一種α-環糊精葡萄糖基轉移酶基因的克隆與表達的製作方法
2023-10-05 18:38:04 2
專利名稱：一種α-環糊精葡萄糖基轉移酶基因的克隆與表達的製作方法
技術領域：
一種a-環糊精葡萄糖基轉移酶(簡稱a-CGT酶)基因的克隆與表達，本發 明屬於酶基因工程和酶工程領域。具體地說涉及一種編碼軟化類芽孢桿菌 CPeam'6^77/ws附acerara) JFB05-01 a-CGT酶的DNA序列及其表達。
背景技術：
CGT酶是一個多功能型的酶，它能催化四種不同的反應三種轉糖基化反
應(歧化反應、環化反應和偶合反應)和水解反應。CGT酶通過環化反應能利用 澱粉生產環糊精，這是其工業應用的基礎。除了通過環化反應生產環糊精，最 近也用CGT酶催化偶合和歧化反應，轉移供體如澱粉或環糊精上的低聚糖到各 種受體分子上，得到各種特殊的低聚糖。通過催化不同受體分子的糖基化反應， 對諸如甜菊苷、橘皮苷、芸香苷、維生素C、鼠李糖、抗壞血酸等進行糖基化， 能顯著提高受體分子的功能性、水溶性、對化學物質的穩定性。另外，CGT酶 極限糊精的應用也被發現，它可應用於造紙工業中的表面施膠和塗布，能改善 紙張的書寫性能並具有光滑且適於印刷的表面。CGT酶也可用來處理生麵團， 通過CGT酶的歧化反應，能增加該麵團所製作的焙烤產品的體積。
生產CGT酶的微生物種類眾多，有芽孢桿菌、放線菌、微球菌、短桿菌、 麴黴、古細菌等。現在工業上生產環糊精所使用的CGT酶主要來自芽孢桿菌屬。 根據環化反應在起始階段所生成環糊精的主要類型不同，CGT酶可分為ou卩和 Y型CGT酶，即a-、 P-和Y-CGT酶。大部分CGT酶為卩型。
目前，許多CGT酶已經得到了純化，相應的CGT酶的編碼基因(^基因) 得到了克隆。由於能分泌CGT酶的野生菌株的生產能力普遍較低，為了克服野 生菌株的低生產能力，重組大腸桿菌在工業化生產CGT酶中己經在國外得到了
極大的重視。目前，誘導型啟動子P^、 Ptae、 Ptrp和PL已經廣泛應用於在重組大
腸桿菌中過量生產CGT酶，但是有關利用適宜載體和宿主對CGT酶進行胞外 表達的報導不多，重組CGT酶大多是作為一種包涵體在細胞內部進行積累的， 因此，這種包涵體的活化需要複雜的變性和重摺疊等關鍵過程，不利於工業化 生產。在國內，CGT酶的克隆與表達迄今為止鮮有報導，國內大部分研究者主 要致力於提高原始菌株的酶產量。
環糊精是由六個以上葡萄糖連結而成的具有環狀疏水圓錐形結構的低聚糖 非還原性化合物系列，其中最常用的是a-、 P-、 Y-環糊精，它們分別由6、 7、 8 個葡萄糖單元構成。目前，環糊精的工業化生產均採用酶法合成，即在CGT酶催化作用下，通過環化反應轉化澱粉及相關基質合成環糊精。由於環糊精能與 許多客體分子形成包合物，從而改變客體分子的物理和化學性質如溶解度、穩
定性等，因此在食品、醫藥、農業、紡織、環保、化妝品、生物技術和分析化 學等領域具有廣泛的應用。國際市場對環糊精的年需求已達到IO萬噸以上，國 內也已接近萬噸；僅製備醫藥片劑一項需求就達數千噸，而目前環糊精總產量 僅萬噸左右，國內僅700餘噸，而且絕大部分是P-環糊精，同時有少量的a-環 糊精和混合環糊精。隨著應用領域的不斷拓展，環糊精的需求量一直在逐年大 幅度增長，目前，環糊精的年增長率達到20% 30%。環糊精在各個工業領域中 的應用比例大致為食品工業80%、醫藥10%、農藥5~10%。
和P-環糊精、Y-環糊精結構相比，ct-環糊精最大的特點是具有更小的環結構 和更小的空腔，因此具有獨特的性質和特有的用途。 一般來說，a-環糊精可以復 合具有低分子量的分子或者包接脂肪族的側鏈。在食品工業上，能作為天然色 素、香料和維生素等的載體；能穩定食品中的某些成分，防止其揮發，抗氧化、 抗光和熱分解等；除去食品中的臭味和苦澀味；使某些食品形成長期穩定的乳 狀液等。特別值得注意的是，a-環糊精具有抗過敏作用，可抑制IgE抗體， 一些 含(x-環糊精的保健食品已經面市。食用該類產品可消除過敏，預防支氣管哮喘、 過敏性皮炎、鼻炎等症；(x-環糊精也是一種難消化膳食纖維，食後有降血糖的作 用。目前，由於P-環糊精的工業化生產比較成熟，價格較低，因此應用面最廣， 但是，許多研究證實，在一些場合(x-環糊精的使用效果明顯好於|3-環糊精。但 由於ct-環糊精的價格較高，限制了其廣泛的應用。
為了降低a-環糊精的商業成本，首先必須降低cc-CGT酶的生產成本。 屍eam'^d〃ws maceraws是最常用於a-CGT酶的工業化生產，但同樣存在生產能 力較低的缺陷。在以前的報導中，重組(x-CGT酶在大腸桿菌中一般定位於胞內 形成包涵體或存在於周質中，不利於重組a-CGT酶的回收與使用。因此，如何 使a-CGT酶基因在大腸桿菌中得到高效的胞外表達，對降低a-CGT酶的生產成 本顯得非常重要。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種a-CGT酶，其具有SEQ ID NO: 2所示的氨基 酸序列。本發明的另一個目的是提供一種編碼該a-CGT酶的DNA分子，所述 的DNA分子具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
本發明的再一個目的是提供包含本發明基因的表達載體。 本發明的又一個目的是提供包含本發明表達載體的宿主細胞。 本發明的技術方案 一種a-環糊精葡萄糖基轉移酶，縮寫為a-CGT酶，其 胺基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
所述的a-環糊精葡萄糖基轉移酶的基因，縮寫為c^基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。
所述的基因的表達方法由軟化類芽孢桿菌CPeam'6ac/〃w wacerara) JFB05-01總DNA獲得cgf基因SEQ ID NO:l ， eg/基因以質粒pET20b(+)為表達 載體，以￡. cc^BL21(DE3)為表達宿主，實現cg基因的高效表達；
(1 )軟化類芽孢桿菌CPea"沾"c/〃usJFB05-01總DNA的提取。
P附acerara JFB05-01菌株在LB液體培養基(蛋白腖10 g/L，酵母膏5 g/L， NaC110g/L)中培養2天，10000rpm離心收集菌體，無菌水洗滌，收集沉澱懸 浮於500pL Tris-EDTA (三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)緩衝液，加入15pL 溶菌酶，37。C下保溫30 min，再加入5^iL RNA酶，37。C下保溫30 min，加入30pL 10%SDS (十二烷基硫酸鈉)和15^L蛋白酶K, 37。C下保溫60 min，加入100pL NaCl (5M)和80mLCTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，65。C下保溫20 min，用 700(iL的酚氯仿異戊醇體積比25 : 24 : 1混合溶劑抽提，10000rpm離心， 上清液用700pL的氯仿異戊醇體積比24 : 1抽提，10000rpm離心，上清液用 1400nL體積的冰異戊醇混合，-2(TC沉澱30min， 10000rpm離心，沉澱加200pL 70%乙醇清洗，10000rpm離心，沉澱用Tris-EDTA緩衝液溶解，即得到/1 macerara JFB05-01總DNA。
(2) a-CGT酶編碼基因的克隆
以P wacerara JFB05-01總DNA為模版，以下列核苷酸序列作為引物，下
劃線為酶切位點7Vco I和￡coR I， PCR擴增cgf基因。
弓I物1: 5 ， -CCATATgTCCATggATTCACCCgATACgAgC - 3'
引物2: 5 ， -CTCgAgAgAATTCggATTTTgCCAgTCCAC 一 3 ，
pcr反應在50pL體系中進行5xPCR緩衝液10 mL， 2.5 mmol/L dNTPs 4
^L， lOpmol/L上下遊引物各lpL，模板DNAlpL， Taq酶0.5 (iL，加雙蒸水
至總體系50pL;
反應條件為在94 'C變性4min後開始循環，然後94 'C變性lmin， 55 °C 退火lmin， 72。C延伸2min，共35個循環後，再於72 T延伸10min，擴增得到 2061 bp的PCR片段，割膠回收，回收片斷與pMD18-T simple載體連接，連接 產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物塗布含100 mg/L氨苄青黴素的LB平板， 經37"C培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，8 10h後提取質粒。命名 為cg/pMD18-Tsimple,將此質粒進行序列測定。
(3) c^基因的改造
以c^/pMD18-T simple為模板進行定點突變PCR，以消除基因內部的臉o I 位點，設計引物
引物3: 5 ， -C認gTgggTCCCAC認g四CCAgCC - 3 ， 弓I物4: 5 ， —ggCTggCCCATJg!gggACCCACATTg — 3'PCR反應在50^L體系中進行，5xPCR緩衝液10 fxL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 ^L， 10 pmol/L上下遊引物各1 nL，模板cgf/pMD18-T simple 1 (iL，Taq酶0.5 (iL， 加雙蒸水至總體系50pL;
反應條件為在94 'C變性4min後開始循環，然後94 'C變性lmin， 55 "C退 火lmin， 72 "C延伸5min，共35個循環後，再於72 t:延伸10min，將PCR產 物轉化E.co// JM109感受態細胞，轉化後的菌體塗布100 mg/L氨節青黴素LB 平板，培養挑選單菌落接入100mg/L氨苄青黴素LB液體培養基，經37'C培養 過夜，抽提質粒，將突變後的質粒進行序列測定。
(4) cg基因在表達載體上的構建 用於構建表達載體的質粒是pET20b(+)，帶有評/B信號肽和His-tag標記，
將pET20b(+)質粒和擴增的基因進行iVco I和五coR I雙酶切，酶切產物割膠 回收後，再用T4連接酶16。C連接過夜，連接產物轉化五.co/z'JM109感受態細胞， 經37'C培養過夜，挑選轉化子於100mg/L氨苄青黴素LB進行液體培養，然後 抽提質粒，得到富集的cg/pET20b(+)質粒(圖l)。
(5) 大腸桿菌宿主轉化和篩選重組菌
將質粒cgf/pET20b(+)熱擊轉化co//BL21 (DE3)宿主菌，再100 mg/L氨苄 青黴素-LB平板上經37。C培養過夜，挑選含質粒cgf/pET20b(+)的￡. co// BL21 (DE3)轉化子在LB培養基中37'C液體培養過夜，後接入TB發酵液體培養基(甘 油5g/L，蛋白腖12g/L,酵母膏24g/L， K2HP04 12.54 g/L， KH2P042.31 g/L)， 3(TC培養至OD達0.6後用終濃度O.Ol一IPTG (異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷)誘 導，降溫至25。C培養，90h時產a-CGT酶達22.5U/mL。
(6) 重組a-CGT酶的純化和特性。 將上述a-CGT酶發酵液於4 。C、 10000 rpm離心20min除菌體；上清液中
加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4 。C、 10000 rpm離心20min，取沉澱物用適量 含20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉、20mM咪唑、pH7.4的緩衝液A溶解，並在緩 衝液A中透析過夜後，通過0.22(im膜過濾後製成上樣樣品；Ni親和柱用緩衝液A 平衡後，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附後，分別用緩衝液A、含20-480mM 咪唑的緩衝液A、含480mM咪唑的緩衝液A洗脫，流速l mL/min，檢測波長為280 nm，分部收集含a-CGT酶酶活的洗脫液；活力組分在50 mM磷酸鈉緩衝液(p1^6) 中透析過夜後，得純化a-CGT酶酶製品。純化後重組a-CGT酶達到電泳純，表觀 分子量70000道爾頓。純化過程電泳圖見圖2。
本發明的有益效果本發明提供了 基因的高效表達方法。提取P wacera"s JFB05-01總DNA，設計引物PCR得到編碼a-CGT酶的基因，它具有 SEQIDNO:l所示的核苷酸序列，全長2061個核苷酸，編碼687個胺基酸。以 質粒pET20b(+)為表達載體，以五.co/ZBL21(DE3)為表達宿主，可實現cgf基因的高效表達，重組酶具有環化活性。該a-CGT酶的最適溫度為40~45°C，最適 pH5.5，在4(TC下具有較高的熱穩定性，在5(TC以上熱穩定性較差。此酶適合 食品、醫藥等工業應用的需要，能用於a-環糊精和卩-環糊精的工業生產。 生物材料樣品保藏
軟化類芽孢桿菌CPeam'Z)a"7/w wacerara) JFB05-01已保藏於中國典型培養 物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏日期2008年4月24日，保藏編號CCTCCNO: M 208063 。
圖1用於生產重組a-CGT酶的c^/pET20b(+)質粒。
圖2重組a-CGT酶分離純化SDS-PAGE圖譜。
1、發酵上清液；M、標準蛋白分子量；2、通過Ni柱純化後樣品。
圖3重組a-CGT酶最適溫度(以可溶性澱粉為底物)。
圖4重組a-CGT酶最適pH (以可溶性澱粉為底物)。
pH3-6，使用檸檬酸緩衝液；pH6-8，使用磷酸鈉緩衝液；pH8-11,使用甘 氨酸/氫氧化鈉緩衝液。
圖5重組a-CGT酶在40°C ( )， 45°C O)和50°C (A)下的穩定性研究(以可 溶性澱粉為底物)。
具體實施例方式
實施例1
本實施例說明軟化類芽孢桿菌(屍eam'k cz7/w macerara) JFB05-01總DNA的提取。
wacerara JFB05-01菌株在LB液體培養基(蛋白腖10 g/L，酵母膏5 g/L， NaCUOg/L)中培養2天，10000rpm離心收集菌體，無菌水洗滌，收集沉澱懸 浮於500nL Tris-EDTA (三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)緩衝液，加入15pL 溶菌酶，37。C下保溫30 min，再加入5pLRNA酶，37匸下保溫30 min，加入30pL 10%SDS (十二烷基硫酸鈉)和15pL蛋白酶K， 37t:下保溫60min，加入lOO^L NaCl (5M)和80^iLCTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，65。C下保溫20 min，用 700pL的酚氯仿異戊醇體積比25 : 24 : 1混合溶劑抽提，10000rpm離心， 上清液用700nL的氯仿異戊醇體積比24 : 1抽提，10000rpm離心，上清液用 1400nL體積的冰異戊醇混合，-20°(:沉澱301^11， 10000rpm離心，沉澱加200|iL 70%乙醇清洗，10000rpm離心，沉澱用Tris-EDTA緩衝液溶解，即為P JFB05-01總DNA。 實施例2
本實施例說明a-CGT酶編碼基因的克隆程序。
以P Amjrcerara JFB05-01總DNA為模版，以下列核苷酸序列作為引物，下劃線為酶切位點iVco I和￡coR I， PCR擴增eg基因。
引物1: 5 ， -CCATATgTCCATggATTCACCCgATACgAgC - 3 ， 引物2: 5 ， "CTCgAgAgMEIQggATTTTgCCAgTCCAC — 3 ，
PCR反應在50^L體系中進行5xPCR緩衝液10 pL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 pL，
10 (imol/L上下遊引物各1 pL,模板DNA 1 (iL， Taq酶0.5 pL，加雙蒸水至總
體系50 ^L;
反應條件為在94'C變性4min後開始循環，然後94'C變性lmin， 55 "C退 火lmin， 72'C延伸2min，共35個循環後，再於72 。C延伸10min。擴增得到大 約2100bp的PCR片段，割膠回收。回收片斷與pMD18-T simple載體連接，連 接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物塗布含100 mg/L氨節青黴素的LB平板。 經37。C培養過夜，平板上長了大約十幾個菌落，挑四個菌落，接入LB液體培 養基，10h後提取質粒。將此質粒進行序列測定，結果表明插入片段含有一個 長2061bp的開放閱讀框(ORF)，編碼一個由687個胺基酸編碼的蛋白質。
實施例3
本實施例說明c^基因的改造程序。
由於在目標基因內部存在一個^co I酶切位點，而基因兩端分別為iVco I和 五"RI位點，所以設計引物將iVcoI位點突變去除，以方便下步的克隆表達。 以連接了 c^基因的pMD18-T simple載體為模板進行定點突變PCR，設計引物
引物3: 5 ， ~CAATgTgggTCCCAQAATgggCCAgCC _ 3 ，
弓l物4: 5,-ggCTggCCCATIglgggACCCACATTg- 3'
PCR反應在50nL體系中進行，5xPCR緩衝液10|iL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 HL， 10 pmol/L上下遊引物各1 &，模板cg/pMD18-T simple 1 |iL，Taq酶0.5 jiL， 加雙蒸水至總體系50piL;
反應條件為在94。C變性4min後開始循環，然後94 。C變性lmin， 55 。C退 火lmin， 72。C延伸4min，共35個循環後，再於72"C延伸10min。將PCR產 物轉化Eco// JM109感受態細胞。轉化後的菌體塗布100 mg/L氨苄青黴素LB 平板，挑選單菌落接入100 mg/L氨苄青黴素LB液體培養基經37"C過夜培養， 抽提質粒，將突變後的質粒進行序列測定，結果正確，驗證了已經成功突變去 除WcoI位點。
實施例4
本實施例說明cg基因在表達載體上的構建程序。
用於構建表達載體的質粒是pET20b(+)，帶有pe氾信號肽和His-tag標記。 將pET20b(+)質粒和cg 基因進行AAco I和&oR I雙酶切，酶切產物割膠回收後， 再用T4連接酶16。C連接過夜，連接產物轉化JM109感受態細胞，經37 'C培養過夜，挑選轉化子於100mg/L氨苄青黴素LB進行液體培養，然後抽提質粒，得到富集的c^/pET20b(+)質粒(圖l)。 實施例5
本實施例說明大腸桿菌宿主轉化和篩選重組菌的程序。
將質粒cg/pET20b(+)熱擊轉化co// BL21 (DE3)宿主菌，再氨苄青黴素 (100 mg/L)-LB平板上經37。C培養過夜，挑選轉化子(含c^/pET20b(+)的五.co// BL21 (DE3))在LB培養基中37'C液體培養過夜，後接入TB發酵液體培養基(甘 油5g/L，蛋白腖12g/L，酵母膏24g/L, K2HP04 12.54 g/L， KH2P042.31 g/L) 30。C培養至OD達0.6後用終濃度0.01 ^MIPTG (異丙基硫代-P-D-半乳糖苷) 誘導，降溫至25-C培養，90h時產酶達22.5U/mL。
實施例6
本實施例說明a-CGT酶的純化和特性。
將上述a-CGT酶發酵液於4 'C、 10000 rpm離心20 min除菌體；上清液中 加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4 °C、 10000 rpm離心20min,取沉澱物用適量 含20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉、20mM咪唑、pH 7.4的緩衝液A溶解，並在緩 衝液A中透析過夜後，通過0.22pim膜過濾後製成上樣樣品；Ni親和柱用緩衝液A 平衡後，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附後，分別用緩衝液A、含20-480mM 咪唑的緩衝液A、含480mM咪唑的緩衝液A洗脫，流速l mL/min，檢測波長為280 nm，分部收集含a-CGT酶酶活的洗脫液；活力組分在50 mM磷酸鈉緩衝液(p1^6) 中透析過夜後，得純化a-CGT酶酶製品。純化後重組a-CGT酶達到電泳純，表觀 分子量70000道爾頓。純化過程電泳圖見圖2。
以可溶性澱粉為底物時，a-CGT酶的最適溫度為40 45'C (圖3)，最適pH 5.5 (圖4),在4(TC下具有較高的熱穩定性，在50°C以上熱穩定性較差(圖5)。序歹寸表
SEQIDNO: 1
tcacccgatacgagcgtggacaacaaggtc￡L￡LtttC￡Lgta<cggacgtcatctatcaigatt60
gtgaccgaccgcttcgcggacggggacaggacgaacaatccggcgggggatgcgttcagc120
ggcgaccgatcc犯tttgaagctctatttcggggg卿ctggcaggggattatcgacaag180
attaacgacggttatttgaccggcatgggcgtcaccgccctctggatatcccagcctgtg240
gaa犯t8tcEicctccgtcatcaagtattccggcgtt已已caatacgtcttatcacggttac300
tgggcgagggattttaagcagctttcggggattttgccgattttcaaaat360
ctgattgatacggctcacgctC3t犯C3tC卿gtcgtg已tcgacttcgcCCCC38CCEIC420
acgtctccggccgacagggacaaccccggcttcgccgagaacggtgcgctgtstgataac480
ggttcgctgctcggcgcctacagcaalgatacggccggccttttccatcataacgggggg540
accgatttttccacgattga3gacggtatttaca^gaacctctacgacctggcggacatc600
aaccataacaac犯cgctatggacgcttatttt犯a3gcgctatcgacctttggctcggc660
atgggtgtggacgggattcgttttgacgcggtg犯gcatatgcctttcggctggcaaaaa720
agcttcgtttcctcgatttacggcggcgatcatccggtatttacgttcggggaatggtat780
cttggcgcggatcaaaccga3tt犯attcgccaacgaaagcgggatgaac840
ctgctggactttgaatacgcgc已gg鄉tgcgcgaagtgttccgggacaaaacggaaeicg900
atgaaggatctctatgaggtgctggccagcacggagtcgcaatacgactscatcaacaat960
stggtgaccttcatcgscaaccatgatatggaccggttccaggttgccggttccggtacg1020
cgggcgaccgagcaagcgttggcgctgacgctgacttcccgcggcgtgccagccatctac1080
t￡lCggC3Cgg￡LgC￡LgtELC3tgaccggcgstggcgacccca3caaccgggcg3tg3tg3CC1140
tcgtttaataccgggacgacggctt3ta^gtgattcaggcattggcgccgctgcgtaaa1200
tccaatccggccatcgcttatgggacgacgacagagcgctgggttaacaacgatgtgttg1260
eittgittg^cgC肪3ttCggcagcagcgccgctttggtggcgattaatcgaaactcgtcc1320
gccgcttatccgatttcgggtctgttgagttcgctgccggcgggcacttattcggatgta1380
ttgaacggactctt犯eicggc已actccattaccgtgggcagcggcggcgccgtcaccaac1440
tttacgctggcggccggcggcacggcggtatggcagtacacagcgccggaaacgtcgccg1500
gcgatcggca3tgtgggtCCcaccatgggccagccggggaatateigtgacgattgacggc1560
cgcggctttggcggcacggcgggcacggtttatttcgggacgacggcggtgaccggctcc1620
ggcatcgtaagctgggaggacacgcagatt33ggCggtC3t3CCg33ggtcgcggcgggc1680
aa,gggcgtatcggtcaaaacgtcgtccggcaccgccagcaatacattcaaaagcttc1740
aatgtactgacgggggatcaggtcacggtgcgtttcctggtcaatcaagccaataccaat1800
tacggaacaaatgtttatcttgtcggcaacgccgccgagctcggctcctgggacccgaac1860
aaagcgattgggccgatgtacaatcaggtgatcgccaagtacccgtcctggtattacgat1920gtcagcgtgc cggcggggac aaagctggat gtgacttggg aaggcggggg caaccatacg gtgacggtgg actggcaaaa t
tttaaattta ttaaaaaggg cggcggtacg 1980 tacacgacgc cggccagcgg cgtagggacg 2040
2061
SEQ ID NO: 2
Ser Pro Asp Thr Ser 5
Val lie Tyr Gin lie 20
Thr Asn Asn Pro Ala 35
Leu Lys Leu Tyr Phe 50
lie Asn Asp Gly Tyr 65
lie Ser Gin Pro Val 80
Gly Val Asn Asn Thr 95
L>ys Gin Thr Asn Asp 110
Leu lie Asp Thr Ala 125
Phe Ala Pro Asn His 140
Phe Ala Glu Asn Gly 155
Ala Tyr Ser Asn Asp 170
Thr Asp Phe Ser Thr 185
Asp Leu Ala Asp lie 200
Phe Lys Ser Ala lie 215
Val Asp Asn Lys Val 10
Val Thr Asp Arg Phe 25
Gly Asp Ala Phe Ser 40
Gly Gly Asp Trp Gin 55
Leu Thr Gly Met Gly 70
Glu Asn lie Thr Ser 85
Ser Tyr His Gly Tyr 100
Ala Phe Gly Asp Phe 115
His Ala His Asn lie 130
Thr Ser Pro Ala Asp 145
Ala Leu Tyr Asp Asn 160
Thr Ala Gly Leu Phe 175
lie Glu Asp Gly lie 190
Asn His Asn Asn Asn 205
Asp. Leu Trp Leu Gly 220
Asn Phe Ser Thr Asp 15
Ala Asp Gly Asp Arg 30
Gly Asp Arg Ser Asn 45
Gly lie lie Asp Lys 60
Val Thr Ala Leu Trp 75
Val lie Lys Tyr Ser 90
Trp Ala Arg Asp Phe 105
Ala Asp Phe Gin Asn 120
Lys Val Val lie Asp 135
Arg Asp Asn Pro Gly 150
Gly Ser Leu Leu Gly 165
His His Asn Gly Gly 180
Tyr Lys Asn Leu Tyr 195
Ala Met Asp Ala Tyr 210
Met Gly Val Asp Gly 225
12lie Arg Phe Asp Ala 230Ser Phe Val Ser Ser 245Phe Gly Glu Trp Tyr 260lie Lys Phe Ala Asn 275Tyr Ala Gin Glu Val 290Met Lys Asp Leu Tyr 305Asp Tyr lie Asn Asn 320Asp Arg Phe Gin Val 335Ala Leu Ala Leu Thr 350Tyr Gly Thr Glu Gin 365Arg Ala Met Met Thr 380Val lie Gin Ala Leu 395Ala Tyr Gly Thr Thr 410lie lie Glu Arg Lys 425Asn Arg Asn Ser Ser 440Ser Leu Pro Ala Gly 455Asn Gly Asn Ser lie 470Val Lys His Met Pro 235lie Tyr Gly Gly Asp 250Leu Gly Ala Asp Gin 265Glu Ser Gly Met Asn 280Arg Glu Val Phe Arg 295Glu Val Leu Ala Ser 310Met Val Thr Phe lie 325Ala Gly Ser Gly Thr 340Leu Thr Ser Arg Gly 355Tyr Met Thr Gly Asp 370Ser Phe Asn Thr Gly 385Ala Pro Leu Arg Lys 400Thr Glu Arg Trp Val 415Phe Gly Ser Ser Ala 430Ala Ala Tyr Pro lie 445Thr Tyr Ser Asp Val 460Thr Val Gly Ser Gly 475Phe Gly Trp Gin Lys 240His Pro Val Phe Thr 255Thr Asp Gly Asp Asn 270Leu Leu Asp Phe Glu 285Asp Lys Thr Glu Thr 300Thr Glu Ser Gin Tyr 315Asp Asn His Asp Met 330Arg Ala Thr Glu Gin 345Val Pro Ala lie Tyr 360Gly Asp Pro Asn Asn 375Thr Thr Ala Tyr Lys 390Ser Asn Pro Ala lie 405Asn Asn Asp Val Leu 420Ala Leu Val Ala lie 435Ser Gly Leu Leu Ser 450Leu Asn Gly Leu Leu 465Gly Ala Val Thr Asn 480Phe Thr Leu Ala Ala 485Pro Glu Thr Ser Pro 500Gin Pro Gly Asn lie 515Thr Ala Gly Thr Val 530Gly lie Val Ser Trp 545Lys Val Ala Ala Gly 560Gly Thr Ala Ser Asn 575Asp Gin Val Thr Val 590Tyr Gly Thr Asn Val 605Ser Trp Asp Pro Asn 620lie Ala Lys Tyr Pro 635Gly Thr Lys Leu Asp 650Val Thr Trp Glu Gly 665Ser Gly Val Gly Thr 680Gly Gly Thr Ala Val 490Ala lie Gly Asn Val 505Val Thr lie Asp Gly 520Tyr Phe Gly Thr Thr 535Glu Asp Thr Gin lie 550Lys Thr Gly Val Ser 565Thr Phe Lys Ser Phe 580Arg Phe Leu Val Asn 695Tyr Leu Val Gly Asn 610Lys Ala lie Gly Pro 625Ser Trp Tyr Tyr Asp 640Phe Lys Phe lie Lys 655Gly Gly Asn His Thr 670Val Thr Val Asp Trp 685Trp Gin Tyr Thr Ala 495Gly Pro Thr Met Gly 510Arg Gly Phe Gly Gly 525Ala Val Thr Gly Ser 540Lys Ala Val lie Pro 555Val Lys Thr Ser Ser 570Asn Val Leu Thr Gly 585Gin Ala Asn Thr Asn 600Ala Ala Glu Leu Gly 615Met 'Tyr Asn Gin Val 630Val Ser Val Pro Ala 645Lys Gly Gly Gly Thr 660Tyr Thr Thr Pro Ala 675Gin Asn 68權利要求
1. 一種α-環糊精葡萄糖基轉移酶，縮寫為α-CGT酶，其胺基酸序列如SEQID NO2所示。
2、 一種編碼權利要求1所述的a-環糊精葡萄糖基轉移酶的基因，縮寫為 基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。
3、 一種如權利要求2所述的a-環糊精葡萄糖基轉移酶基因的表達方法，其 特徵是由軟化類芽孢桿菌CPeam'6acz'〃w macerara) JFB05-01總DNA獲得c^基 因SEQ ID NO: 1 ， 基因以質粒pET20b(+)為表達載體，以co// BL21 (DE3) 為表達宿主，實現c^基因的高效表達；(1) 軟化類芽孢桿菌CPeam'6a"7/w w"cerara) JFB05-01總DNA的提取屍macera似JFB05-01菌株在LB液體培養基中培養2天，10000rpm離心收 集菌體，無菌水洗滌，收集沉澱懸浮於50(HiLTris-EDTA緩衝液，加入15pL溶 菌酶，37。C下保溫30min，再加入5^iLRNA酶，37。C下保溫30 min，加入30pL 10%十二垸基硫酸鈉溶液和15i!L蛋白酶K,37-C下保溫60min，加入100pL5M 的NaCl溶液和80^L十六烷基三甲基溴化銨，65'C下保溫20 min，用700pL的 酚氯仿異戊醇體積比25 : 24 : 1混合溶劑抽提，10000rpm離心，上清液用 700pL的氯仿異戊醇體積比24 : 1混合溶劑抽提，10000rpm離心，上清液用 1400pL體積的冰異戊醇混合，-20°(:沉澱301^11， 10000rpm離心，沉澱加200(iL 70%乙醇清洗，10000rpm離心，沉澱用Tris-EDTA緩衝液溶解，即得到P wacerara JFB05-01總DNA;(2) a-CGT酶編碼基因的克隆以P macerara JFB05-01總DNA為模版，以下列核苷酸序列作為引物，下劃線為酶切位點7Vco I和五coR I， PCR擴增cg基因；引物1: 5 ， -CCATATgTCCATggATTCACCCgATACgAgC — 3 ，引物2: 5 ， "CTCgAgAgMIICggATTTTgCCAgTCCAC - 3 ，PCR反應在50^L體系中進行5xPCR緩衝液10 pL， 2.5 mmol/L dNTPs 4HL， 10 ^irnol/L上下遊引物各1 ^L，模板DNA 1 ^L， Taq酶0.5 pL，加雙蒸水至總體系50 ^L;反應條件為在94。C變性4min後開始循環，然後94 。C變性lmin， 55 °C 退火lmin， 72T:延伸2min,共35個循環後，再於72'C延伸10min，擴增得到 2061 bp的PCR片段，割膠回收，回收片斷與pMD18-T simple載體連接，連接 產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物塗布含100 mg/L氨苄青黴素的LB平板， 經37'C培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，8 10h後提取質粒，命名 為cg/pMD18-T simple,將此質粒進行序列測定；(3) C^基因的改造以cg/pMD18-T simple為模板進行定點突變PCR，以消除基因內部的7Vco I位點，設計引物引物3: 5，—CAATgTgggTCCCACAATgggCCAgCC —3，弓l物4: 5， -ggCTggCCCATIglgggACCCACATTg- 3'PCR反應在50nL體系中進行，5xPCR緩衝液10 pL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 ^iL， 10 )imol/L上下遊引物各1〖iL，模板cgf/pMD18-T simple 1 |iL，Taq酶0.5 )iL， 加雙蒸水至總體系50 ^L;反應條件為在94 。C變性4min後開始循環，然後94 。C變性lmin， 55 'C退 火lmin， 72 。C延伸5min，共35個循環後，再於72 。C延伸10min，將PCR產 物轉化五.co" JM109感受態細胞，轉化後的菌體塗布100 mg/L氨苄青黴素LB 平板，培養挑選單菌落接入100mg/L氨苄青黴素LB液體培養基，經37i:培養 過夜，抽提質粒，將突變後的質粒進行序列測定；(4) c-基因在表達載體上的構建 用於構建表達載體的質粒是pET20b(+)，帶有pe/B信號肽和His-tag標記，將pET20b(+)質粒和擴增的基因進行7Vco I和￡coR I雙酶切，酶切產物割膠 回收後，再用T4連接酶16"C連接過夜，連接產物轉化五.co//JM109感受態細胞， 經37'C培養過夜，挑選轉化子於100mg/L氨苄青黴素LB進行液體培養，然後 抽提質粒，得到富集的cg/pET20b(+)質粒；(5) 大腸桿菌宿主轉化和篩選重組菌將質粒cg/pET20b(+)熱擊轉化￡. co// BL21 (DE3)宿主菌，再100 mg/L氨苄 青黴素-LB平板上經37。C培養過夜，挑選含質粒crg/pET20b(+)的co// BL21 (DE3)轉化子在LB培養基中37'C液體培養過夜，後接入TB發酵液體培養基， 3CTC培養至OD達0.6後用終濃度0.01 異丙基硫代-P-D-半乳糖苷誘導，降溫 至25。C培養，90h時產a-CGT酶達22.5 U/mL;(6) 重組a-CGT酶的純化和特性 將上述a-CGT酶發酵液於4。C、 10000 rpm離心20min除菌體；上清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4'C、 10000 rpm離心20min，取沉澱物用適量 含20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉、20mM咪唑、pH 7.4的緩衝液A溶解，並在 緩衝液A中透析過夜後，通過0.22pm膜過濾後製成上樣樣品；Ni親和柱用緩 衝液A平衡後，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附後，分別用緩衝液A、含 20-480 mM咪唑的緩衝液A、含480mM咪唑的緩衝液A洗脫，流速1 mL/ min， 檢測波長為280 nm，分部收集含a-CGT酶酶活的洗脫液；活力組分在pH-6、 50 mM磷酸鈉緩衝液中透析過夜後，得純化a-CGT酶酶製品。
全文摘要
一種α-環糊精葡萄糖基轉移酶(簡稱α-CGT酶)基因的克隆與表達，屬於酶基因工程和酶工程領域。本發明由軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01總DNA獲得cgt基因SEQ ID NO1，cgt基因以質粒pET20b(+)為表達載體，以E.coli BL21(DE3)為表達宿主，實現cgt基因在胞外的高效表達；該cgt基因全長2061個核苷酸，編碼687個胺基酸，構建了原核表達質粒，轉化大腸桿菌表達α-CGT酶。重組酶具有環化活性，能轉化澱粉及相關基質成環糊精。該重組α-CGT酶的最適溫度為40～45℃，最適pH 5.5，在40℃下具有較高的熱穩定性，在50℃以上熱穩定性較差。此酶適合食品、醫藥等工業應用的需要，能用於α-環糊精和β-環糊精的工業生產。
文檔編號C12N9/10GK101294149SQ20081002416
公開日2008年10月29日 申請日期2008年5月14日 優先權日2008年5月14日
發明者敬 吳, 成 成, 彬 李, 李兆豐, 堅 陳 申請人:江南大學