的Umcel5N的編碼基因可通過將序列表中SEQIDW:1的自5'端第149至1186位鹼基所示的DNA序列中缺失一個或幾個胺基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個鹼基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標籤的編碼序列得到。為了便於蛋白的分泌表達，還可在所述Umcel5N的氨基末端添加上信號肽序列。上述纖維素酶編碼基因(umcel5N)也屬於本發明的保護範圍。上述纖維素酶編碼基因的基因組基因，可具有下述核苷酸序列之一1)自序列表中SEQIDW:1的5'端第149-1186位核苷酸序列；2)序列表中SEQIDW:1的核苷酸序列；3)編碼序列表中SEQIDW:2所示蛋白質序列的多核苷酸；4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDW:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴謹條件可為在O.lxSSPE(或O.lxSSC)，0.1。/。SDS的溶液中，在65oC下雜交並洗膜。其中，序列表中的序列1由2217個脫氧核苷酸組成，自序列1的5'端的第149-1186位核苷酸為umcel5N的開放閱讀框(OpenReadingFrame,ORF),自序列1的5'端的第149一151位核苷酸為umcel5N基因的起始密碼子ATG,自序列1的5'端的第1184—1186位核苷酸為umcel5N基因的終止密碼子TGA。序列表中序列1編碼序列表中序列2的蛋白質序列。含有本發明基因的重組表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬於本發明的保護範圍。本發明的纖維素酶基因是通過構建水牛瘤胃未培養微生物的宏基因組DNA文庫和文庫克隆的纖維素酶活性平板檢測篩選法，得到了新的纖維素酶基因，該纖維素酶基因可在宿主細胞中大量表達本發明的纖維素酶。本發明所提供纖維素酶及其編碼基因可廣泛應用於纖維素的降解。實驗證明本發明的纖維素酶具有很高的對底物p-NPC的活性(達192U/mg)，而且本發明的纖維素酶較適合偏酸性的環境，是個中溫性的酶，對pH值的適應範圍非常廣。在最適反應條件下，Umcd5N對昆布多糖、羥基纖維素、甲基纖維素和羧甲基纖維素(Carboxymethylcellulose,CMC)的都具有降解活性；而對地衣多糖、木聚糖、Avicd有微弱的降解活性。本發明的纖維素酶Umcel5N對CMC溶液粘度影響的測定實驗說明隨著反應時間的推移，CMC溶液的粘度下降，但是測不到還原糖的產生，這表明Umcel5N是一個能使CMC液化的酶，且是一個新的CMC液化酶。在測定金屬離子及金屬離子螯合劑(EDTA)對Umcel5N酶活力的影響實驗中，尚未發現有增強本發明纖維素酶活性的金屬離子，且較低濃度的螯合劑EDTA可以顯著提高其酶活，如5mM的EDTA可使其酶活達到167.037%，10mM的EDTA可使其酶活達到197.79%，50mM的EDTA可使其酶活達到137.57%，這說明金屬離子抑制了其酶活，EDTA螯合了溶液中的金屬離子後，可使其酶活提高，這表明了纖維素酶Umcel5N不是一個金屬酶，這與纖維素酶是金屬酶的普遍觀點不一致，可以利用其這一特性在特殊環境中降解纖維素，該特性也對纖維素酶的研究提供了新的材料。圖1為從水牛瘤胃內容物樣品中提取的未培養微生物的宏基因組DNA。圖2為水牛瘤胃未培養微生物基因文庫克隆的限制性內切酶BamHI酶切分析圖。圖3為能降解4-MUC的文庫克隆質粒pGXLM2的BamHI酶切帶型。圖4為初篩獲得的重組質粒pGXLM2轉化大腸桿菌後得到的轉化子降解4-MUC的照片。圖5為表達重組質粒pET-umcel5N經EcoRI和HindIII雙酶切後電泳圖。圖6為重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-umcel5N對4-MUC活性檢測。圖7umcel5N基因的表達、表達產物Umcel5N的純化及活性膠檢測。圖8Umcel5N在不同pH值條件下的酶相對活力曲線。圖9Umcel5N在不同溫度條件下的酶相對活力曲線。.圖10Umcel5N的pH耐受性檢測結果。圖11Umcel5N的溫度耐受性檢測結果。圖12Umcel5N可以降低CMC溶液粘度實驗結果圖13金屬離子、鏊合劑、表面活性劑對Umcd5N酶活力的影響結果具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。在本發明的實施例中所用到的材料包括大腸桿菌(五"/^WcWaco")株系EPI100(購自Epicentre公司)；表達菌株Rosetta(DE3)(購自Novagen公司)；柯斯質粒載體pWEB::TNC(購自Epicentre公司)；文庫製備試劑盒(購自Epicentre公司，pWEB::TNCcosmidcloningkit，目錄號WEBC931);表達載體pET-30a(購自Novagen公司)；限制性內切酶、修飾酶、聚合酶、羧甲基纖維素(Carboxymethylcellulose,CMC)、地衣多糖(lichenan)、羥甲基纖維素(2-hydroxyethylcellulose)、甲基纖維素(methylcellulose)、燕麥芽木聚糖(oatspeltxylan)、樺木木聚糖(birchwoodxylan)、昆布多糖(laminarin)、微晶纖維素(Avicel)、對硝基苯酚葡萄糖苷(p-nitr叩henyl-p-D-glucopyranoside，pNPG)及對硝基苯酚纖維二糖苷(p-Nitrophenyl-(3-D-cellobioside，p-NPC)及4，甲基傘形纖維二糖苷(4-methylumbelliferylbeta-D國cellobioside，4-MUC)等試劑購自Promega、TAKARA、SIGMA、FLUKA或MBI。實施例l、纖維素酶Umcel5N及其編碼基因的獲得一、水牛瘤胃未培養微生物宏基因組文庫的構建1、水牛瘤胃未培養微生物宏基因組的提取及純化樣品的來源為南寧市肉聯廠剛屠宰的水牛的瘤胃，新鮮採集的樣品裝入無菌保鮮袋，帶回實驗室-2(TC保存。用直接提取法提取水牛瘤胃未培養微生物宏基因組DNA，具體方法為取水牛瘤胃內容物樣品58g放入500ml的離心管，各加入100ml提取緩衝液(含有100mM磷酸鈉鹽(sodiumphosphate)、lOOmMTirs-HCl、100mMEDTA、1.5MNaCl、質量百分含量為1%的CTAB、質量百分含量為2%的SDS，pH為8.0的溶液)混合均勻，並用攪拌機充分攪拌打碎內容物，在液氮和65。C水浴中反覆凍融三次後，混合物中加入溶菌酶至終濃度1mg/ml，加入蛋白酶K至終濃度0.5mg/ml，37。C保溫1小時，期間每20分鐘緩慢顛倒混勻一次。混合物中再加入SDS至終質量百分比濃度為2%，65t:水浴30分鐘，期間每IO分鐘顛倒混勻一次。將混合物在在BeckmanCoulterAvantiJ-E離心機(購自BeckmanCoulter公司，目錄號369003)JA-10轉頭用8，000g室溫離心25分鐘。取上清液,加入等體積的異丙醇，緩慢混勻，室溫靜置10分鐘後，8,000g離心20分鐘。棄上清，用70%乙醇漂洗沉澱塊兩次，室溫晾乾，用適量的lxTE溶解，加入等體積的氯仿抽提兩次，吸取上清夜。加入0.6體積的異丙醇，充分混勻後即可看見DNA絮狀沉澱析出，挑出DNA絮狀沉澱，用70X乙醇洗兩次DNA沉澱，室溫乾燥後，用適量lxTE溶解，獲得粗提DNA，立即進行純化。將上述得到的DNA粗提物加到SephadexG200(購自Pharmacia公司，目錄號17-0080-01)的層析柱(200mmxl0mm，含有2XPVPP(購自Sigma公司，目錄號P-6755)上，用TE緩衝液(含有10mMTris-HCl、lmMNa2EDTA，pH為8.0的溶液)洗脫，按每組分lml分段收集洗脫液，每一組分加入100)il的3M醋酸鈉溶液(pH5.2)及lml異丙醇沉澱DNA,把沉澱物溶於TE(含有10mMTris-HCl、lmMNa2EDTA，pH為8.0的溶液)中，合併所得DNA溶液，0.7%瓊脂糖凝膠電泳後切下含30kb以上的DNA的凝膠，用電洗脫法回收純化DNA，回收純化的DNA電泳圖如圖1中A和圖1中B所示，其中圖1中A中，泳道1為XDNA用五coRI酶切(片段大小從大到小依次為21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb);泳道2為H)NA(48.5kb);泳道3為從水牛瘤胃內容物提取的DNA粗提物；圖1中B中，泳道2為XDNA(48.5kb);泳道4為經過SephadexG-200凝膠和電洗脫法回收得到純化的25kb以上的DNA。2、純化獲得25kb以上的末端補平的水牛瘤胃未培養微生物宏基因組為了用上述電洗脫法回收純化的DNA製作基因文庫，首先對這些DNA進行末端補平，以產生平頭末端而和文庫製備試劑盒(購自Epicentre公司的文庫製備試劑盒pWEB::TNCcosmidcloningkit，目錄號WEBC931)中已處理好的同樣具平頭末端的pWEB::TNC載體相連，具體方法為依次在冰上向一個新的滅過菌的微量離心管中加入6|il10x末端修補緩衝液(含有330mMTris—醋酸,660mM醋酸鉀，lOOmM醋酸鎂，5mMDTT，pH7.8的水溶液),6(112.5mMdNTP混合物(每種dnNTP2.5mM)，6ji110mMATP，10ug30kb以上的DNA,2pl末端修補酶混合物(T4DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶)(購自Epicentre公司的文庫製備試劑盒pWEB::TNCcosmidcloningkit，目錄號WEBC931)，加滅菌的去離子水補充到總體積60ul。25。C下放置45分鐘，再轉移到7(TC水浴鍋放置10分鐘以終止酶反應，1.0%低熔點瓊脂糖凝膠電泳後切下含25kb—45kb的DNA的凝膠進行DNA回收(如圖1中C所示)。圖1中C中，泳道1為XDNA用五coRI酶切(片段大小從大到小依次為21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb);泳道5為25kb—45kb的末端補平的水牛瘤胃未培養微生物宏基因組DNA。3、末端補平後的水牛瘤胃未培養微生物宏基因組與pWEB::TNC的連接反應將上述末端補平後回收的DNA片段與文庫製備試劑盒中已處理好的具平頭末端的pWEB::TNC載體在T4DNA連接酶的作用下連接起來，具體方法為依次在冰上向一個新的滅過菌的微量離心管中加入12pl無菌水，2pll0倍快速連接緩衝液(10xFast-LinkLigationBuffer),1pi10mMATP,l(ilpWEB::TNC載體(0.5|ig),3|il低熔點瓊脂糖凝膠回收的30kb—45kb的DNA(0.1pg/(11)快速連接DNA連接酶(Fast-LinkDNALigase,2單位/|11)(購自Epicentre公司的文庫製備試劑盒pWEB::TNCcosmidcloningkit,目錄號WEBC931)，混勻後在25。C下放置2個小時，再在7(TC放置10分鐘以終止酶反應。4、水牛瘤胃未培養微生物宏基因組文庫的獲得及質量檢驗將步驟3所述的連接反應產物用X包裝蛋白包裝，具體方法為將在冰上剛剛溶化的入包裝提取物(購自Epicentre公司的文庫製備試劑盒pWEB::TNCcosmidcloningkit,目錄號WEBC931)的一個組分，總共50ul/管)25)al立即轉移到一個新的滅過菌的微量離心管中並快速置於冰上，再往其中加入10pl連接反應產物，充分混勻後置於30°C90分鐘後，再往其中加入另外25pi溶化的X包裝提取物，充分混勻後置於30°C90分鐘，向其中加入500|il噬菌體稀釋緩衝液(含有10mMTris-HCl,100mMNaCl,10mMMgCl2，pH為8.3的水溶液)，得到560^包裝反應產物。再將上述得到的560pi包裝反應產物加入到5.6mL的OD600=1.0的宿主大腸桿菌EPI100培養液(培養基為LB(每升含胰蛋白腖(Oxoid)，10g;酵母浸出粉(Difco)，5g;NaCl，5g;pH7.0)+10mMMgSO4)中，25。C下放置20分鐘讓上述得到的包裝的^噬菌體吸附和侵染宿主細胞￡."//￡1100，在含氨苄青黴素(終濃度為100嗎/mL)和氯黴素(終濃度為12ug/ul)的LA平板(每升含胰蛋白腖(Oxoid)，10g;酵母浸出粉(Difco),5g;NaCl，5g;瓊脂粉，15g;pH7.0)上篩選轉導子。結果共獲得約15，000個轉導子，任意提取23個克隆的質粒DNA,限制性內切酶&mHI酶切後用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，結果所有質粒除都有一個5.8kb的載體片段外，都含有插入片段，且這些外源DNA片段的酶切帶型都各不相同。酶切結果如圖2所示，其中圖2中，泳道1為XDNA用EcoRI酶切片段(片段大小從大到小依次為21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb);泳道2為lkbladder(片段大小/人大至U小依7欠為10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb,2.5kb,2.0kb,1.5kb);其它泳道分別為使用限制性內切酶BamHI酶切的不同文庫克隆質粒。結果表明該宏基因組文庫中克隆的外源DNA具有很好的隨機性。插入片段最大的為60kb,最小的為25kb,平均大小為41.6kb，該文庫中外源DNA的克隆容量約為6.5xl05kb。二、纖維素酶及其編碼基因(wm"/^VO的獲得1、從水牛瘤胃未培養微生物的宏基因組文庫中篩選表達纖維素酶活性的克隆用平板影印法將含氨苄青黴素和氯黴素的LA平板上得到的文庫(每平板約200個菌落左右)分別影印到含氨苄青黴素(終溶度100ug/inL)和氯黴素(終溶度12ug/ml)的LA平板上，將平板倒置於37。C培養箱培養36小時後，在培養好的LA平板的菌落的上面加入2ml含有質量百分含量為0.04%4-methylumbdliferylbeta-D-cellobioside(4-MUC)的0.6%的瓊脂糖凝膠，繼續在37。C培養45min，然後在紫外燈下檢測菌落周圍有無螢光，若菌落為周圍有螢光的克隆則表明篩選到了對4-MUC有活性的陽性克隆。本文庫中共篩選得到的5個對4-MUC有活性的陽性克隆，經轉化驗證後這些克隆仍具有4-MUC活性。提取這5個克隆的質粒，經BamHI酶切分析發現，共有3個獨立的克隆，分別命名為LM2、LM4和LM5。選取對4-MUC降解活性最強(根據在紫外燈下螢光的強弱來判斷)的LM2原始克隆提取該克隆的質粒DNA並將其命名為pGXLM2，用限制性內切酶及M2HI完全酶切pGXLM2後，進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖3所示，pGXLM2除有一個5.8kb的載體片段外，還有另外4條片段，大小分別為21.0kb，llkb,9.Okb，7.Okb。結果表明pGXLM2含有48.0kb的插入片段。其中，泳道1為A用fcoRI酶切後的片段(片段大小從大到小依次為21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb);泳道2為lkbladder(片段大小從大到小依次為10.Okb，8.Okb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3,5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb，lkb，750bp，500bp);泳道3為pGXLM2/BamHI(從上至下分別為2L0kb,llkb，9.Okb，7.Okb)為了證實pGXLM2的插入片段確實含有纖維素酶基因，用pGXLM2質粒DNA和空載體pWEB::TNC分別轉化Aco^'EPI100，在含氨苄青黴素(100ug/mL)的LA平板上篩選轉化子，隨機挑取由每個質粒轉化得到的10個轉化子點接到LA平板上，37。C培養24小時後，在培養好的LA平板的菌落的上面加入含有0.04%4-MUC的0.6%的瓊脂糖，繼續在37'C培養45min，然後在紫外燈下檢測菌落周圍有無螢光，結果表明所有10個由空載體pWEB::TNC轉化得到的轉化子周圍都沒有螢光，所有10個由pGXLM2轉化得到的轉化子在紫外燈下周圍都有螢光，其中一個轉化子的檢測結果如圖4所示(圖4中左側菌落為空載體pWEB::TNC轉化得到的轉化子，右側菌落為由pGXLM2轉化得到的轉化子)。結果表明重組質粒pGXLM2的插入片段上確實含有纖維素酶基因。2、纖維素酶及其編碼基因"mce/5A0的獲得為了測定重組質粒pGXLM2上纖維素酶基因的DNA序列，採用亞克隆的方法對該基因進行定位。亞克隆的具體步驟是使甩限制性內切酶^a/zHI對重組質粒pGXLM2(約48kb)進行了完全酶切後加入連接酶在16'C連接兩個小時(在pGXLM2完全酶切後，該重組質粒含有的載體pWEB::TNC的5.0kb的部分可以利用來克隆各個外源^wzffl片斷)。連接產物用化學法轉化大腸桿菌EPI-100,塗布在含氯黴素(終濃度34ug/ml)的LA平板上。在培養好的LA平板的菌落的上面鋪上一層含有質量百分含量為0.04%的4-MUC的0.6y。的瓊脂糖凝膠，繼續在37r培養1小時，然後在紫外燈下檢測菌落周圍有無螢光。任意挑選24個有螢光反應的轉化子，提取質粒做5amffl酶切分析，其中一個重組質粒只有一條21kb的外源片段；然後用同樣的步驟再選用fecn對該片段進行亞克隆，把編碼纖維素酶的基因定位在5.7kb的片段上；最後選用五coRI對該片段進行亞克隆，得到只含有約4.8kb五coRI外源片段的仍保持有4-MUC降解活性的亞克隆。將該重組質粒pGXLM2寄送大連寶生物工程公司採用雙脫氧核苷酸法對該亞克隆進行雙向雙鏈測序。測序結果用軟體DNAStar(DNASTAR公司，版本5)及NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)上的軟體對DNA序列進行分析，如Blast(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST),得到纖維素酶的編碼基因，該基因具有序列表中序列l的核苷酸序列，命名為畫"/5見自序列表中序列1的5'端的第149至1186位核苷酸為wmce/5iV的開放閱讀框(OpenReadingFrame,ORF),由1038個核苷酸組成，自序列1的5'端的第149—151位核苷酸為臓ce/57V基因的起始密碼子ATG，自序列1的5'端的1184-1186位核苷酸為wmce/5iV基因的終止密碼子TGA。wmce/57V可通過人工合成得到。纖維素酶基因wmce/5iV編碼一個含345個胺基酸的蛋白質Umcel5N，具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列，用DNAStar軟體預測該蛋白質的理論分子量大小為39.812道爾頓，等電點pl為6.16。用簡單組件結構研究工具(SimpleModularArchitectureResearchTool,SMART,http:〃smart.embl-heidelberg.de)分豐斤纖維素酶Umcel5N的組件結構，結果表明，自序列2的氨基端的第15-329位胺基酸為家族5糖基水解酶(glycosylhydrolase)功能域。Umcel5N與一個來自熱纖維梭菌的內切葡聚糖酶(GenBank索引號ABN54006.1)的同源性最高，具有44%的一致性和60%的相似性。實施例2、wmce/5W在大腸桿菌中的表達1、可表達wmce/5W的重組載體(pET-umcel5N)的構建人工合成謂ce/57V基因的編碼序列，即合成具有序列1的自5'端第149位至1183位核苷酸的DNA片段，合成謂ce/5W基因兩端帶有五coRJ和歷"d酶切位點，將合成後並測序表明正確的wwce/5iV基因片段用￡CORI和/^'"JI酶切後，插入載體pET-30a(+)(購自Novagen公司)的五coRI和///"d位點間，得到重組表達載體，將該重組載體進行酶切和測序鑑定，將酶切和測序表明含有廳ce/57V基因編碼序列(序列1的自5'端第149位至1183位核苷酸的DNA片段)的正確的重組載體命名為pET-umcel5N。起始密碼子和終止密碼子由表達載體pET30a(+)提供。表達產物的N端和C端分別有一個由表達載體提供的His標籤(6xHisTag)。其中，pET-umcel5N重組質粒的酶切電泳圖譜如圖5所示，圖5中可以看到重組質粒經五coRI和雙酶切後釋放出一條5.3kb的載體帶和一條與人工合成wmce/5W基因經五coRl禾口幼'"d酶切後同樣大小的1.038kb的片段。圖5中，泳道1為lkbladder(片段大小從大到小依次為10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb,2.5kb,2.0kb,1.5kb);泳道2為重組質粒pET-umcel5N經￡coRI和///"d雙酶切後結果。2、wmce/57V基因在五.co"BL21(DE3)中的表達把pET-umcel5N轉化至五.co/ZBL21(DE3)中，得到轉化子，將得到的轉化子提取質粒並進行測序驗證，將測序表明正確的含有pET-umcd5N的轉化子命名為BL21(DE3)/pET-umcel5N。用同樣的方法將pET-30a轉入BL21(DE3)中，得到含有pET-30a的轉化子，將測序表明正確的轉化子命名為BL21(DE3)/pET-30a。挑取BL21(DE3)/pET-umcel5N單菌落於LA平板上(含氯黴素34yg/mL，卡那黴素25ug/ml，IPTG1.0mmol/L)，同時用BL21(DE3)/pET-30a(轉入pET-30a的BL21(DE3))作為空白對照，37。C培養24小時。菌體經氯仿破壁後用含質量百分含量為0.04X的4-MUC的0.6n/。瓊脂糖凝膠覆蓋，然後培養45min，在紫外燈下觀察菌落周圍有無螢光。結果如圖6所示，結果表明重組菌BL21(DE3)/pET-umcel5N周圍有螢光(圖6中的右側菌落)，而空白對照BL21(DE3)/pET-30a周圍無螢光(圖6中的左側菌落)，說明靶基因wmce/5W在BL21(DE3)中已經高效表達出了有纖維素降解活性的蛋白質產物。3、Umcel5N的純化1)BL21(DE3)/pET-umcel5N菌體發酵挑取BL21(DE3)/pET-umcel5N單菌落接種到10ml含有34|ig/ml氯黴素(CAM)和25pg/ml卡那黴素的LB培養液中，37°C200rpm培養12小時。取5ml培養液接種到100ml含有34嗎/ml氯黴素(CAM)與25嗎/ml卡那黴素的LB培養液中，在37°C培養200rpm培養至OD6oo為0.6。加入IPTG至終濃度為0.3mM，16。C繼續培養20個小時，5,000g離心收集菌體。用同樣的方法培養BL21(DE3)/pET-30a並收集菌體作為空白對照。2)Umcd5N的提取與純化在步驟1)收集獲得的BL21(DE3)/pET-umcel5N或BL21(DE3)/pET-30a菌體中，分別按每克菌體重量加入5ml的裂解緩衝液(含有50mMNaH2PO4，300mMNaCl，10mMimidazole(咪唑)，lmMPMSF(苯甲基磺醯氟)，pH8.0的水溶液)，懸浮菌體，加入溶菌酶至終濃度lmg/ml，置冰上30分鐘。用超聲波破碎細胞，400w作用20次，每次作用時間10s，每次作用間隔12s。12，000g離心20分鐘，收集上清分別得到Umcel5N粗酶液(BL21(DE3)/pET-umcel5N細胞裂解上清液)和BL21(DE3)/pET-30a細胞裂解上清液。使用Qiagen公司的TheQIAexpressionistkit試劑盒(方法參照試劑盒說明書)進行純化。將上述得到的Umcel5N粗酶液(BL21(DE3)/pET-umcel5N細胞裂解上清液)，按每4ml裂解上清液加入lml質量百分含量為50。/。的NI-NTA膠體，在4°C用200rpm搖60分鐘，混合物灌注到TheQIAexpressionistkit試劑盒附帶的柱子。加4ml洗滌緩衝液(含有50mMNaH2P04,300mMNaCl,20mMimidazole,ImMPMSF，pHS.O的水溶液)到柱子裡，緩慢攪拌。重複衝洗6次。加入0.5ml的洗脫緩衝液(含有50mMNaH2PO4，300mMNaCl，250mMimidazole,lmMPMSF，pH值為8.0的水溶液)，收集流出物,重複洗脫8次。合併8管蛋白質溶液即得到Umcel5N蛋白液，取5ul用SDS-PAGE檢測蛋白質的純度。SDS-PAGE結果如圖7所示，結果表明umcel5N基因在大腸桿菌中得到了高效表達，表達產物Umcel5N分子量為45kDa左右，與預計的分子量基本一致，粗酶液經鎳柱純化後，基本去掉了雜蛋白，Umcel5N已達到SDS-PAGE單條純。以BL21(DE3)/pET-30a的總蛋白(以上述得到的BL21(DE3)/pET-30a細胞裂解上清液為材料進行電泳)SDS-PAGE作為空對照。用活性膠染色法檢測了Umcel5N的纖維素酶活性，首先Umcel5N在聚丙烯醯胺非變性膠上進行蛋白質電泳(Native-PAGE)，然後把非變性膠置於乾淨的培養皿上，滴加lml濃度為1.25mM的pNPC溶液，用玻棒平塗均勻，用塑膠袋包裹平板，在37t:中保溫10-20分鐘後，如果蛋白條帶具有纖維素酶活性，即直接在膠上就可觀察到一條清晰的黃色水解帶。活性膠檢測該目標帶具有p-NPCase活性，說明umcel5N是按正確的閱讀框架表達的。圖7中，泳道l為分子量標準(marker);泳道2為BL21(DE3)/pET-30a的總蛋白(以上述得到的BL21(DE3)/pET-30a細胞裂解上清液為材料進行電泳，作為空對照)；泳道3為Umcd5N基因的表達的粗酶液；泳道4為鎳柱純化後Umcel5N;泳道5為Umcel5N的活性膠檢測。4、Umcel5N酶學特性的研究將經過上述步驟3純化的重組酶Umcel5N蛋白液用pH5.5的擰檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液稀釋到蛋白濃度1.95ug/ml，用來進行酶學特性試驗。酶活測定中，每個樣品均作三次重複。(1)內切葡聚糖酶的酶活力測定採用DNS法，具體操作如下1)DNS試劑的配製稱取10gNaOH用約400mlddH20溶解，再稱取10g二硝基水楊酸、2g苯酚、0.5g無水亞硫酸鈉、200g四水酒石酸鉀鈉，將其溶解於約300mlddH20中，兩種溶液混合，定容到1升，避光保存一周後使用。2)葡萄糖濃度標準曲線的製作①用去離子水配製2.0mg/ml葡萄糖標準水溶液。②在試管中按表1加入溶液。表l.葡萄糖濃度標準樣的製備tableseeoriginaldocumentpage15③混勻後在沸水中反應5分鐘，用自來水衝洗管壁冷卻。④各試管取200pl溶液加入96孔酶標板，用酶標儀測530nm下的吸光值，繪製標準曲線，保存在測定程序中。3)內切葡聚糖酶活力測定①用CMC(羧甲基纖維素)作底物測定內切葡聚糖酶活力。②將200O.Olg/mlCMC(溶解於pH5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液中)溶液與90^相同pH值的緩衝液(pH5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液)在試管中混合，置於最適溫度(55°C)的水浴鍋中預熱5分鐘。③加入10pl上述稀釋得到的1.95ug/ml的Umcel5N蛋白液，保溫反應15分鐘。④待反應結束後，立即加入700^1的去離子水(補足1000pl體積)禾口2ml的DNS試劑，置於沸水中水浴5分鐘，用自來水冷卻至室溫。⑤取20(Hil溶液加入96孔酶標板，用酶標儀測530nm下的吸光值，根據葡萄糖標準曲線計算反應體系中產生的葡萄糖濃度。酶活力單位(U)定義1U為每分鐘催化產生1pmol還原糖所需的酶量。比酶活的定義每mg或g蛋白質所含的酶活力(U/mg或U/g)。結果表明，在pH值為5.5，溫度為55i:的條件下，Umcel5N對羧甲基纖維素降解酶活的比活力為0.374U/g。(2)Umcel5N對底物p-NPC、p-NPG的酶活力測定1)對硝基苯酚(p-NP)濃度標準曲線的製作①用去離子水配製10mM的p-NP標準液。②在試管中按表2加入溶液。表2.p-NP濃度標準樣的製備tableseeoriginaldocumentpage16③取各濃度標準溶液140pl加入小離心管，分別加入70pl0.4M的Na2CCM容液，用移液搶小心吸打混勻，避免出現氣泡。取200^1溶液加入96孔酶標板，用酶標儀測410nm下的吸光值，繪製標準曲線，保存在測定程序中。2)以對硝基苯酚二糖苷(p-NPC)、對硝基苯酚葡萄糖苷(p-NPG)分別為底物測定Umcel5N活力。方法如下①配製濃度為25mM的p-NPC水溶液、25mM的p-NPG水溶液分別作為底物，用小管分裝，管外用鋁箔包裹避光，保存於-2(TC冰箱。②取pH5.5的擰檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液中116pl，加入14pl底物溶液(25mM的p-NPC水溶液或5mM的p-NPG水溶液)，置於一定溫度的水浴鍋中預熱5分鐘，加入10pl酶液(上述稀釋得到的1.95ug/ml的Umcel5N蛋白液)，保溫反應10分鐘。③反應結束後，立即加入70^10.4M的Na2C03溶液，終止反應。取200^1溶液加入96孔酶標板，用酶標儀測410nm，根據p-NP標準曲線計算反應體系中產生的p-NP濃度。酶活力單位(U)定義1U為每分鐘催化產生1pmolp-NP所需的酶量。比酶活的定義每mg或g蛋白質所含的酶活力(U/mg或U/g)。結果表明，在pH值為5.5，溫度為55"C的條件下，Umcel5N對對硝基苯酚二糖苷(p-NPC)降解酶活的比活力為192U/g，在pH值為5.5，溫度為55'C的條件下，Umcel5N對對硝基苯酚葡萄糖苷(p-NPG)無降解能力。(3)Umcel5N對pNPC降解的最適pH值的測定按照步驟(2)的方法測定37"C時，不同pH(範圍為3.010.0)Umcel5N對pNPC降解的酶活和比酶活，其中在pH3.07.0範圍內使用檸檬酸一磷酸氫二鈉緩衝液，pH6.08.0使用0.1M磷酸二氫鈉緩衝液一磷酸氫二鈉緩衝液，pH7.09.0範圍內使用0.1M的Tris-HCl緩衝液，pH8.510.0範圍內使用0.1M的甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液。反應體系為14^125mmol/L的pNPC,10|il酶液(上述稀釋得到的1.95ug/ml的Umcel5N蛋白液)，116|il不同pH的緩衝液，37。C反應10分鐘，加入70^10.4mol/L的Na2C03溶液以終止反應，反應後用酶標儀測A410。按照步驟(2)的方法計算酶活力和比活力，在37"的反應條件下，Umcel5N在pH5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液中的比活力最高，以此為100%，換算各pH值下的相對酶活力。結果如圖8所示(圖中令表示pH3.07.0範圍內所使用的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩衝液，B表示pH7.09.0範圍內所使用0.1M的Tris-HCl緩衝液，A表示pH8.510.0範圍內所使用0.1M的甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液)，結果表明Umcel5N對pNPC的最適pH為5.5。(4)Umcel5N的最適溫度的測定按照步驟(2)所述反應體系及方法，在Umcel5N的最適pH5.5條件下測定不同溫度下(2(TC70。C)的相對酶活。結果如圖9所示，表明Umcel5N對pNPC的最適溫度為55°C。(5)Umcel5N的pH耐受性實驗將酶保存於不同pH值的緩衝液(在pH3.07.0範圍內使用檸檬酸一磷酸氫二鈉緩衝液，pH6.08.0使用0.1M磷酸二氫鈉緩衝液一磷酸氫二鈉緩衝液，pH7.09.0範圍內使用0.1M的Tris-HCl緩衝液，pH8.510.0範圍內使用0.1M的甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液)中，於4"C放置24小時後，按照步驟(2)所述反應體系及方法，在最適pH值(pH5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液)和最適溫度(55°C)下測定酶活。以酶活最高為100%酶活換算其他反應條件下的相對酶活。結果如10所示(圖中令表示pH3.07.0範圍內所使用的檸檬酸一磷酸氫二鈉緩衝液，B表示pH7.09.0範圍內所使用0.1M的Tris-HCl緩衝液，A表示pH8.510.0範圍內所使用0.1M的甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液)，表明Umcel5N在pH4.010.0之間具有較好的穩定性。(6)Umcel5N的熱穩定性分析將酶保存於最適pH值的緩衝液(pH5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液)中，置於不同溫度下(4°C70°C)放置1小時後，然後按照按照步驟(2)所述反應體系及方法，在最適pH值(pH5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液)和最適溫度(55°C)下測定酶活。結果如圖ll所示，表明在20-45。C範圍內，Umcel5N的酶活力穩定性較好。(7)Umcel5N的底物特異性按步驟(1)所述的CMC酶活力的測定方法，檢測重組酶Umcel5N的酶液(上述稀釋得到的1.95ug/ml的Umcel5N蛋白液)在最適pH值(pH5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液)和最適溫度(55°C)下分別以質量百分含量為1%的各種多糖溶液(CMC、地衣多糖(lichenan)、羥甲基纖維素(2-hydroxyethylcellulose)、甲基纖維素(methylcellulose)、燕麥芽木聚糖(oatspeltxylan)、樺木木聚糖(birchwoodxylan)、昆布多糖(laminarin)、微晶纖維素(Avicel)、酸洗膨脹纖維素(acidswollencellulose))為底物溶液時的酶活力。其中，對CMC、地衣多糖(lichenan)反應時間為15分鐘；對羥甲基纖維素(2-hydroxyethylcellulose)、甲基纖維素(methylcellulose)、燕麥芽木聚糖(oatspeltxylan)、樺木木聚糖(birchwoodxylan)、昆布多糖(laminarin)反應時間為2小時；對微晶纖維素(Avicel)、酸洗膨脹纖維素(acidswollencellulose)反應時間為24小時。此外，還按步驟(2)所述反應體系及方法檢測了以pNPG(p-nitr叩henyl-卩-D-glucopyranoside)為底物的活性，反應時間為2小時。結果表明，在pH值為5.5，溫度為55'C的條件下，Umcd5N對對硝基苯酚葡萄糖苷(p-NPG)無降解能力。(8)Umcel5N對CMC溶液粘度的測定使用BROOKFIELD旋轉粘度計對Umcel5N在不同時間對CMC溶液粘度的測定。反應體系為Umcel5N酶液(上述稀釋得到的1.95ug/ml的Umcel5N蛋白液)lOpl，質量百分含量為1%的CMC溶液(pH5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液溶解)650|il;每個樣品均作三個重複。將反應體系在37。C反應，分別在不同時間段(0.5h、lh、2h、3h、4h、5h)取出反應產物在沸水中煮沸滅活5min，取出滅活500^1反應液加入BROOKFIELD旋轉粘度計進行粘度測定，可直接讀出粘度數值，以粘度為縱坐標，反應時間為橫坐標作圖，根據所作圖對Umcel5N的特性進行判斷。結果如圖12所示，結果表明隨著反應時間的推移，CMC溶液的粘度下降，但是不產生還原糖，這表明Umcel5N是一個能使CMC液化的酶。(圖中令表示粘度值的變化，國表示還原糖量的變化)(9)金屬離子、螯合劑、表面活性劑對Umcel5N酶活影響的測定按照步驟(2)的方法，在以pNPC為底物的酶反應體系中，分別加入5mM的金屬離子KC1(圖13中K+)、LiCl(圖13中Li十)、CaCl2(圖13中Ca2+)、MnCl2(圖13中Mn2+)、MgCl2(圖13中Mg2+)、CoCl2(圖13中Co2+)、FeCl2(圖13中Fe2+)、ZnCl2(圖13中Zn2+)、CrCl2(圖13中Cr2+)、FeCl3(圖13中Fe3+)、CuCl2(圖13中Cu2+)或金屬離子螯合劑EDTA(5mM(圖13中5E)、10mM(圖13中10E)、50mM(圖13中50E)或100mM(圖13中100E))或0.25g/ml的表面活性劑SDS，在Umcel5N的最適作用條件下測定酶活力。以按照步驟(2)的方法，在以pNPC為底物的酶反應體系中不添加上述試劑的反應測定的酶活力為100。/。(圖13中ck)，在Umcel5N的最適作用條件下測定各處理酶活力，並計算的相對酶活。結果如圖13所示，實驗表明在測定金屬離子及金屬離子螯合劑(EDTA)對Umcel5N酶活力的影響實驗中，尚未發現有增強其酶活性的金屬離子，且較低濃度的螯合劑EDTA可以顯著提高其酶活，如5mM的EDTA可使其酶活達到167.037%，10mM的EDTA可使其酶活達到197.79%，50mM的EDTA可使其酶活達到137.57%，這說明金屬離子抑制了其酶活，EDTA螯合了Umcel5N中的金屬離子後，可使其酶活提高，但是當EDTA的濃度達到100mM時可使酶活降至9.77%，同時這也表明了纖維素酶Umcel5N不是一個金屬酶，這與纖維素酶是金屬酶的普遍觀點不一致。序列表<160〉2<210〉1<211〉2217<212〉DNA<213〉未知<220〉〈223〉<400〉1cgttccgggggctgctcaacgttggcgtgcgcacctacgacgagaagtscaattcgcagt60gagacggtcaggaaacgcttgtcgcgcgtcgcgacgttaaacatggcccggggcggcccc120ggg3t卿C3tC3Cg3犯ggggc朋cgcgttggg朋ggcttcatggcggg180cgccaacctcgggcactggatctcccagtacgagaaccatagCElttgggJl240caactatatcattgcctccgacttcgcgcagatgcgctcgtgggggatggaccacgttcg300cctgccggtggactax:ccgatgttcgagcgcgacgacgccccggggc肌t3cctcga_gg3360agggctccattacatcgactgggcgcttgagcagtgccgccgcaacgggctg雄ttggt420gctcgaccttcacaagacgcccggcttcttcttcttcgaccgggc肌g肪480cgacctgttcaacagcccggcgaagcaggagcgctttttgaacatctggcggatgttcgc540caagcgttacgcgggcgagggcgacaacctcgctttcgagctgctgaacgaattggtctg600cgaggattcgctcccgtggaacgccttgtggccc肌ggcggtcgccgccatccgcgagat660ctccccgaagcgcaeigstcgtcgtcggcagcaaccgctgg咖tcggtggacgsgctgaa720gaacctgaccctcaccgacgattccaacgtcatttacaacttccattgctacgcccccat780cgtcttcaccC3CC3gCgggcgccgtgggaaagctggctgatggagtaccaga.cctcggt840ggtctacccggtgccggtcgaggagcatcgcgtcttcctgacccgacctt■ccttggcaaatacaaggtcatcgaccgcgccgccatggctgacatcctccgcccggcggc960ggagttcatcgccgcccatca.gcggccgctctactgcggcgagtacggggtcatcgccaa1020cgccgaccttggcagcacggtgcgctggctcgacgacatcacctccatcttc肌cgagct1080gggcatcggccacgccgtctggagctatcgcggcttcgccaaggtcaccgacgcgaaccg1140ccgcccggtctgccccggggtcatcgccgccatctcccgccactgagcgcccggggcgtc1200gcctccgcccccggtttgccgccgcggcgttgtcgtcatccatgggcgcccccctcggtc1260accgcgcacggccccggcaggcgtttcagccgctccaggtccgccggggtcatccgcacc1320gtggccaccgcctcgtcgccctcgtagcgggicggcgaggccgacgccgtattggttgagg1380acggcgagccgccgcccgtcgcccgcggccgggaacagcaggaggaaagaagstgg肌aa1440acggacaagc卿gC3tggtcgctggcgttggcgttggtggcggcgctastggccccggg1500gctcgcggaggaggcgcccgccgccacggagtcggccatcggcgtggcggtgtcaccggg1560caagccgttccagttcagggtttttgacgactatgcggtcctcagcggctacagcgcgct1620ggaaccgaccatcgtcattccgacggagactg鄉gacgc犯ggtCEltggtcatcggcsa1680gagcgcgttctccatgaacccccatattaccgccgtgaccattcccgctgggatcgttcg1740catcgaggacatggctttcaccgcttgcacgcggttggccgccgtggacatccccgggag1800cgtgcaggagattggcactggagctttcgc鵬gtgcgcggggttggccagcgtgacttt1860gcatg鄉ggacgcgcgtcatcggcataggcgctttctcgaaatgcgccgcgctcaaggc1920cattgccttgcccgccgggacgcagaagatcgagatgggcgcgttcagcgagtgcccagc1980gctcgcctccgtg3Ctttggcgtcgggsttgcagg卿ttggcgtccgcgcgtttgcgga2040ctgtcgcgaattgaaacaggtcacgatcccgggatcctctccctatagtgagtcgtatta2100tgcggccgcgaattccggatgagcattcatcaggcgggcaeig犯tgtga^t肌鄉ccgg2160ataaaacttgtgcttatttttctttacggtcttaaaaaggccgtaatatccagcgag2217<210〉2<211〉345<212〉PRT〈213〉未知<220〉〈223〉1MetAlaThrArgTrpGluGlyPheMetAlaGlyAlaAsnLeuGlyHis151015TrplieSerGinTyrGluAsnHisGlyAsnLysGluHisTrpAspAsn202530TyrlielieAlaSerAspPheAlaGinMetArgSerTrpGlyMetAsp354045HisValArgLeuProValAspTyrProMetPheGluArgAspAspAla505560ProGlyGinTyrLeuGluGluGlyLeuHisTyrlieAspTrpAlaLeu65707580GluGinCysArgArgAsnGlyLeuAsnLeuValLeuAspLeuHisLys859095ThrProLeuPheMetPhe130LeuLeu145TrpProlieValLeuThrAlaPro210MetGlu225ArgValValliePhelielieAla290ThrSer305ArgGlyGlyAsn115AlaAsnLysValLeu195lieTyrPheAspAla275AsnliePheGlyValliePhe100SerLysGluAlaGly180ThrValGinLeuArg260AlaAlaPheAlaAla340PheProLeuVal165SerAspPheThrGlu245AlaHisAspAsnLys325AlaPheAlaTyrVal150AlaAsnAspThrSer230LysAlaGinLeuGlu310ValliePheLysAla135CysAlaArgSerHis215ValHisMetArgGly295LeuThrSerAspGin120GlyGlulieTrpAsn200GinValAsnAlaPro280SerGlyAspArgAsn105GluGluAspArgAsn185ValArgTyrProAsp265LeuThrlieAlaHis345LysArgGlySerGlu170SerlieAlaProThr250lieTyrValGlyAsn330GluPheAspLeu155lieValTyrProVal235PheLeuCysArgHis315ArgAlaLeuAsn140ProSerAspAsnTrp220ProLeuArgGlyTrp300AlaArgGlyAsn125LeuTrpProGluPhe205GluValGlyProGlu285LeuValProLys110lieAlaAsnLysLeu190HisSerGluLysAla270TyrAspTrpValAsnTrpPheAlaArg175LysCysTrpGluTyr255AlaGlyAspSerCys335AspArgGluLeu160LysAsnTyrLeuHis240LysGluVallieTyr320Pro權利要求1、一種纖維素酶，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQID№2的胺基酸殘基序列；2)將序列表中SEQID№2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有纖維素酶活性的蛋白質。2、根據權利要求1所述的纖維素酶，其特徵在於所述纖維素酶的胺基酸殘基序列為序列表中序列2所示的胺基酸殘基序列。3、權利要求1或2所述的纖維素酶的編碼基因。4、根據權利要求3所述的編碼基因，其特徵在於所述纖維素酶的編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDN2:1的5'端第149-1183位核苷酸序列；2)序列表中SEQIDNa:1的核苷酸序列;3)編碼序列表中SEQIDN2:2所示蛋白質序列的多核苷酸；4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDNQ:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。5、含有權利要求3或4所述的纖維素酶編碼基因的表達載體。6、含有權利要求3或4所述的纖維素酶編碼基因的轉基因細胞系。7、含有權利要求3或4所述的纖維素酶編碼基因的宿主菌。8、權利要求1或2所述的纖維素酶在纖維素降解中的應用。9、權利要求3或4所述的纖維素酶編碼基因在纖維素降解中的應用。全文摘要本發明公開了一種纖維素酶及其編碼基因與應用。該纖維素酶是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQID№2的胺基酸殘基序列；2)將序列表中SEQID№2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有纖維素酶活性的蛋白質。該纖維素酶及其編碼基因可廣泛應用於纖維素的降解。該纖維素酶具有很高的對底物p-NPC的活性達192U/mg，能使CMC液化，較適合偏酸性的環境，是個中溫性的酶，對pH值的適應範圍非常廣。EDTA螯合了溶液中的金屬離子後，可使其酶活提高。文檔編號C12N15/56GK101338307SQ200810116798公開日2009年1月7日申請日期2008年7月17日優先權日2008年7月17日發明者馮家勳,利劉,唐紀良,毅封,段承傑申請人:廣西大學