攜帶人β珠蛋白基因的β^IVS-II-654轉基因小鼠模型的製備方法

2023-11-08 03:42:02 1

專利名稱：：攜帶人β珠蛋白基因的βIVS-II-654轉基因小鼠模型的製備方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，具體涉及一種攜帶人P珠蛋白基因的PIVS—654轉基因小鼠模型的製備方法。
背景技術：
：(3地中海貧血是最常見的單基因遺傳病之一，全世界大約有8000萬攜帶者。p地貧主要是卩珠蛋白基因的點突變或缺失致使卩珠蛋白鏈合成減少或完全缺乏所致的慢性貧血性疾病，廣泛流行於地中海地區、中東、東南亞和非洲，我國南部省份也是高發區。嚴重的(3地中海貧血表現為紅細胞生成障礙和嚴重的貧血，需要終生輸血維持生命。但是由於鐵離子的沉積，最終導致患者器官功能的衰竭而死亡。(3'vs"'-^地中海貧血是中國人特有的一種突變類型的{3地中海貧血，約佔中國人p地中海貧血的1836%。該病由發生在第二內含子(IVS-n)的第654位(nt654)上C—T突變引起，出現的單鹼基取代產生了一個新的GT二核苷酸，聯同旁側序列構成一個新的5，端異常的剪接位點，同時還激活了IVS-II第579位(nt579)處3'隱匿的剪接位點，從而將IVS-2nt580-nt652之間一段73bp內含子序列作為額外的片段插入外顯子2和外顯子3之間，產生了異常的P-珠蛋白mRNA。在異常剪接的mRNA中存在一個提前的終止密碼子，使得翻譯提前中止而產生極不穩定的異常p珠蛋白，這樣正常p珠蛋白鏈合成減少，引起a鏈的相對升高。過剩的a鏈沉積在細胞膜上，使得紅細胞破壞，引起紅細胞生成障礙和溶血性貧血。當前，治療卩地中海貧血最為有效的手段是進行造血幹細胞移植，但是異體造血幹細胞的移植很難找到同型的供體，因此，通過基因修飾的自體造血幹細胞移植成為二十年來治療的新策略。但是，通過基因修飾的方法仍然存在著障礙。要想獲得外源基因的高效表達，需要轉入較長的P珠蛋白基因序列和調控元件。既往使用的逆轉錄病毒載體(oncoretroviral)雖然可以取得有效的染色體整合，但是病毒的滴度往往較低、表達不夠理想並且容易發生基因的重排。來源於人類免疫缺陷病毒l(HIV—1)的慢病毒載體是逆轉錄病毒的一種，具有可以感染非分裂期細胞、容納外源性目的基因片段大、免疫反應小等特點而成為一種新型的基因治療載體系統，越來越受到人們的重視。2000年，May等人首次使用慢病毒載體(TNS9)進行骨髓幹細胞移植治療有效地改善了P地中海貧血的症狀。此後，其它研究小組也相繼證實了慢病毒載體介導治療卩地貧和其它血紅蛋白疾病的效果。這為慢病毒載體應用於臨床試驗展示了前景，但是，慢病毒載體所介導的基因治療的穩定性和安全性仍需要進一步觀察。
發明內容本發明的目的在於提供一種攜帶人p珠蛋白基因的PIVS—654轉基因小鼠模型的製備方法，包括步驟-A、人P珠蛋白基因片段的克隆；B、人(3珠蛋白基因啟動子的克隆；C、將人(3珠蛋白基因、人)3珠蛋白基因啟動子克隆到載體質粒，構建攜帶人P珠蛋白基因的慢病毒載體LBG;D、將慢病毒載體LBG與包裝質粒共轉染細胞，培養後獲得病毒顆粒；E、將病毒顆粒進行P'vs-"，小鼠受精卵的卵周間隙顯微注射，得到攜帶人卩珠蛋白基因的『s—654轉基因小鼠。本發明的另一目的在於提供一種慢病毒載體LBG，所述慢病毒載體LBG攜帶有人卩珠蛋白啟動子，以及人P珠蛋白基因片段。本發明的攜帶了人卩珠蛋白基因的(3654轉基因小鼠模型的基因組中穩定整合了慢病毒載體介導的人(3珠蛋白基因，並且能持續穩定的表達，而且可以遺傳給後代並能維持原表達水平。發明人通過該轉基因小鼠模型，觀察到慢病毒載體介導的基因治療能夠有效、穩定地改善P地貧的症狀，在轉基因小鼠長期觀察中沒有發現其他異常變化，為在體內評價基因治療的效果和安全性等問題提供了有效的手段。圖1是人P珠蛋白慢病毒表達載體構建示意圖。圖2是轉基因小鼠基因型鑑定PCR結果，依次為l、野生型小鼠；2、卩654小鼠；3、攜帶了人P珠蛋白基因的轉基因小鼠；4一6、攜帶了人P珠蛋白基因的0654轉基因小鼠FO、Fl和F2代。圖3是人p珠蛋白基因體內表達的mRNA分析，依次為l、正常小鼠；2、(3654小鼠;3、攜帶了人e珠蛋白基因的轉基因小鼠；4一6、攜帶了人e珠蛋白基因的(3654轉基因小鼠FO、Fl和F2代。圖4是人卩珠蛋白基因體內表達的蛋白質分析，依次為1、野生型小鼠；2、(3654小鼠;3、攜帶了人e珠蛋白基因的轉基因小鼠；4一6、攜帶了人e珠蛋白基因的6654轉基因小鼠FO、Fl和F2代。圖5是轉基因小鼠模型紅細胞形態和病理學改變，其中A為外周血塗片中耙型紅細胞和異型紅細胞的變化；B為脾臟病理切片中紅髓和白髓的變化；C為脾臟病理切片中髓外造血情況變化；D為肝臟組織切片中髓外血竇的變化；E為肝組織中鐵離子的沉積變化；F為骨髓組織增生度變化。具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本發明而非用於限定本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆實驗指南(第三版)》(J.薩姆布魯克等著，2003)中所述的條件進行。本發明中使用的廣"-654地中海貧血模型小鼠(以下簡稱[3654小鼠)從美國Jackson實驗室引進。該模型小鼠是通過基因敲除的方法用人P珠蛋白突變型等位基因pws—"—654替代小鼠的P—。r和P她。r基因而產生的雜合子小鼠，具有類似人類中間型pWS"'-柳地中海貧血的臨床表現。plvs—"，地中海貧血模型小鼠雄鼠與超排的野生型的雌鼠交配，採集受精卵用於顯微注射。以下實施例中，pcDNA3.1/Zeo(-)載體購自Invitrogen公司，具有CMV啟動子、BGHpoly(A)、以及Zeocin抗性標記基因。BP3.1載體按照賈春平等的文獻(JiaCP,etal.EffectsofhumanlocuscontrolregionelementsHS2andHS3onhumanbeta-globingeneexpressionintransgenicmouse.BloodCellsMolDis.2003,31(3):360-9)構建，該質粒載體具有p珠蛋白基因、(3珠蛋白基因啟動子和3末端增強子元件。FUGW-LMa載體按照謝書陽等的文獻(XieSY，etal.Restorationofthebalanced{alpha}/{beta}-globingeneexpressionin{beta}654-thalassemiamiceusingcombinedRNAiandantisense認Aapproach.HumMolGenet.2007，16(21):2616-25)構建，該質粒載體具有HI啟動子和一段幹擾片段序列。實施例1、人P珠蛋白基因慢病毒表達載體的構建和病毒包裝如圖1所示，構建人(5珠蛋白基因慢病毒表達載體，具體如下1.1、人P珠蛋白基因的克隆根據Genebank公布的人p珠蛋白((3—globin)的基因組序列，設計引物對HP1和HP2，其序列如下弓I物HP1:5'-AGGTTGCAGTGAGCTGAGAT-3';弓l物HP2:5'陽GCGAGCTTAGTGATACTTGT-3'。以正常人基因組DNA為模板，擴增人p珠蛋白基因片段(包括3個外顯子和2個內含子)，具體如下PCR反應體系2.5(al10xPCRbuffer,2^1MgCl2(25mM),2pldNTP(2.5mM),0.6^1引物(lOpmol/pl),0.2^1Taq酶(5U/nl),加雙蒸水至25^1。PCR反應條件94。C變性5min;(94°C45sec,60°C45sec，72°C60sec)X32個循環；72°C10min。反應結束後，按操作手冊，將PCR產物用賽百盛公司的膠回收試劑盒回收純化約1.5kb的產物。對回收的片斷經測序驗證具有SEQIDNO:1所示的DNA序列，即為人p珠蛋白基因片段。將卩-珠蛋白基因片段克隆到pcDNA3.1/Zeo(-)載體和(Takara)位點之間，然後用M;oI/A:/"I(Takara)雙酶切得到約1.4kb片段。1.2、人(3珠蛋白基因啟動子的克隆將BP3.1載體用A7^I/Mro1(Takara)雙酶切，回收約1.7kb的片段，回收的片段經測序驗證具有SEQIDNO:2所示的DNA序列，即為人卩珠蛋白基因啟動子。1.3、人(3珠蛋白基因慢病毒表達載體的構建將FUGW-LMa載體用力fll/i:，1(Takara)酶切，獲得7.9kb片段，其中包括LTR和HIV-1~。將以上l.l、1.2、1.3分別酶切得到的1.4kb、1.7kb以及7.9kb片段進行連接，獲得卩珠蛋白基因的慢病毒表達載體LBG，經測序其序列SEQIDNO:3所示，大小為11054bp。該LBG載體中包含人(3珠蛋白基因片段序列1.4Kb(包括3個外顯子和2個內含子)和1.7Kb的啟動子序列。1.4、病毒製備和包裝將慢病毒載體LBG與包裝結構基因質粒(pCMVAR9)和包裝外殼蛋白質粒(VSVG)(Invitrogen)共轉染人胚腎細胞293T(購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所)。轉染條件為將DNA/磷酸鈣(20昭DNA:60nl2M磷酸鈣，補水至50(Hil)混合加入2XHBSbuffer中，使用Promega公司轉染試劑盒轉染細胞293T。共轉染72小時後，收集包含病毒顆粒的上清，使用0.2pm的濾膜過濾，然後超速離心，26，000rpm，4°C，90min獲得濃縮的病毒顆粒懸液。實施例2、轉基因小鼠的製備將實施例1得到的LBG病毒顆粒分別注射進野生型小鼠和0654小鼠交配獲得的受精卵的卵周間隙(透明帶下)，每個受精卵注射5X10—、l的病毒懸液，然後將受精卵移植到假孕小鼠的輸卵管中，在宮內發育至出生，獲得兩種不同類型的原代轉基因小鼠模型。將原代小鼠FO與野生型小鼠交配而產生後代小鼠Fl、F2。實施例3、轉基因小鼠的鑑定小鼠出生後，剪取鼠尾抽提基因組DNA，然後進行PCR反應，設計LTR(檢測慢病毒)、p-major(檢測小鼠p-major基因)和p654引物檢測小鼠的基因型。PCR引物如下LTR-1:5'-GACTTACAAGGCAGCTGTAG-3';LTR-2:5'-GTACAGTCCGGATGCAGCTC-3'。產物長度586bpp-major-l:5'-AGGCAGCTCACAAGAAGAAG陽3';(3-major-2:5'-TGGAGACTGCTCCCTAGAAT-3'。產物長度421bpp654-1:5'-AGTGATAATTTCTGGGTTAAGGT-3';p654-2:5'-AGGGCCTAGCTTGGACTCAG-3'。產物長度179bpPCR反應條件:94。C變性5min;(94°C45sec，60°C45sec，72°C60sec)X32個循環；72°C10min。PCR產物用2X的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。如圖2所示，依次為1、對照野生型小鼠(即正常小鼠)(泳道l，僅擴增出(3-major—條帶)；2、對照(3654小鼠(泳道2，擴增出P-major和p^兩條帶)；3、攜帶了人p珠蛋白基因的轉基因小鼠(泳道3，擴增出慢病毒和p-major兩條帶)；4、攜帶了人P珠蛋白基因的P^轉基因小鼠(泳道4、5、6，即F0、Fl、F2代，擴增出慢病毒、(3-major和p^三條帶)。實施例4、轉基因小鼠後代的存活率比較將攜帶了人P珠蛋白基因的P^轉基因小鼠通過繁育獲得Fl和F2代，以(3654小鼠作為對照，統計其存活率，具體見表l表l、『4小鼠存活率比較tableseeoriginaldocumentpage8由表l的結果可見，在攜帶了人，珠蛋白基因的(3^轉基因小鼠的F1、F2後代中，存活的P^小鼠較單純P^小鼠後代顯著提高(50.053.1%vs.26.8%，PO.Ol)，說明人卩珠蛋白的表達可以起到有效的治療作用。實施例5、人e珠蛋白基因體內表達的mRNA分析從小鼠外周血抽提總RNA，逆轉錄後進行PCR擴增，檢測人p珠蛋白基因mRNA的轉錄剪接情況。設計PCR引物序列如下弓l物A:5'-CCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGA-3';引物B:5'-CAGCACGTTGCCCAGGAGCC-3'。PCR條件為94。C4min;(94。C45sec,70。C60sec)X32個循環;72°C10min。PCR產物用2X的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖3。由圖3的結果可知在攜帶人p珠蛋白的pMA轉基因小鼠體內有正常剪接的人(3珠蛋白片段合成，並且在FO、Fl和F2三代小鼠間保持穩定。實施例6、人P珠蛋白基因體內表達的蛋白質分析採集小鼠尾靜脈新鮮外周血，溶血後稀釋進行12MSDS-PAGE分離，然後將蛋白質電轉移至尼龍膜，加入一抗(鼠抗人|3珠蛋白單克隆抗體，Abnova公司)進行雜交(1:1000稀釋，4'C雜交2小時)，雜交結束後洗膜，再進行二抗(羊抗鼠IgG抗體，Rockland公司)雜交(1:1000稀釋，4'C雜交2小吋)，雜交結束後用DAB染色液顯色，蛋白電泳結果見圖4。由圖4的結果可知，在攜帶人P珠蛋白的轉基因小鼠體內可以合成正常的p珠蛋白，並且在F0、Fl和F2三代小鼠間保持穩定。通過RT-PCR、WesternBlotting方法分析外源基因在轉基因小鼠體內的表達情況，如圖3、4顯示，可見在攜帶了人(3珠蛋白基因的^54轉基因小鼠體內可以合成人珠蛋白正常剪接的mRNA和蛋白質，並且在F0、Fl和F2三代小鼠間保持穩定。實施例7、小鼠血液學指標分析採集小鼠尾靜脈新鮮外周血20^xl，用500pl白細胞稀釋液稀釋，然後在血細胞分析儀(Beckman-Coulter)上進行分析，檢測紅細胞數目、血紅蛋白濃度、平均紅細胞體積、平均紅細胞血紅蛋白濃度、網織紅細胞比例等，同時製備外周血塗片，觀察外周血中異型紅細胞和靶型紅細胞的比例，結果見表2和圖5-A。表2、轉基因小鼠血液學指標tableseeoriginaldocumentpage9其中組號為l、野生型小鼠；2、攜帶了人(3珠蛋白基因的|3654轉基因小鼠(F0);3、攜帶了人p珠蛋白基因的|3654轉基因小鼠(Fl);4、攜帶了人P珠蛋白基因的p654慢病毒轉基因小鼠(F2);5、0654小鼠。由表2和圖5-A可知，與卩654地貧小鼠(第5組)相比，在慢病毒載體整合了攜帶人卩珠蛋白基因的(3654地貧小鼠(第2—4組)中，血紅蛋白和紅細胞水平均顯著升高，外周血中異型紅細胞和靶型細胞的比例顯著下降，網織紅細胞數目減少，說明正常人(3珠蛋白的表達可以改善(3654地中海貧血的紅細胞生成障礙。實施例8、小鼠病理學觀察處死小鼠取出脾臟、肝臟和骨髓，按照常規病理切片製作方法製備脾臟和肝臟切片，進行HE染色，在顯微鏡下觀察髓外造血情況，骨髓進行推片進行瑞氏染色分析骨髓增生度情況，結果見圖5B-F。由圖5的結果可知，病理學觀察發現脾臟體積減小，紅髓減少，髓外造血減輕，肝臟中鐵離子沉積減少，說明慢病毒載體介導人e珠蛋白基因進行基因治療可以改善p^地貧小鼠的貧血症狀。同時，發明人對轉基因小鼠進行了長期的觀察，沒有發現任何其他異常的病理變化，說明慢病毒載體介導的基因治療具有很好的安全性。綜上所述，本發明的攜帶了人P珠蛋白基因的P^轉基因小鼠模型的基因組中穩定整合了慢病毒載體介導的人P珠蛋白基因，並且能持續穩定的表達，而且可以遺傳給後代並能維持原表達水平。發明人通過該轉基因小鼠模型，觀察到慢病毒載體介導的基因治療能夠有效、穩定地改善(3地貧的症狀，在轉基因小鼠長期觀察中沒有發現其他異常變化，這為臨床前的安全性研究提供了更多信息，這種製備慢病毒轉基因小鼠的方法還可以為其它疾病的基因治療提供借鑑。序列表〈110〉上海交通大學附屬兒童醫院〈120〉攜帶人P珠蛋白基因的PIVS-II-654轉基因小鼠模型的製備方法P5071081〈160〉3<170〉Patentlnversion3.3〈210〉〈211〉〈212〉<213〉11480腿human〈400〉1acatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccatggtgcatc60tgactcctgaggagaagtctgccgttactgccctgtggggcaaggtgaacgtggatgaag120ttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaag已caggtttaaggagacca180atagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactct240ctctgcctattggtctattttcccacccttaggctgctggtggtctacccttggacccag300aggttctttgagtcctttggggatctgtccactcctgatgctgttatgggcaaccctaag360gtgaaggctcatggcaagaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctcacctggac420aacctcaagggcacctttgccacactgagtgagctgcactgtgacaagctgcacgtggat480cctgagaacttcagggtgagtctatgggacgcttgatgttttctttccccttcttttcta540tggttaagttcatgtcataggaaggggataagtaacagggtacagtttagaatgggaaac600agacgaatgattgcatcagtgtgg犯gtctcaggatcgttttagtttcttttatttgctg660ttcataacaattgttttcttttgtttaattcttgctttctttttttttcttctccgcaat720ttttactattatacttaatgcctteiacattgtgtataacaaaaggaaatatctctgagat780acattaagtaacttaaaaaaaaactttacacagtctgcctagtacattactatttggaat840atatgtgtgcttatttgcatattcataatctccctactttattttcttttatttttaatt900gatacataatcsttatac已tatttatgggttaaagtgtaatgttttaatatgtgtacaca%0tattgaccaaatcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaa1020tatacttttttgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaat1080aatgatacaatgtatcatgcctctttgcaccattctaaagaataacagtgataatttctg1140ggttaaggcaatagcaatatctctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgat1200gtaagaggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttatttt1260atggttgggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgtt1320catacctcttatcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggccca1380tcactttggcaaagaattcaccccaccagtgcaggctgcctatcagaaagtggtggctgg1440tgtggctaatgccctggcccacaagtatcactaagctcgc1480〈210〉2〈211〉1671〈212〉■〈213〉hu,〈400〉2gctccagatagccatagaagaaccaaacactttctgcgtgtgtgagaataatcagagtga60gattttttcacaagtacctgatgagggttgagacaggtagaaaaagtgeigagatctctat120ttatttagcaataatagagaaagcatttaagagaataaagcaatggaaataagaaatttg180ta^atttccttctgataactagaaatagaggatccagtttcttttggttaacctaaattt240tatttcattttattgttttattttattttattttattttattttgtgtaatcgtagtttc300agagtgttag8gctgaaaggaagaagtaggagaaacatgcaaagtaaaagtataacactttccttact犯accgacatgggtttccaggtaggggcaggattcaggatgactgacagggc420ccttagggaacactgagaccctacgctgacctcataaatgcttgctacctttgctgtttt480aattacatcttttaatagcaggaagcagaactctgcacttcaaaagtttttcctcacctg540aggagtt犯tttagtacaaggggaa犯agtscaggggg已tgggag肌aggcgatcacgtt600ggg3agctatag3gaaagaagagta3已ttttagtaa^aggaggtttaaacaaacaaaatat660aaagagaaataggaacttgaatcaaggaaatgattttaaaacgcagtattcttagtggac720tagaggaaaaaaat犯tctgagccaagtagaagaccttttcccctcctacccctactttc780taagtcacagaggctttttgttcccccagacactcttgcagattagtccaggcagaaaca840gttagatgtccccagttaacctcctatttgacaccactgattaccccattgatagtcaca900ctttgggttgtaagtgactttttatttatttgtatttttgactgcattaagaggtctcta960gttttttatctcttgtttcccaaaacctaataagtaactaatgcacagagcacattgatt1020tgtatttattctatttttagacataatttattagcatgcatgagcaaattaagaaaaaca1080acaacaaatgaatgcatatatatgtatatgtatgtgtgtatatatacacacatatatata1140tatattttttcttttcttaccagaaggttttaatccaaat犯ggagaagatatgcttaga1200accgaggtagagttttcatccattctgtcctgtaagtattttgcatattctggagacgca1260ggaagagatccatctaceitatcccaaagctgaattatggtagacaaaactcttccacttt1320tagtgcatcaacttcttatttgtgtaataagaaaattgggaaaacgatcttcaatatgct1380taccaagctgtgattccaaatattacgtaaatacacttgcaaaggaggatgtttttagta1440gcaatttgtactgatggtatggggccaagagatatatcttagagggagggctgagggttt1500gaagtccaactcctaagccagtgccagaagagccaaggacaggtacggctgtcatcactt1560agacctcaccctgtggagccacaccctagggttggccaatctactcccaggagcagggag1620ggcaggagccagggctgggcataa^agtcagggcagagccatctattgctt1671〈210〉3〈211〉11054■<213〉human3gtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctg60atgccgcatagtt犯gccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagt120gcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgac犯ttgcatgaagaatc180tgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgac240attgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccett300atatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacg360acccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactt420tccattgacgtcaatgggtggagtatttacggta犯ctgcccacttggcagtacatcaag480tgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggc540attatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattag600tcatcgctattaccstggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggt660ttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggc720accaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaacixcgccccattgacgcaaatgg780gcggtaggcgtgtetcggtggg郷tctatataagcagcgcgttttgcctgtactgggtct840ctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgctt900aagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgac%0tctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtgg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37公開日2009年4月29日申請日期2007年10月24日優先權日2007年10月24日發明者曾凡一,曾溢滔,偉李,黃淑幀申請人:上海市兒童醫院