一種提高麥冬多糖抗病毒活性的硫酸化修飾方法
2023-10-05 21:20:19 2
專利名稱：一種提高麥冬多糖抗病毒活性的硫酸化修飾方法
技術領域：
本發明一種提高麥冬多糖抗病毒活性的硫酸化修飾方法，屬於中藥多糖的結構改造技術領域。
背景技術：
多糖廣泛存在於動物、植物和微生物組織中，是由單糖聚合而成的天然高分子化 合物，是生物體內除蛋白質和核酸外又一類重要的生物大分子，具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節等生物活性。多糖的生物活性與其結構有著密切的關係，特別是當引入某些化學基團時，使糖鏈的柔韌性和空間結構發生變化，從而引起多糖的生物學活性改變或使多糖產生新的活性。因此，對多糖結構進行適當的化學修飾是多糖領域研究的熱點。多糖的化學修飾主要有硫酸化、磷酸化的、硒化等方法。由於硫酸化修飾能顯著提高多糖的抗病毒活性而倍受關注。常用硫酸化修飾方法有濃硫酸法、氯磺酸-吡啶法、氯磺酸-甲醯胺法、三氧化硫-吡啶法等。其中氯磺酸-吡啶法以其試劑易製備、反應條件相對簡單、產物回收方便等優點而最為常用。影響氯磺酸-吡啶法修飾的主要因素有氯磺酸-吡啶配比、反應溫度、反應時間。麥冬是傳統的滋陰類中藥，具有養陰生津、潤肺清心的功效，主治心腹結氣、肺燥乾咳、虛癆咳嗽、津傷口渴、心煩失眠、內熱消渴、腸燥便秘等病症。研究表明，麥冬含有多種有效成分，包括留體皂苷、多糖、高異黃酮類、胺基酸等。麥冬多糖是主要有效成分之一，具有增強免疫、抗心肌缺血、降血糖、耐缺氧、抗過敏等作用，而麥冬多糖的抗病毒活性鮮見報導。根據文獻和本研究室的前期工作證明，硫酸化修飾能夠顯著提高多糖的生物活性、尤其是抗病毒活性。本發明首次對麥冬多糖進行硫酸化修飾，建立了麥冬多糖的硫酸化修飾方法，基於產物的抗病毒活性優化了修飾條件，發現硫酸化修飾能顯著麥冬多糖的抗病毒活性。
發明內容
技術問題本發明針對中藥多糖生物活性低的問題，提供一種提高麥冬多糖抗病毒活性的硫酸化修飾方法，達到顯著提高麥冬多糖的抗病毒活性的目的。技術方案一種提高麥冬多糖抗病毒活性的硫酸化修飾方法，包括提取、純化麥冬多糖，用氯磺酸-吡啶法對麥冬多糖進行硫酸化修飾，其特徵在於，基於產物的抗病毒活性確定的最佳修飾條件為氯磺酸與吡啶的質量比I : 4，反應溫度60°C，反應時間2h ;並篩選出一種活性最好的硫酸化麥冬多糖產品。有益效果I.建立了麥冬多糖的硫酸化修飾方法，以產物的的抗病毒活性為指標，通過正交實驗優化了麥冬多糖的硫酸化修飾條件。
2.證明硫酸化修飾能夠顯著提高麥冬多糖的抗病毒活性，並篩選出一種抗病毒活性最好的硫酸化麥冬多糖，為研製抗病毒製劑提供材料。與現有技術相比，本發明優點如下I.麥冬多糖的硫酸化修飾國內外未見報導,本發明提供了一種提高麥冬多糖抗病毒活性的硫酸化修飾方法及其優化的修飾條件，填補了國內外研究的空白。2.麥冬多糖的抗病毒活性未見報導，通過本發明的實施，證明天然麥冬多糖的抗病毒作用微弱，通過硫酸化修飾能夠顯著提高其抗病毒活性，並篩選出一種活性最好的硫酸化麥冬多糖，可以作為新型抗病毒藥物的材 料。
具體實施例方式I.麥冬多糖的提取取麥冬飲片lOOOg，粉碎成0. 3 Icm3小塊，加95%乙醇2000mL浸泡12h，80°C水浴回流2次，每次I. 5h，藥渣晾12h後加9倍量水煎煮3次，時間依次為90、60、60min，合併濾液，濃縮至1000mL，2500rpm離心20min，上清液加入95%乙醇使醇含量達80%，4°C靜置24h，回收乙醇，離心，沉澱凍乾燥，得到粗的麥冬多糖。2.麥冬多糖的純化將粗麥冬多糖用三氯乙酸法去蛋白，用蒸餾水溶解成50mg mL—1，上DEAE-纖維素-52 (2. 5cmX 30cm)層析柱,用蒸懼水洗脫,流速ImL^mirT1,自動部分收集器收集洗脫液，每管5mL，用苯酚-硫酸法檢測多糖，繪製洗脫曲線(得到I個峰)。合併含糖管洗脫液，減壓濃縮，冷凍乾燥，得到純化的麥冬多糖(0PS)。3.麥冬多糖的硫酸化修飾(I)修飾條件優化由於試劑配比、反應溫度、反應時間是影響多糖硫酸酯化的主要因素，在預實驗的基礎上，以氯磺酸與吡啶的體積比(A)、反應溫度(B)和反應時間(C)為因素，按3因素3水平的L9 (34)正交試驗設計9種修飾條件(表I)。表IL9(34)正交試驗設計因素水平表
因素
水平---------
AB (°C)C (h)
1I 460I
2I 6802
3I 8953(2)酯化試劑製備將帶有攪拌和冷凝裝置的三頸燒瓶置冰鹽水浴中，按表I設定的試劑配比加入預冷的無水吡啶25mL，快速攪拌，充分冷卻後，逐滴加入氯磺酸，於40min內加完，見燒瓶中出現大量淡黃色固體時停止反應。共製備9種酯化試劑。(3)修飾操作取麥冬多糖(OPS) 3. 6g平均分成9份，分別混懸於N，N-二甲基甲醯胺(DMF)後，加入到酯化試劑中，按表I設定的反應溫度和時間在水浴中振蕩反應。反應結束後加入IOOmL冰水終止反應,冷卻至室溫,用飽和氫氧化鈉溶液中和pH至7 8,邊攪拌邊緩慢加入3倍體積的無水乙醇，靜置24h，離心，取沉澱用自來水透析2d、蒸餾水透析Id,透析液冷凍乾燥,分別得到9個硫酸化麥冬多糖(sulfated OPSs, sOPSs),依次標記為SOPS1 sOPS9。用苯酚-硫酸法測定多糖含量，氯化鋇-明膠法測定硫酸根含量，按下式計算取代度(DS) DS = (I. 62XS% )/(32-1. 02XS% )正交試驗結果顯示，SOPS2的產物量最高，為874mg，其次是sOPS5、SOPS1和sOPS3 ；SOPS2的取代度最高，為I. 62%，其次是sOPS5、SOPS1, sOPS8和sOPS3 ；sOPS4的糖含量最高，% 50. 3%,其次是 SOPS1、SOPS3 和 SOPS7(表 2)。表2L9 (34)正交試驗結果
權利要求
1.一種麥冬多糖的硫酸化修飾方法，包括提取、純化麥冬多糖，用氯磺酸-吡啶法對麥冬多糖進行硫酸化修飾，其特徵在於，修飾條件為氯磺酸與吡啶的質量比I : 4，反應溫度60°C，反應時間2h。
2.權利要求I所述方法獲得的硫酸化麥冬多糖的抗病毒活性最強，較未修飾的麥冬多糖的活性顯著提高。
全文摘要
本發明為一種提高麥冬多糖抗病毒活性的硫酸化修飾方法，屬於中藥多糖的結構改造技術領域。提取、純化麥冬多糖，用氯磺酸-吡啶法進行硫酸化修飾，以產物的抗病毒活性為指標，用L9(34)正交實驗對試劑配比、反應溫度和反應時間3因素進行優選，確定最佳修飾條件為氯磺酸與吡啶的質量比1∶4，反應溫度60℃，反應時間2h，所得硫酸化麥冬多糖的抗病毒活性最強。本發明能顯著提高麥冬多糖的抗病毒活性。
文檔編號C08B37/00GK102718883SQ20121022604
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月3日 優先權日2012年7月3日
發明者劉家國, 張靖, 王德雲, 胡元亮, 陳興潁, 陳曉蘭 申請人:南京農業大學