葡聚糖內切酶以及含有該酶的纖維素酶製劑的製作方法

2023-10-05 18:42:14 2

專利名稱：葡聚糖內切酶以及含有該酶的纖維素酶製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及葡聚糖內切酶以及含有該酶的纖維素酶製劑，以及利用該製劑去除含纖維素纖維細毛、減量加工和斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色加工。
為了使含纖維素纖維具有所期望的特性，要用纖維素酶對這樣的纖維進行處理。例如，在紡織界中為了改善含纖維素纖維與皮膚的觸感和其外觀，以及為了賦予染色斜紋粗棉布中含纖維素纖維具有磨石水洗(スト-ンウオッシュ)的外觀，就利用纖維素酶對這樣的纖維進行處理。
另外，近年來，作為來自木材紙漿的纖維素用有機溶劑溶解、紡線而製成的再生纖維素系纖維的Tencel由於它的高的強度、吸水度等性質，同時其製造方法又不容易引起環境汙染，所以一直受到人們的注目。然而由於Tencel在製造過程中產生細毛，所以直接作為纖維的商品價值低。因此，利用纖維素酶除去製造過程中產生的細毛的方法的提案不斷提出。
現在，處理含纖維素纖維使用的纖維素酶主要來自木材不朽菌木黴菌Trichoderma或黴質菌Humicola。然而，為了使纖維達到所期望的效果，目前的狀況是必須使用很多的這類纖維素酶。
如果能夠通過使用比以前用量少的高活性的纖維素酶改善含纖維素纖維的觸感和外觀，賦予染色斜紋粗棉布中含纖維素纖維具有磨石水洗的外觀，並除去Tencel的細毛的話，就能夠進一步降低這些處理中的成本。
來自Humicola菌的纖維素酶在WO91/17243號公報(特表平5-509223號公報)中已有報導，43kD的葡聚糖內切酶基因已從Humicolainsolens DSM1800菌株中分離出來，並確定了其鹼基序列。
本發明人從Humicola insolens菌中分離出了對各種含有纖維素的纖維的處理非常有用的新的高活性的纖維素酶及其基因。本發明是基於上述認識的產物。
因此，本發明的目的在於提供新的高活性的纖維素酶及其基因。
另外，提供利用新的纖維素酶除去含纖維素纖維細毛的方法，減量加工方法以及斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色加工方法也是本發明的目的。
而本發明的新的纖維素酶是序列1記載的胺基酸序列的一部分或含有1～284號序列的蛋白質和其變化的蛋白質。
本發明的含纖維素纖維細毛的除去方法，減量加工方法以及斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色加工方法中包括使上述蛋白質或其變化蛋白質與染色的斜紋粗棉布中含纖維素纖維接觸的工序。
微生物的保藏用含有本發明的的纖維素酶基因質粒pNCE4Sal(參見實施例A5)轉化的大腸桿菌JM109菌株保藏於通商產業省工業技術院生命工程工業技術研究所(日本國茨城縣筑波市東1-1-3)，保藏號為FERM BP-5976(原保藏號FERM P-15732，原保藏日1996年7月12日)。
纖維素酶及其基因本發明的纖維素酶是具有序列1記載的胺基酸序列的一部分或含有1～284號序列的蛋白質。本發明中所謂序列1記載的胺基酸序列的一部分是指可用作探針程度的序列長度，而且即使是其中的一部分序列也仍然具有纖維素酶的活性，尤其是指維持葡聚糖內切酶活性的那部分序列。
本發明中，也包含在上述蛋白質的N末端還含有序列1的-22～-1的胺基酸序列的一部分或全部的蛋白質。由於序列1的-22～-1的胺基酸序列被認為是信號肽，所以所謂的其中一部分序列也意味著是加在保持信號肽活性的那部分序列上的，留在N末端的序列，其結果是因表達宿主的種類不同而在加工的位置上產生了差別。
另外，本發明包括上述蛋白質的變化蛋白質。本發明中所謂的變化蛋白質是指在上述蛋白質的胺基酸序列中，附加、插入、剔除、缺失或置換一～數個胺基酸後而產生了變化的蛋白質，但仍然保持纖維素酶活性，尤其是保持葡聚糖內切酶活性的蛋白質。
以下序列表1記載的胺基酸序列中1～284的序列稱之纖維素酶NCE4，而該酶基因有時稱之纖維素酶NCE4基因。
本發明的纖維素酶活性高，只需少量就可以在各種用途中獲得所期望的效果。例如，如果按照本發明的優選狀態，將NCE4與從Humicola insolens菌的培養液製備的未純化的纖維素酶比較，前者的用量大約為後者的百分之一就可看到同等纖維素系纖維的細毛去除效果，若是二十五分之一的用量就可看到同等的染色斜紋粗棉布中含有的含纖維素纖維的脫色效果，若是五分之一用量就可看到同等纖維素系纖維的減量效果。因此，本發明纖維素酶可以在要效率更高而且經濟的纖維素系纖維的處理中使用。
按照本發明的其它實施方案，可以提供編碼上述蛋白質的胺基酸序列的DNA序列。該DNA序列的典型序列應當是含有序列2記載的鹼基序列的一部分或全部序列。
序列2記載的鹼基序列含有開始於118～120的ATG，終止於1089～1091的TAA的開放讀框。而171～173的鹼基序列對應於由284個殘基組成的上述成熟蛋白質。另外在序列2的鹼基序列中確認存在著內含子(參照實施例A7)。
如果給出蛋白質的胺基酸序列，很容易確定編碼蛋白質的DNA序列，可以選擇編碼序列1記載的胺基酸序列的全部或部分序列的各種鹼基序列。因此，所謂編碼本發明序列1記載的胺基酸序列的一部分或全部序列的DNA序列，除序列2記載的一部分或全部的鹼基序列上的序列外，也是指編碼同一胺基酸序列的但以存在簡併關係的密碼為鹼基序列的序列。
本發明的DNA既可以是來自天然的DNA，也可以全是合成的。而即使是利用一部分來自天然的序列進行合成的也可以。作為獲得DNA的典型方法有來自Humicola insolens菌的染色體文庫或cDNA文庫的在基因工程領域中慣用的方法，有利用例如以部分胺基酸序列信息為基礎作成適當DNA探針進行篩選的方法等。另外，從上述保藏的菌株獲得DNA也是可能的。
表達載體和轉化微生物另外，根據本發明，使上述的本發明的DNA序列在宿主微生物中複製是可能的，而且可以提供含有能夠表達該DNA編碼的蛋白質的載體。同時，根據本發明，能夠提供通過該載體轉化的微生物。該宿主-載體系統並沒有特別限定，例如可以使用大腸桿菌、放線菌、酵母、黴菌等系統，以及使用與其它蛋白質融合的融合蛋白質表達系統，本發明的載體的構建過程和方法可以使用基因工程領域中常用的方法。
為了使本發明的載體實際上導入宿主微生物中，表達出所期望的蛋白質，該載體除了含有上述的本發明的DNA以外，最好還含有控制目的DNA表達的DNA序列以及選擇微生物的標記基因等。由於序列2的鹼基序列已含有這些控制序列，所以直接利用該鹼基序列有時隨場合不同也是有利的。該表達載體即使含有重複的編碼纖維素酶的DNA序列(串聯的)也可以。含有這些DNA序列的表達載體可以按照常規方法構建。而通過該表達載體對微生物的轉化也可以按照該領域中常用的方法實施。
用適當的培養基培養該轉化體，從該培養物中可以分離到上述本發明的蛋白質。此外，本發明還提供上述本發明的新蛋白質的製造方法。轉化體的培養和培養條件只要是與使用的微生物所採用的在本質上一樣的條件就可以。而從培養液中回收、純化本發明的新蛋白質也可以按照常規方法進行。
纖維素酶的用途/纖維素酶製劑本發明的上述纖維素酶可以直接或作成纖維素酶製劑用於各種用途。尤其是為了賦予纖維素系纖維所期望的特性而使用纖維素酶。具體講，纖維素酶被用於含纖維素纖維細毛的去除、減量加工、以及染色的斜紋粗棉布中含纖維素纖維的脫色加工。
纖維素酶製劑是將本發明的纖維素酶與通常纖維素酶製劑含有的成分，例如和賦形劑(如乳糖、氯化鈉、山梨糖)、表面活性劑、防腐劑等混合在一起製備的。
利用本發明的纖維素酶或纖維素酶製劑去除含纖維素纖維細毛、減量加工以及斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色加工可以通過使纖維素酶與含纖維素纖維接觸來實施。
接觸溫度、纖維素酶的用量等條件可以在考慮了其它各種條件之後適當地確定，例如在去除含纖維素纖維細毛時，可以於50～60℃溫度下通過使用蛋白質濃度為5～50mg/l的纖維素酶進行處理。而在進行減量加工時，可以於50～60℃溫度下通過使用蛋白質濃度為100～300mg/l的纖維素酶進行處理。如果進行斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色加工時，可以於50～60℃溫度下通過使用蛋白質濃度為2～10mg/l的纖維素酶進行處理。
以下通過實施例更詳細地說明本發明，但本發明並不限定於這些例子。
實施例A1從Humicola insolens分離純化具有使Tencel細毛除去的活性成分將Humicola insolens MN 200-1於37℃下在(N)培養基(5.0％微晶纖維素(Avicel)、2.0％酵母提取物、0.1％蛋白腖、0.03％氯化鈣、0.03％硫酸鎂、pH6.8)中培養。培養七天後，將得到的培養液用7000rpm離心20分鐘，除去菌體，培養液的上清液就作為粗纖維素酶液。
將粗纖維素酶液進行疏水層析(Phenyl-Sepharose High Performance 16/100，Phamacia Biotech公司制)，用濃度梯度為1-0M硫酸銨的50mM磷酸緩衝液(pH7.0)洗脫，分級。其中，由於在濃度梯度為1-0 M硫酸銨洗脫時得到的級分表現出很強的去除Tencel細毛的活性，所以再將收集的該級分進行疏水層析(Phenyl-Sepharose High Performance 16/100)，用濃度梯度為1-0M硫酸銨的50mM磷酸緩衝液(pH7.0)洗脫，收集活性成分。
將收集的活性級分進行反相層析(Source15 ISO,Phamacia Biotech公司制)，用濃度梯度為1-0M硫酸銨的50mM磷酸緩衝液(pH7.0)洗脫，分級。其中，由於在0M硫酸銨的50mM磷酸緩衝液洗脫時得到的級分表現出很強的去除Tencel細毛的活性，所以將該級分進行反相層析(Source15 PHE，Phamacia Biotech公司制)，用濃度梯度為1-0M硫酸銨的50mM磷酸緩衝液(pH7.0)洗脫，將分離出的表現出很強的去除Tencel細毛的活性的級分作為純化酶NCE4。該NCE4在SDS-PAGE中顯示出分子量為43kDa的單一條帶。
實施例A2纖維素酶NCE4的部分胺基酸序列(1)N末端胺基酸殘基的確定為了確定實施例1中純化的蛋白質的N末端胺基酸序列，使用FPLC系統(Phamacia Biotech公司制)進行柱層析(柱子RESOURCE(商品名)RPC3ml、含有0.1％的TFA的5％～60％乙腈梯度)，分別收集主要的峰。
將收集的成分冷凍乾燥後，溶解於少量的水中，使用小型電泳裝置(TEFCO公司製造)，進行膠濃度為8％的SDS-PAGE電泳。電泳後，利用MultiphorII電泳裝置(Phamacia Biotech公司制)將膠中的蛋白質經電轉移到PVDF膜(Millipore公司)上，然後用考馬斯亮藍R-250(Nakalai-texque公司)染色後，再脫色，經水洗乾淨，最後風乾。從PVDF膜上將分子量為43kDa的蛋白質斑剪下來供蛋白質序列儀Model492(Perkin Elmer公司)進行序列分析。確定了N末端一側15個胺基酸殘基序列。得到的胺基酸序列如下所示。N末端胺基酸序列Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)-(Cys)-Lys-Pro-Ser(15個殘基)(2)肽譜峰將通過上述(1)中FPLC純化的蛋白質冷凍乾燥後，溶解於100mM的碳酸氫銨緩衝液中(pH8.0)。然後添加大約相對於蛋白質摩爾量的1/20的胰蛋白酶(Promega公司製造)，於37℃反應48小時。用Model172μ製備量HPLC系統(Perkin Elmer公司)進行柱層析(柱子C8220×2.1mm,0.1％TFA、0％乙腈～-0.085％TFA、35％乙腈梯度)，分別獲得3種肽。然後通過上述的蛋白質序列儀確定得到的肽段的胺基酸序列。其結果如下所示。TP-1:Tyr-Gly-Gly-Ile-Ser-Ser(6個殘基)TP-2:Phe-Pro-Asp-Ala-Leu-Lys(6個殘基)TP-3:Phe-Asp-Trp-Phe-Lys-Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Ser-Phe-Ser-Phe-Arg* * * * * * *(15個殘基)這些N末端胺基酸序列和通過肽段峰得到的胺基酸序列由於與WO91/17243號公報記載的由Humicola insolens DSM1800得到的43kDa葡聚糖內切酶的胺基酸序列具有同源性，所以明顯地暗示出該蛋白質是纖維素酶的一種。
另外，將上述序列與Protein Identification Resource(PIR) R44.0,March,1995，或者SWISS-PROT R31.0,March 1995登錄的序列比較，雖然具有表現出同源性的序列，但並不是同一種蛋白質，而是一種新的蛋白質已經很清楚了。
實施例A3基因組DNA文庫的製作基因組DNA的分離按照Horiuchi等人的方法(Horiyuki Horiuchi等，《細菌學雜誌》J.Bacteriol.,170:272-278,1988)進行。
首先將Humicola insolens MN 200-1於37℃下，在上述(N)培養基中培養。培養2天後，通過離心分離(3500rpm、10分鐘)收集菌體。將得到的菌體進行苯酚處理、蛋白酶K和核糖核酸酶A處理、再通過聚乙二醇(PEG)沉澱，得到基因組DNA。
接下來，用Sau3AⅠ消化Humicola insolens基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳確認在9～23kbp的範圍有部分分解帶，然後利用乙醇沉澱回收該電泳帶。使用T4連接酶(東洋紡織社製造)將該DNA片段連接在噬菌體載體、EMBL3克隆試劑盒(Stratagene公司製造)中的BamHⅠ臂上。用乙醇沉澱後，溶解於TE(10mM Tris鹽酸(pH8.0)、1mMEDTA)緩衝液中。
使用就象Hohn,B.方法(Hohn,B.《酶學方法》Methods Enzymol.,68:299-309,1979)記載的那樣冷凍乾燥的包裝成分和Giga-PackⅡ包裝試劑盒(Stratagene公司製造)，將上述連接後的混合物都包裝在λ噬菌體頭部，然後用得到的噬菌體感染大腸桿菌LE392菌株。使用通過這種方法得到的5×104個噬菌體文庫進行目的基因的克隆。
實施例A4利用PCR方法製作長鏈探針作為DNA探針是通過以Humicola insolens全長DNA作模板利用PCR方法製作的擴增的長鏈探針。
各個引物是對應於N末端和多肽TP-3中用*表示的胺基酸合成的DNA。製作的合成寡核糖核酸序列如下所示。
NCE4N1:5′-GCXGA(CT)GGXAA(AG)TC(AGCT)AC-3′(17mer)NCE4N2:5′GCXGA(CT)GGXAA(AG)AG(CT)AC-3′(17mer)NCE4C:5′-CXGC(AG)TT(CT)TT(AG)AACCA(AG)TC-3′(19mer)(X次黃嘌呤核苷)PCR反應的條件如下。首先對於1μg Humicola insolens基因組DNA，一組的試管中加入引物NCE4N1、NCE4C各1μM，另一組試管中加入NCE4N2、NCE4C各1μM，在dNTP存在下，於95℃進行5分鐘熱變性，然後加入Taq聚合酶(重組Taq，寶酒造公司製造)，通過25輪反覆反應進行擴增，每次的反應條件都是94℃1分鐘，45℃2分鐘，72℃3分鐘。擴增的結果是，只使用引物NCE4N1、NCE4C時，擴增得到大約750bp的DNA。這些DNA用作以下的篩選探針。
實施例A5纖維素酶成分NCE4基因的克隆(1)利用噬斑原位雜交進行篩選首先利用ECL Director DNA/RNA標記檢測系統(Amersham公司製造)對通過PCR擴增的大約750bp的DNA片段100ng預先進行標記。
將按照實施例2記載的方法製作的噬菌體噬斑轉移到High-Bond N+尼龍轉移膜(Amersham公司製造)上，用0.4N的氫氧化鈉變性後，用5倍濃度的SSC(15mM檸檬酸三鈉鹽，150mM氯化鈉)洗淨，乾燥，使DNA固定。按照試劑盒的方法，進行1小時的預雜交(42℃)後，加入先前標記的探針，進行4小時(42℃)的雜交。按照上述試劑盒的方法洗淨標記物。首先用加有0.4％SDS、6M尿素的0.5倍濃度的SSC於42℃反覆洗2次，每次20分鐘，然後再用2倍濃度的SSC於室溫反覆洗2次，每次5分鐘。
洗過探針的尼龍膜浸入到檢測液中1分鐘，然後使Hyper-Film-ECL(Amersham公司製造)感光，得到4個陽性克隆。(2)噬菌體DNA的製備使噬菌體感染E.coli LE392,8小時後收集噬菌體顆粒，按照Grossberger的方法(Grossberger，《核酸研究》D.,Nucleic Acids.Res.15 6737,1987)用蛋白激酶K和苯酚處理後，通過乙醇沉澱，分離出噬菌體DNA。
(3)目的基因的亞克隆4種噬菌體DNA用SalⅠ切，然後走瓊脂糖電泳。
按照Southern的方法(Southern,E.M.，《分子生物學雜誌》J.Mol.Biol.98:503-517,1975)將DNA轉移到尼龍膜上，在與上述(1)的噬斑雜交相同的條件下，用大約750bp的探針進行雜交，檢測出含有5.2kbp的目的基因的DNA片段。其結果4種噬菌體DNA都有同樣大小的SalⅠ片段。
用Sephaglass Band Prep試劑盒(Phamacia Biotech公司製造)分離5.2kbp DNA片段，使用E.coli JM109在質粒pUC119的SalⅠ部位進行亞克隆。得到的質粒定為pNCE4Sal。
實施例A6鹼基序列的確定(1)基因組DNA鹼基序列的解析鹼基序列的確定按以下方式實施。
鹼基序列解析設備使用的是A.L.F.DNA序列儀Ⅱ(Phamacia Biotech公司製造)。作為測序膠使用的是ReadyMix膠(Phamacia Biotech公司製造)，或者使用可能作為Hydrolink Long Ranger(FMC公司製造)得到的丙烯醯胺載體。作膠用的各種試劑(N,N,N』,N』-四甲基乙二胺、尿素、過硫銨)可以使用A.L.F級試劑(Phamacia Biotech公司製造)。解讀鹼基序列反應使用的是自動解讀測序試劑盒Autoread Sequencing Kit(Phamacia Biotech公司製造)。凝膠製作條件、反應條件和電泳條件等參照各個說明書設定。
將作為模板DNA的pNCE4Sal用10μg的2M氫氧化鈉進行鹼變性後，與自動解讀測序試劑盒附帶的Universal引物退火，進行延長反應。反應產物用測序儀解讀，判斷有546bp鹼基序列。從這一結果可以製作MNEG01的FITC標記的測序引物，與pNCE4Sal反應，可進一步進行解讀。由得到的結果又可製作下一個引物，繼續解讀。其結果就可解讀出整個的NCE4。製作的FITC標記測序引物如下所示。
MNEG-01:5′-GTGATGAGGGCTGGCGACAGGCC-3′(23mer)MNEG-02:5′-CTGCCACCTCTATTGCCGGCAGC-3′(23mer)MNEG-03:5′-CCCGACGCCCTCAAGCCCGGCTG-3′(23mer)MNEG-04:5′-GGCTGGAGCGGCTGCACCACCTG-3′(23mer)(2)鹼基序列的確定以上述(1)的結果為基礎，合成MNEG-05～MNEG-08的FITC標記測序引物，製作的FITC標記測序引物如下所示。
MNEG-05:5′-GACCTGACGGAAGCTGAAGCTCG-3′(23mer)MNEG-06:5′-AGCAGTGCAGCCGCTGGGAGTCG-3′(23mer)MNEG-07:5′-TGGCAGATGAGGACGTGGTGTTG-3′(23mer)MNEG-08:5′-CGCAGCCGGACTTGGCGTCGAAG-3′(23mer)使這些引物與pNCE4Sal通過自動解讀測序試劑盒進行反應。首先，對10μg的質粒進行鹼變性，然後與各個引物進行退火，用T7聚合酶使其反應。其結果可以確定SalⅠ片段內的1257bp鹼基序列。該序列如序列3所示。
實施例A7內含子的確定為了確定內含子，首先從Humicola insolens MN200-1製備mRNA，通過逆轉錄酶合成cDNA，將它與基因組的鹼基序列比較，判斷它們的相同區域。
(1)總RNA的製備將Humicola insolensMN200-1於纖維素酶誘導培養基培養，優選於上述(N)培養基中培養2天，通過離心分離(3500rpm、10分鐘)，收集菌體。取出其中的2g菌體用滅菌水洗淨，於液氮冷凍狀態下用攪拌機(日本精機公司製造的勻漿機AM-3)粉碎。然後懸浮於含有4M胍基硫氰酸鹽的變性溶液10ml中(4M胍基硫氰酸鹽、25mM檸檬酸三鈉鹽、0.5％N-十二烷基肌氨酸鈉、0.1M巰基乙醇)。於室溫攪拌數分鐘後，用1ml的2M醋酸鈉(pH4.5)中和，加入10ml的TE飽和的苯酚，繼續攪拌。然後加入2ml的氯仿-異戊醇(24∶1)，充分攪拌後，通過離心分離(3500rpm、10分鐘)，除去苯酚變性了的菌體成分。吸取上層液(水相)，用10ml的異丙醇將核酸沉澱。通過離心分離(3500rpm、10分鐘)從該沉澱中回收核酸，用70％乙醇通過再離心分離洗沉澱。
將該沉澱溶解於3.5ml的TE後，向溶液中加入880μl的10M氯化鋰溶液，於5℃冷藏2小時後，經離心分離(12000rpm、10分鐘)，回收沉澱。用70％乙醇洗該沉澱，得到沉澱即為總RNA級分。回收RNA的量為2.7mg，收率是0.14％。
(2)PolyA尾巴+RNA(=mRNA)的製備mRNA的製備是利用mRNA純化試劑盒(Phamacia Biotech公司製造)進行的。
首先，從(1)中製備的總RNA中取出1mg溶解於1ml的洗脫緩衝液中，於65℃進行10分鐘的熱變性處理。然後於冰中驟冷後，加入0.2ml的樣品緩衝液。將該總RNA溶液加到寡聚物(dT)纖維素柱上，用高鹽緩衝液洗柱3次，再用低鹽緩衝液洗柱3次，然後用於65℃加溫的洗脫緩衝液洗脫。上述對柱子的操作反覆進行2次。得到mRNA級分。得到的mRNA量為19.2μg，收率為2％。
(3)cDNA的合成使用Timesaver cDNA合成試劑盒(Phamacia Biotech公司製造)進行cDNA合成。
首先將5μg的mRNA溶解於20μl的樣品緩衝液。於65℃進行10分鐘的熱變性處理後，與二硫蘇糖醇溶液以及寡聚物(dT)引物一起加到第一條鏈合成混合物中，於37℃反應1小時。然後再都加到第二條鏈合成混合物中，於12℃反應30分鐘，再於22℃反應1小時，得到cDNA。
(4)通過PCR方法擴增纖維素酶NCE4cDNA從合成的cDNA取出1μg作為模板，通過PCR方法只擴增目的cDNA。製作的N末端和C末端引物的寡核苷酸序列如下所示。
NCE4-CN:5′-ATGCGTTCCTCCCCTCTCCTCCGCTCCGCC-3′(30mer)NCE4-CC:5′-TACAGGCACTGATGGTACCAGTCATTAATC-3′(30mer)PCR反應按以下條件進行。首先對於1μg Humicola insolens的cDNA，各加入1μM引物，在dNTP存在下，於94℃進行10分鐘熱變性，然後加入Taq聚合酶(重組Taq，寶酒造公司製造)，通過30輪反覆反應進行擴增，每次的反應條件都是94℃1分鐘，50℃2分鐘，72℃3分鐘。擴增的片段經瓊脂糖電泳確定為0.9bp大小的片段。通過乙醇沉澱濃縮該片段，利用pT7 blue-T vector試劑盒(Novagen公司製造)進行克隆。該質粒定為pCNCE4。
(5)cDNA鹼基序列的解析使用與上述一樣的自動解讀測序試劑盒進行測序反應。
質粒pCNCE4用2M的氫氧化鈉進行鹼變性後，用乙醇進行沉澱。該一條鏈質粒作為模板，用T7聚合酶進行聚合反應。利用前面合成的引物MNEG-01、MNEG-02、MNEG-03、MNEG-04、MNEG-05、MNEG-06、MNEG-07、MNEG-08以及試劑盒附帶的Universal引物、Reverse引物進行反應，解讀序列。
結果發現存在著一個56bp的內含子。在序列3的序列中，非翻譯開始序列以及終止序列、內含子內部的調控序列如下所示(數字為序列3中的序列位置號)。
內含子453～458、506～508、491～497
實施例A8:NCE4去除含纖維素纖維細毛活性的評價使用大型洗衣機，加有表面活性劑和橡皮球，使預先染色的Tencel(Courtauls公司製造)布料生出細毛。將通過處理生出細毛的Tencel按照下面的條件用纖維素酶處理除去細毛，計算為了使細毛完全除去所需要的纖維素酶的蛋白質濃度。
試驗機械20kg洗衣機(SANYO公司製造全自動洗衣機SCW5101)浴比1∶20加熱55℃時間60分鐘pH:7(10mM磷酸緩衝液)橡皮球與纖維素酶液一起加入到處理液中，總重量大約是布的2倍。
表1除去Tencel細毛所需要的蛋白質量*NCE4 5mg/L粗製纖維素酶液500mg/L*蛋白質量是使用蛋白質分析試劑盒(Biorad公司)、以牛血清白蛋白作為標準來定量的。
結果表明，NCE4的用量為粗製纖維素酶液的百分之一就可以使同等程度的Tencel細毛除去。
實施例A9NCE4對斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色活性的評價對已下水脫漿的12-Ounce的藍色牛仔褲按照下面的條件進行脫色處理。
試驗機械20kg洗衣機(SANYO公司製造全自動洗衣機SCW5101)
浴比1∶50加熱55℃時間60分鐘pH:7(10mM磷酸緩衝液)橡皮球與纖維素酶液一起加入到處理液中，總重量大約是布的2倍。
脫色度用色差系COLOR ANSLYZER TOPSCAN MODELTC-1800MK2(東京電色株式會社製造)測定，Lab表示系列的L值(明度)。通過L值相對於對照的增加值(白色度的增加)=ΔL來評價脫色，就評價脫色的各個試驗區測定了5個點的ΔL值(n=5)，去掉最大值和最小值，採用剩下的3點的平均值。可以算出為了使脫色達到ΔL值=7所需要的纖維素酶的蛋白質濃度。
表2藍色牛仔褲脫色所需要的蛋白質量NCE4 1.8mg/L粗製纖維素酶液 45.0mg/L試驗結果表明NCE4的用量為粗製纖維素酶液的二十五分之一就可以使同等程度的藍色牛仔褲脫色。
實施例A10NCE4對含纖維素纖維的減量活性的評價按照下麵條件對作為預先測定了絕對乾重的再生纖維素系纖維的庫普拉(銅銨短纖維，旭化成工業株式會社制長15cm×寬10cm)進行酶處理。
試驗機械洗滌牢固度試驗機型號L-12(株式會社大榮科學精密儀器製作所製造)浴比1∶50加熱55℃
時間60分鐘pH:7(40mM磷酸緩衝液)不鏽鋼球與纖維素酶液一起加入到處理液中。酶處理後，使其乾燥，測定庫普利的絕對乾重，測定相對於酶處理前的重量減少率。計算出為了達到8％的重量減少率所需要的纖維素酶的蛋白質濃度。
表3為使庫普拉重量減少8％所需要的蛋白質量NCE4 100mg/L粗製纖維素酶液 500mg/L試驗結果表明NCE4的用量為粗製纖維素酶液的五分之一就可以實現同等程度的減量加工。
實施例B1質粒pMKD01的製備(1)質粒pUC118BN的製備用BamHⅠ切1μg pUC118 DNA，利用苯酚使限制性內切酶失活。然後進行乙醇沉澱，將沉澱溶解於少量的TE(10mM Tris鹽酸(pH8.0)、1mM EDTA)緩衝液中。使用DNA Branching kit(寶酒造社制)使上述DNA的末端補平。再利用DNA連接試劑盒使平滑化的DNA連接，使其自身環化。用得到的連接混合物轉化E.coli感受態細胞JM109(寶酒造社制)。轉化菌可以在含有100μg/ml的氨苄青黴素、1mM IPTG、0.004％X-gal的LB瓊脂培養基(1％蛋白腖、0.5％酵母提取物、1％NaCl、1.5％瓊脂)上繁殖，選擇白色的菌斑在含有100μg/ml的氨苄青黴素LB培養基(1％蛋白腖、0.5％酵母提取物、1％NaCl)上於37℃培養過夜。從得到的培養基中通過鹼-SDS方法回收質粒DNA。將該質粒DNA用BamHⅠ切，走0.8％瓊脂糖凝膠電泳，選擇pUC118DNA被BamHⅠ切斷的質粒DNA。該質粒DNA被定為pUC118BN。
(2)質粒pUC118BSN的製備用SphⅠ切1μg pUC118BN DNA，利用與上述同樣的方法獲得pUC118BN DNA的SphⅠ部位被破壞的質粒DNA。該質粒DNA被定為pUC118BSN。
(3)質粒pM21的製備(A)纖維素酶NCE2基因的分離將按照特開平8-126492號公報記載的方法從Humicola insolens得到的含有作為纖維素酶NCE2基因、以及含有作為該基因啟動子和終止區的上遊1.4kb、下遊0.5kb的DNA序列的全長3.4kb的PstⅠ-Xba的酶切片段連接到先前的pUC118BSN PstⅠ～XbaⅠ位點上，得到的質粒DNA被定為pUC118BSN-PX。
(B)pUC118BSN-PX的指定部位的變異處理在緊靠NCE2基因的N末端的下遊以及終止密碼的下遊象以下那樣通過指定部位變異導入BamHⅠ位點。通過質粒pUC118BSN-PX轉化E.coli JM109菌株，使輔助噬菌體M13K07感染後，在含有氨苄青黴素和卡那黴素各150μg/ml、70μg/ml的30ml的2×YT液體培養基(1.6％細菌胰蛋白酶、0.8％酵母提取物、0.5％NaCl)上於37℃培養16-20小時。從培養上清中回收M13的單鏈DNA(ssDNA)。利用該ssDNA和兩種合成的寡核苷酸，使用雕紋體外誘變系統(Sculpture In Vitro Mutagenesis System(Amersham公司製造))進行特定部位的變異處理。製備的合成寡核苷酸引物如下所示。
MNC-02 5′-GAGCGCCAGAACTGTGGATCCACTTGGTGAGCAATG-3′(36mer)MNC-03 5′-TCCGCCGTTCTGAGCGGATCCAGGCGTTTGGCGCG-3′(35mer)將經指定部位變異處理的DNA混合液導入E.coli TGl，得到的轉化菌株在含有100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基(1％腖、0.5％酵母提取物、1％NaCl)中培養，回收質粒DNA。該質粒DNA用BamHⅠ切，走0.8％瓊脂糖凝膠電泳，選擇在pUC118BSN-PX中導入兩個BamHⅠ位點的質粒DNA，該質粒DNA被定為pM21。
(4)纖維素酶NCE3基因的分離以來自眾所周知的灰腐質黴Humicola grisea纖維二糖水解酶基因(de Oliviera Alzevedo,M.等，《普通分子生物學雜誌》J.GeneralMcrobiol.,136:2569-2576,1990)的序列為基礎利用PCR方法分離來自Humicola insolens纖維二糖水解酶基因(NCE3)。
(A)基因組DNA的分離利用上述實施例A3的方法得到Humicola insolens MN200-1的基因組。
(B)利用PCR方法擴增纖維素酶NCE3基因以來自Humicola grisea的纖維二糖水解酶基因的序列為基礎利用PCR方法分離Humicola insolens的NCE3基因。為了能夠使含有該NCE3的PCR產物連接在質粒pM21的BamHⅠ位點上，預先在各引物中設計了含有BamHⅠ位點，作為引物合成了如下的寡核苷酸序列。
MKA-05:5′-GCCGCCCAGCAGGCGGGATCCCTCACCACCGAGAGG-3′(36mer)MKA-06:5′-TGATCGTCGAGTCAGGGATCCAGAATTTACAGGCAC-3′(36mer)PCR反應根據LA PCR Kit Ver.2(寶酒造社制)，按照以下方法進行。首先對通過上述方法得到的1μg Humicola insolens基因組DNA，各加入1μM引物、400μM dNTP、LA Taq聚合酶2.5U，通過30輪重複反應進行擴增，每次的反應條件都是94℃1分鐘，55℃2分鐘，72℃3分鐘。擴增的片段經0.8％瓊脂糖凝膠電泳確認1.6Kb DNA的擴增。該1.6Kb DNA的片段用Sephaglass Band Prep試劑盒(Phamacia Bi otech.公司製造)回收，並與pT7 Blue-T-vector kit(Novagen公司製造)連接。該質粒DNA定為pK21。
(5)質粒pKM04的製備質粒pK21DNA用BamHⅠ消化，回收1.6Kbp片段。然後質粒pM21DNA用BamHⅠ消化，再於70℃處理10分鐘，使限制性內切酶失活。再通過小牛鹼性磷酸酶脫磷酸後，經0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，回收5.2Kbp DNA片段。最後將來自pK21的1.6Kbp片段與來自pM21的5.2Kbp DNA片段連接，就得到質粒pKM04。
(6)質粒pMKD01的製備首先，使用通過眾所周知的方法得到的來自構巢麴黴Aspergillus nidulans的trp C基因的啟動子和終止子(Mullaney,E.J.等，《分子遺傳學與普通遺傳學》Mol.Gen.Genet.199:37-45,1985)，將特開昭59-175889號公報記載的越黴素抗性基因製備成在Humicola insoleHs中能夠表達的基因。將該基因導入質粒pMKD04的XbaⅠ位點，製備質粒pMKD01。
實施例B2利用質粒pMKD01轉化Humicola insolens(1)質粒pMKD01高濃度純化樣品的製備為了使質粒pMKD01導入Humicola insolens，首先要製備純化的高濃度質粒pMKD01。將pMKD01導入E.coli JM109，在含有100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中於37℃培養過夜。得到的培養液用Flexiprep kit(Phamacia Biotech公司製造)純化，得到1μg/μl的pMKD01質粒DNA。
(2)轉化Humicola insolens將Humicola insolensMN200-1在(S)培養基中於37℃培養24小時後，通過3000rpm、離心分離10分鐘，收集菌體。其中(S)培養基的組成是上述(N)培養基中加了葡萄糖(3.0％)，並去掉了Avicel後的培養基。得到的菌體用0.5M蔗糖洗淨，懸浮於經0.45μm濾器過濾的10ml的原生質體化酶液中(5mg/ml Novozyme 234(NLⅠ公司製造)、5mg/ml Cellulase 0nozuka R-10(Yacult公司製造)、0.5M蔗糖)。於30℃振蕩60～90分鐘，使菌原生質體化。將該懸濁液過濾後，經2500rpm、10分鐘離心分離，回收原生質體，用SUTC緩衝液(0.5M蔗糖、10mM氯化鈣、10m MTRis鹽酸(pH7.5))洗淨。
將以上製備的原生質體懸浮於1ml的SUTC緩衝液中，向100μl該懸浮液中加入10μg的DNA(TE)溶液(10μl)，靜置於冰中5分鐘。然後加入400μl的PEG溶液(60％PEG4000、10mM氯化鈣、10mM TRis鹽酸(pH7.5))，靜置於冰中20分鐘後，加入10ml的SUTC緩衝液，經2500rpm、10分鐘離心分離，收集原生質體。將該原生質體懸浮於1ml的SUTC緩衝液後，經4000rpm、5分鐘離心分離，將原生質體最終懸浮於100μl的SUTC緩衝液中。
將經以上處理的原生質體與YMG軟瓊脂一起鋪在含有200μg/ml潮黴素B的YMG培養基(1％葡萄糖、0.4％酵母提取液、0.2％麥芽提取液、1％瓊脂(pH6.8))上，於37℃培養5天後，形成的菌落就是轉化體。
(3)pMKD01轉化的菌株的培養以及經SDS-PAGE的評價象前述那樣將質粒pMKD01導入Humicola insolens MN200-1，挑選50個潮黴素抗性菌株。將這些菌株在(N)培養基上於37℃培養5天。獲得的培養液上清通過SDS-PAGE解析，pMKD01轉化的菌株中的5個菌落推斷為NCE3的蛋白質帶比親本菌株增加了3～4倍。
(4)重組NCE3的N末端胺基酸殘基的鑑定為了進一步確認SDS-PAGE結果給出的大量表達的蛋白質帶是來自NCE3基因的，所以要確定該蛋白質的N末端胺基酸序列。首先，就從親本菌株和NCE3高表達菌株得到的培養上清按照前述實施例A2的方法進行FPLC柱層析，比較它們的主要的峰。收集NCE3高表達菌株中特別增加的峰，並冷凍乾燥。冷凍乾燥的樣品溶解於少量的水中，進行膠濃度為8％的微型SDS-PAGE(Difco公司製造)。然後按照前述實施例A2的方法，將膠中蛋白質電轉移到PVDF膜上，用考馬斯亮藍R-250染色後，進行脫色，用水洗淨。從膜中剪下印記為分子量66KD的蛋白質部分，將該印記蛋白質按照Podell,D.N等人的方法(Podell,D.N.等，《生物化學與生物物理學研究通訊》Biochem.Biophys.Res.Commun.,81:176,l978)，除去修飾N末端殘基。首先，剪下目的蛋白質，在少量的0.5％聚乙烯吡咯烷酮(分子量40,000 Sigma公司製造)/100mM醋酸溶液中於37℃保溫30分鐘後，用水充分洗淨。然後利用Pfu焦穀氨酸氨肽酶(寶酒造公司製造)除去修飾的N末端殘基，用水洗淨、風乾。利用蛋白質測序儀Model492，確定了N末端的15個胺基酸殘基序列。得到的序列如下所示。
N末端胺基酸序列Asn-Cys-Gly-Ser-Leu-Thr-Thr-Glu-Arg-His-Pro-Ser-Leu-Ser-Trp(15個胺基酸殘基)該N末端胺基酸序列與由質粒pMKD01的鹼基序列推測的纖維素酶NCE2、NCE3融合蛋白質的胺基酸序列一致。
(5)pMKD01轉化的菌株的FPLC評價為了進一步定量象上述那樣用SDS-PAGE確認NCE3大量表達的5個菌落的培養上清，利用FPLC柱進行柱層析。層析條件與上述(4)的一樣。分別收集NCE3的峰，並冷凍乾燥，測定重量，比較高表達菌株與親本菌株的產率。比較結果如下表所示。
表4NCE3產量*Humicola insolens MN200-1(親本菌株)0.46gHumicola insolens pMKD011.8g*產量是每一升培養液的產量。
實施例B3；質粒pEGD01的製備質粒pMKD01經BamHⅠ消化，然後通過70℃的熱處理使限制性內切酶失活，經脫磷酸處理，回收8.2Kbp的DNA片段。
然後，以在上述實施例A1～7得到的來自Humicola insolens的NCE4基因的序列為基礎，通過PCR方法擴增NCE4基因。按照在各個引物中預先含有BamHⅠ位點的形式設計該NCE4的PCR產物，使之能夠符合讀碼框架，連接於上述質粒pMKD01的8.2Kbp的BamHⅠ片段。
作為引物合成具有以下序列的寡核苷酸。
NCE4-N:5′-CCGGTGTTGGCCGGATCCGCTGATGGCAAG-3′(30mer)NCE4-C:5′-TAAGGCCCTCAAGGATCCCTGCGTCTACAG-3′(30mer)PCR反應如下。對於1μg Humicola insolens基因組DNA，各加入1μM引物、400μM dNTP、Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司製造)2.5U，通過25輪重複反應擴增0.8Kbp的DNA片段，每次的反應條件都是94℃1分鐘，55℃2分鐘，72℃3分鐘。回收該0.8Kbp的DNA片段，將該片段連接到上述pMKD01的8.2KbpBamHⅠ片段。該質粒DNA定為pEGD01。
實施例B4質粒pEGD01的表達(1)質粒pEGD01對Humicola insolens的轉化質粒pEGD01對Humicola insolensMN200-1的轉化按照實施例B2的方法進行。首先製備純化的高濃度的質粒pEGD01，得到1μg/μlpEGD01質粒DNA。使用10μl該pEGD01溶液，轉化Humicola insolens MN200-1，挑選50個潮黴素抗性菌株。將這些菌株在(N)培養基上於37℃培養5天。獲得的培養液上清通過SDS-PAGE解析，pMKD0l轉化的菌株中的10個菌落中推斷為NCE4蛋白質帶比親本菌株增加了10～16倍。
(2)重組NCE4的N末端胺基酸殘基的鑑定為了進一步確認SDS-PAGE結果給出的確認大量表達的蛋白質帶是來自NCE4基因的，所以要確定該蛋白質的N末端胺基酸序列。首先，就從親本菌株和NCE4高表達菌株得到的培養上清進行FPLC柱層析，比較它們的主要的峰。條件與上述實施例B2一樣。收集NCE3高表達菌株中特別增加的峰，並冷凍乾燥。冷凍乾燥的樣品溶解於少量的水中。按照實施例B2的方法除去修飾N末端殘基後，通過上述蛋白質測序儀確定N末端的胺基酸序列。結果得到比例大約為7∶3的如下所示的兩種N末端胺基酸序列。而如果不除去修飾N末端殘基，通過上述蛋白質測序儀確定N末端胺基酸序列，結果只得到如下所示的胺基酸序列1。
N末端胺基酸序列1:Val-Val-Glu-Glu-Arg-Gln-Asn-Cys-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp(20個殘基)N末端胺基酸序列2:Asn-(Cys)-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)-(Cys)-Lys-Pro-Ser-(Cys)(20個殘基)
這些N末端胺基酸序列與由質粒pMKD01的鹼基序列推測的纖維素酶NCE2和NCE4融合蛋白質的胺基酸序列一致。因為得到的是兩種N末端胺基酸序列，很清楚，當切斷該融合蛋白質的信號序列時，會在多個位置進行切斷。
(3)pEGD01轉化的菌株的FPLC評價為了進一步定量象上述那樣用SDS-PAGE確認NCE4大量表達的5個菌落的培養上清，利用FPLC柱進行柱層析。分別收集NCE4的峰，並冷凍乾燥，測定重量，比較高表達菌株與親本菌株的產率。比較結果如下表所示。
表5NCE4產量*Humicola insolens MN200-1(親本菌株)0.28gHumicola insolens pMKEG14.5g*產量是每一升培養液的產量。
實施例B5；質粒pIED02的製備(1)質粒pID01的製備pEGD01經HindⅢ～BamHⅠ消化，回收7.2Kbp的DNA片段。
然後，以用特開平8-5663號公報中記載的方法得到的來自Humicola insolens的NCE1基因的序列為基礎，通過PCR方法擴增NCE1基因的啟動子和編碼信號序列部分的DNA。含有該NCE1啟動子和信號序列的PCR產物按照在各個引物中預先含有HindⅢ位點、BamHⅠ位點的形式設計，使之能夠符合讀碼框架，連接於上述質粒pEGD01的7.2Kbp的HindⅢ～BamHⅠ片段。作為引物製備了如下的合成寡核苷酸。
PNCE1-N:5′-GTCATGAAGCTTCATTAAGGTACGTATGCAAC-3′(32mer)PNCE1-C:5′-GGTGATGGATCCGGCCTGCTGGGCAGCGACGC-3′(32mer)PCR反應與實施例3一樣。對於1μg Humicola insolens基因組DNA，各加入1μM引物、400μM dNTP、Pfu DNA聚合酶2.5U，通過23輪重複反應擴增1.5Kbp的DNA片段，每輪的反應條件都是94℃1分鐘，55℃2分鐘，72℃4分鐘。該PCR產物用HindⅢ和BamHⅠ消化，回收1.5Kbp的DNA片段，將該片段連接到上述pEGD01的7.2Kbp HindⅢ～BamHⅠ片段。該質粒DNA定為pIED01。
(2)質粒pIED02的製備質粒pID01經BamHⅠ消化，然後通過70℃的熱處理使限制性酶失活，經脫磷酸處理，回收8.6Kbp的DNA片段。然後質粒pEGD01經BamHⅠ消化後，回收含有NCE4基因的0.8Kbp的DNA片段，將兩個片段連接起來，得到質粒pIED02。
實施例B6質粒pIED02的表達(1)質粒pIED02對Humicola insolens的轉化質粒pIED02對Humicola insolens MN200-1的轉化按照實施例B2的方法進行。首先製備純化的高濃度的質粒pIED02，得到1μg/μlpIED02質粒DNA。使用10μl該pIED02溶液，轉化Humicola insolens MN200-1，挑選50個潮黴素抗性菌株。將這些菌株在(N)培養基上於37℃培養5天。獲得的培養液上清通過SDS-PAGE解析，pIED02轉化的菌株中的5個菌落中推斷為NCE4蛋白質帶，比親本菌株增加了5～10倍。
(2)重組NCE4的N末端胺基酸殘基的鑑定為了確認SDS-PAGE的結果給出的大量表達的蛋白質帶是來自NCE4基因的，所以要確定該蛋白質的N末端胺基酸序列。首先，按照與實施例B2一樣的方法，就從親本菌株和NCE4高表達菌株得到的培養上清進行FPLC柱層析，收集NCE3高表達菌株中特別增加的峰，並冷凍乾燥。冷凍乾燥的樣品溶解於少量的水中。按照實施例B2的方法除去修飾N末端殘基後，通過上述蛋白質測序儀確定N末端的15個胺基酸殘基序列。得到的序列如下所示。
N末端胺基酸序列Gln-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)(15個殘基)該N末端胺基酸序列與由質粒pIED02的鹼基序列推測的纖維素酶NCE1、NCE4融合蛋白質的胺基酸序列一致。
(3)pEGD02轉化的菌株的FPLC評價為了進一步定量象上述那樣用SDS-PAGE確認的NCE4大量表達的5個克隆的培養上清，利用FPLC柱進行柱層析。分別收集NCE4的峰，並冷凍乾燥，測定重量，比較高表達菌株與親本菌株的產率。比較結果如下表所示。
表6NCE4產量*Humicola insolens MN200-1(親本菌株) 0.28gHumicola insolens pIED022.9g*產量是每一升培養液的產量。
序列表序列號1序列的長度305拓撲型直鏈形序列種類蛋白質序列Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Arg Ser Ala Val Val Ala Ala Leu Pro-20 -15 -10Val Leu Ala Leu Ala Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys-51 5 10Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val Asn Gln Pro15 20 25Val Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gln Arg Leu Thr Asp Phe Asp Ala30 35 40Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln45 50 55Thr Pro Trp Ala Val Asn Asp Asp Phe Ala Phe Gly Phe Ala Ala Thr60 65 70 75Ser Ile Ala Gly Ser Ash Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu80 85 90Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Val Val Gln95 100 105Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn110 115 120Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe125 130 135Gly Gly Leu Pro Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu140 145 150 155Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe160 165 170Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gln Val175 180 185Gln Cys Pro Ala Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp190 195 200Asp Gly Asn Phe Pro Ala Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser205 210 215Pro Val Gly Gln Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr220 225 230235Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu240 245 250Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Asn Gly Trp Sar Gly Cys Thr Thr Cys255 260 265Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys270 275 280Leu序列號2序列的長度1257序列類型核酸鏈數二條鏈拓撲型直鏈形序列種類基因組DNA起源生物名humicola insolens序列特徵表示特徵的記號intron存在位置453..509決定特徵的方法E序列AATGACGGGG CAACCTCCCG CCCGGGCCCA ACTCTTGGGT TTGGTTTGAC AGGCCGTCTG60TCTCTTGCGT CCTCTTACTA CGCCTGCCTG GACCCTACGT CTCAACTCCG ATTCAAG 117ATG CGT TCC TCC CCT CTC CTC CGC TCC GCC GTT GTG GCC GCC CTG CCG 165Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Arg Ser Ala Val Val Ala Ala Leu Pro-20 -15 -10GTG TTG GCC CTT GCC GCT GAT GGC AAG TCC ACC CGC TAC TGG GAC TGC 213Val Leu Ala Leu Ala Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys-51 5 10TGC AAG CCT TCG TGC GGC TGG GCC AAG AAG GCr CCC GTG AAC CAG CCT 261Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val Asn Gln Pro15 20 25GTC TTC TCC TGC AAC GCC AAC TTC CAG CGT CTC ACT GAC TTC GAC GCC 309Val Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gln Arg Leu Thr Asp Phe Asp Ala30 35 40AAG TCC GGC TGC GAG CCG GGC GGT GTC GCC TAC TCG TGC GCC GAC CAG 357Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln45 50 55ACC CCA TGG GCT GTG AAC GAC GAC TTC GCG TTC GGT TTT GCT GCC ACC 405Thr Pro Trp Ala Val Asn Asp Asp Phe Ala Phe Gly Phe Ala Ala Thr60 65 70 75TCT ATT GCC GGC AGC AAT GAG GCG GGC TGG TGC TGC GCC TGC TAC GA 452Ser Ile Ala Gly Ser Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Gl80 85 90GTAAGCTTTG GTCGCGTGTG TAACACTGTG CAGGCATAGC ACTAACCACC TCCCAG G 509uCTC ACC TTC ACA TCC GGT CCT GTT GCT GGC AAG AAG ATG GTC GTC CAG 557Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Val Val Gln95 100 105TCC ACC AGC ACT GGC GGT GAT CTT GGC AGC AAC CAC TTC GAT CTC AAC 605Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn110 115 120ATC CCC GGC GGC GGC GTC GGC ATC TTC GAC GGA TGC ACT CCC CAG TTC 653Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe125 130 135GGC GGT CTG CCC GGC CAG CGC TAC GGC GGC ATC TCG TCC CGC AAC GAG 701Gly Gly Leu Pro Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu140 145 150TGC GAT CGG TTC CCC GAC GCC CTC AAG CCC GCC TGC TAC TGG CGC TTC 749Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe160 165 170GAC TGG TTC AAG AAC GCC GAC AAC CCG AGC TTC AGC TTC CGT CAG GTC 797Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gln Val175 180 185CAA TGC CCA GCC GAG CTC GTC GCT CGC ACC GGA TGC CGC CGC AAC GAC 845Gln Cys Pro Ala Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp190 195 200GAC GGC AAC TTC CCT GCC GTC CAG ATC CCC TCC AGC AGC ACC AGC TCT 893Asp Gly Asn Phe Pro Ala Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser205 210 215CCG GTC GGC CAG CCT ACC AGT ACC AGC ACC ACC TCC ACC TCC ACC ACC 941Pro Val Gly Gln Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr220 225 230 235TCG AGC CCG CCC GTC CAG CCT ACG ACT CCC AGC GGC TGC ACT GCT GAG 989Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu240 245 250AGG TGG GCT CAG TGC GGC GGC AAT GGC TGG AGC GGC TGC ACC ACC TGC1037Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly ASn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys255 260 265GTC GCT GGC AGC ACC TGC ACG AAG ATT AAT GAC TGG TAC CAT CAG TGC1085Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys270 275 280CTG TAA ACGCAGGGCA GCCTGAGAAC CTTACTGGTT GCGCAACGAA ATGACACTCC 1141LeuCAATCACTGT ATTAGTTCTT GTACATAATT TCGTCATCCC TCCAGGGATT GTCACATATA 1201TGCAATGATG AATACTGAAC ACAAACCTGG CCGCTTGAAC TGGCCGAAGG AATGCC 125權利要求
1．含有序列1記載的胺基酸序列的一部分或含有1～284號的序列的蛋白質和其變化的蛋白質。
2．權利要求1記載的蛋白質和其變化的蛋白質，其特徵是在N末端一側還具有序列1記載的-21～-1號胺基酸序列的一部分或全部序列。
3．權利要求1和2記載的蛋白質和其變化的蛋白質，其特徵是具有葡聚糖內切酶活性。
4．權利要求1～3中任一項記載的編碼蛋白質或其變化的蛋白質的DNA序列。
5．權利要求4記載的的DNA序列，其特徵是含有序列2記載的鹼基序列的一部分或全部序列。
6．權利要求5記載的的DNA序列，其特徵是含有序列2記載的鹼基序列的118～1088號的鹼基序列。
7．含有權利要求4～6中任一項記載的DNA序列的載體。
8．利用權利要求7記載的載體進行轉化的宿主細胞。
9．權利要求1～3中任一項記載的蛋白質或其變化的蛋白質的製備方法，其特徵包括培養權利要求8記載的宿主細胞，從其培養物中提取權利要求1～3中任一項記載的蛋白質和其變化的蛋白質的提取工序。
10．含有權利要求1～3中任一項記載的蛋白質或其變化的蛋白質的纖維素酶製劑。
11．含纖維素纖維細毛的去除方法，其特徵包括使權利要求1～3中任一項記載的蛋白質或其變化的蛋白質或權利要求7記載的纖維素酶製劑與含纖維素纖維接觸的工序。
12．斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色加工方法，其特徵包括使權利要求1～3中任一項記載的蛋白質或其變化的蛋白質或權利要求7記載的纖維素酶製劑與斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維接觸的工序。
13．含纖維素纖維的減量加工方法，其特徵包括使權利要求1～3中任一項記載的蛋白質或其變化的蛋白質或權利要求7記載的纖維素酶製劑與含纖維素纖維接觸的工序。
14．權利要求1～3中任一項記載的蛋白質或其變化的蛋白質或權利要求7記載的纖維素酶製劑在去除含纖維素纖維細毛中的應使用。
15．權利要求1～3中任一項記載的蛋白質和其變化的蛋白質或權利要求7記載的纖維素酶製劑在斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色加工中的應用。
16．權利要求1～3中任一項記載的蛋白質或其變化的蛋白質或權利要求7記載的纖維素酶製劑含纖維素纖維的減量加工中的應用。
全文摘要
公開了理想的可用於含纖維素纖維細毛的去除、減量加工和斜紋粗棉布染色中含纖維素纖維的脫色加工的高活性纖維素酶及其基因。從Humicola insolens分離的新的纖維素酶NCE4是高活性的纖維素酶,該酶可以用於各種含纖維素纖維的處理。
文檔編號D06P5/13GK1230988SQ97198010
公開日1999年10月6日 申請日期1997年7月24日 優先權日1996年7月24日
發明者村島弘一郎, 浜谷徹, 古賀仁一郎, 河野敏明, 守屋達樹, 隅田奈緒美, 青柳薰, 村上健 申請人:明治制果株式會社