一種Ⅰ型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體的製備方法及其產品和應用的製作方法

2023-10-06 01:20:54 1

一種Ⅰ型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體的製備方法及其產品和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種Ⅰ型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體的製備方法及其產品和應用。本發明的一種Ⅰ型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體的製備方法，包括收集高免蛋、高免蛋消毒、海藻酸鈉除脂、硫酸銨沉澱、抗體的超濾膜濃縮和純化以及滅活除菌等步驟。研究結果表明，本發明採用海藻酸鈉除脂、硫酸銨沉澱提取得到的Ⅰ型和新型鴨病毒性肝炎二價蛋黃抗體，抗體純度高、效價高、副反應小、治療效果明顯，能夠安全方便的用於Ⅰ型以及新型鴨肝炎病毒的同時防治。
【專利說明】一種I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體的製備方法及其產品和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種卵黃抗體的製備方法，特別涉及一種I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體的製備方法及其產品和應用。本發明屬於水禽用生物製品【技術領域】。
【背景技術】
[0002]鴨A型肝炎(Duck Hepatitis A, DHA)是由鴨A型肝炎病毒(Duck Hepatitis AVirus, DHAV)引起雛鴨的一種以肝臟為主要病理變化的急性、高度致死性、接觸性傳染病。該病主要侵害I~3周齡的雛鴨，傳播迅速，發病嚴重，臨床症狀主要表現為痙攣、抽搐和角弓反張，以肝臟腫脹和出血為主要病理變化。病鴨多在出現症狀後的I小時內死亡，10日齡雛鴨感染後死亡率可達90%以上，該病已經成為嚴重危害養鴨業的主要疾病之一。
[0003]鴨肝炎病毒包含嗜肝病毒科、星狀病毒科和小核糖核酸病毒科3個病毒科的4種病毒。嗜肝病毒科的鴨肝炎病毒引起鴨B型肝炎，其對鴨沒有顯著的致病性；星狀病毒科引起II型鴨肝炎，目前為止僅英國有發病報導；目前我國流行的是由小核糖核酸病毒科引起的I型和新型鴨A型肝炎。對於血清I型病毒，我國已經採用了多年的卵黃抗體進行預防和治療，並取得了一定的效果，但今年來不斷從病鴨中同時分離到I型和新型鴨肝炎病毒，證明我國多地出現血清I型和新型鴨肝炎混合感染的情況。血清中和試驗表明，I型和新型之間缺乏交叉保護作用，I型卵黃抗體很難對流行的新型鴨肝炎病毒進行預防，I型和新型二價卵黃抗體是預防和控制鴨病毒性肝炎的必然要求，因此探討I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體的提取方法對有效防治該病具有是十分重要的意義。
[0004]卵黃抗體(egg yolk antibodies, IgY)是指產蛋雞受特定抗原免疫後產生並轉移和貯存在卵黃中的特異性抗體，從蛋黃中將IgY提取並應用在動物疾病的防治中已得到廣泛認可。但IgY被廣泛應用的前提是如何將卵黃中將大量的IgY提取、純化出來。近年來，國內外學者報導了許多卵黃抗體的製備方法，但由於提取方法的不當，缺少抗體純化過程，導致提取過程中，抗體大量損失，效價大幅降低，大量雜蛋白及脂肪等物質未被除去，同時存在提取藥品的殘留。其結果是一方面，造成抗體提取成本的提高；其另一方面，造成抗體注射困難、難以吸收、注射局部腫脹、過敏反應嚴重，直接導致抗體治療效果不佳，嚴重影響抗體的使用效果，極大的限制了卵黃抗體在疾病防治上的應用。
[0005]目前常採用的方法包括酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法以及辛酸法等，其中酸化水提取法除脂效果不佳，卵黃抗體中含有大量雜蛋白；聚乙二醇法中使用聚乙二醇易溶於水，目前尚沒有辦法去除，對畜禽有一定的危害，IgY含有一定雜蛋白，抗體純度不高；氯仿法中使用氯仿有殘留和毒性，對卵黃抗體的品質有較大影響，易引起注射部位腫脹，及動物全身不良反應；辛酸法 中辛酸在水中溶解度極低(0.062g/L),因此在水溶性物質中辛酸殘留量極微。在醫學工業中辛酸已被廣泛應用，對生物不具毒副作用。但單純使用辛酸萃提，蛋白純度低，效價低，治療效果不明顯。
【發明內容】

[0006]針對現有技術中存在的種種技術缺陷，本發明所要解決的技術問題之一，是提供一種卵黃抗體的提取方法，以解決目前存在的由於提取方法的不當，缺少抗體純化過程，導致提取過程中，抗體大量損失，效價大幅降低，大量雜蛋白及脂肪等物質未被除去，同時存在提取藥品的殘留的問題。
[0007]為了達到上述目的，本發明採用的技術手段為:
[0008]本發明的一種卵黃抗體(egg yolk antibodies, IgY)的提取方法,其特徵在於包括以下步驟:
[0009](1)收集高免蛋；
[0010](2)將高免蛋浸入新潔爾滅水溶液中消毒，然後用甲醛燻蒸高免蛋，打破蛋殼，除去蛋清、胚盤和系帶，收集卵黃；
[0011](3)除脂
[0012]量取卵黃體積，加入滅菌玻璃瓶內，按其體積的1.5-2.5倍加入海藻酸鈉溶液，混合併調至PH5.0-5.2，置2~8°C保存過夜；
[0013]其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計，含有0.1-0.15% (w/w)的海藻酸鈉以及0.02-0.08% (w/w)的NaCl，其餘為純化水；
[0014](4)鹽析
[0015]次日，吸取上清液，調pH7.2，加入硫酸銨至終濃度為28% (w/w),再攪拌均勻，離心，棄掉上清，沉澱用PBS緩衝液溶解沉澱；
[0016](5)抗體的純化
[0017]沉澱溶解液經截留分子量為50KD的超濾膜包過濾濃縮至原體積1/5，加入PBS緩衝液恢復至原體積再進行濃縮，反覆3次，獲得卵黃抗體原液，置2~8°C保存；
[0018](6)抗體的滅活除菌
[0019]獲得的卵黃抗體原液用滅菌生理鹽水稀釋後經甲醛溶液滅活，然後經濾膜過濾得到最終的卵黃抗體提取液。
[0020]在本發明中，優選的，步驟(2)中是將高免蛋浸入1%。(v/v)新潔爾滅水溶液中消毒15分鐘，然後用甲醛燻蒸雞蛋30分鐘。
[0021]在本發明中，優選的，步驟(3)中按所量取的卵黃體積的2倍加入海藻酸鈉溶液，其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計，含有0.12%的海藻酸鈉以及0.05%的NaCl，其餘為純化水。
[0022]在本發明中，優選的，步驟(4)或(5)中所述的PBS緩衝液為0.15mol/L的PBS緩衝液，PH7.2。
[0023]在本發明中，優選的，步驟(6)中將獲得的卵黃抗體原液用滅菌生理鹽水稀釋至病毒抗體中和效價≥1:512，經終濃度為0.04%(v/v)的甲醛溶液37°C滅活24h ;再用0.45 μ m濾膜過濾得到最終的卵黃抗體提取液。
[0024]通過與目前普遍使用的卵黃抗體的提取方法，例如酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法、辛酸法相比，結果發現分別用酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法、辛酸法和海藻酸鈉硫酸銨法提取的IgY經SDS-PAGE電泳後，純度存在明顯差異，5種方法提取的IgY均在67kD和22kD左右，出現IgY的重鏈和輕鏈電泳條帶，而用酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法、辛酸法提取的IgY，還在34kD~55kD之間出現非目的蛋白的電泳條帶。說明以上四種方法提取的IgY，含有雜蛋白，蛋白純度較低，結果如圖1所示。[0025]本發明所要解決的技術問題之二，是提供一種I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體的製備方法，以解決方法現有卵黃抗體提取方法中存在的抗體效價低，抗體純度不高，治療效果不佳的問題，同時提供一種能夠同時對I型、新型鴨肝炎起到防治作用的二價卵黃抗體。
[0026]為了達到上述目的，本發明採用的技術手段為:
[0027]本發明的一種I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體的製備方法，其特徵在於包括以下步驟:
[0028](I)收集高免蛋，所述的高免蛋中含有抗血清I型鴨肝炎病毒和新型鴨肝炎病毒的抗體；
[0029]其中，所述的血清I型鴨肝炎病毒為鴨A型肝炎病毒SD株，命名為DHAV-SD，分類命名為鴨A型肝炎病毒，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2013年12月9日，微生物保藏編號為=CGMCC N0.8560 ；
[0030]所述的新型鴨肝炎病毒為鴨A肝病毒JS株，命名為DHAV-JS，分類名是:鴨A肝病毒，微生物保藏編號是=CGMCC N0.6852。保藏時間是:2012年11月13日；保藏單位是:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，該病毒株已記載在申請號為201210562151.7，發明名稱為一種鴨A肝病毒JS株及其在鴨病毒性肝炎防治中的應用的中國專利申請中；
[0031](2)將高免蛋浸入新潔爾滅水溶液中消毒，然後用甲醛燻蒸高免蛋，打破蛋殼，除去蛋清、胚盤和系帶，收集卵黃；
[0032](3)除脂
[0033]量取卵黃體積，加入滅菌玻璃瓶內，按其體積的1.5-2.5倍加入海藻酸鈉溶液，混合併調至PH5.0-5.2，置2~8°C保存過夜；
[0034]其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計，含有0.1-0.15% (w/w)的海藻酸鈉以及0.02-0.08% (w/w)的NaCl，其餘為純化水；
[0035](4)鹽析
[0036]次日，吸取上清液，調pH7.2，加入硫酸銨至終濃度為28% (w/w),再攪拌均勻，離心，棄掉上清，沉澱用PBS緩衝液溶解沉澱；
[0037](5)抗體的純化
[0038]沉澱溶解液經截留分子量為50KD的超濾膜包過濾濃縮至原體積1/5，加入PBS緩衝液恢復至原體積再在進行濃縮，反覆3次，獲得卵黃抗體原液，置2~8°C保存；
[0039](6)抗體的滅活除菌
[0040]將獲得的卵黃抗體原液用滅菌生理鹽水稀釋至鴨肝炎病毒血清I型和新型鴨肝炎病毒的抗體中和效價≥1:512，經終濃度為0.04% (v/v)的甲醛溶液37°C滅活24h ;再用
0.45 μ m濾膜過濾得到最終的I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體提取液。
[0041]在本發明中，優選的，步驟(1)中所述的高免蛋，經中和試驗檢測，鴨肝炎病毒血清I型和新型鴨肝炎病毒的抗體效價均> 1:1024。
[0042]在本發明中，優選的，步驟(2)中是將高免蛋浸入1%。(v/v)新潔爾滅水溶液中消毒15分鐘，然後用甲醛燻蒸雞蛋30分鐘。
[0043]在本發明中，優選的，步驟(3)中按所量取的卵黃體積的2倍加入海藻酸鈉溶液，其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計，含有0.12% (w/w)的海藻酸鈉以及0.05%(w/w)的NaCl,其餘為純化水。
[0044]本發明所要解決的技術問題之三是提供一種由以上任一項所述的製備方法製備得到的I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體。
[0045]本發明所要解決的技術問題之四是提供所述的I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體在製備預防或治療I型及/或新型鴨肝炎藥物中的應用。
[0046]研究結果表明，本發明採用海藻酸鈉除脂、硫酸銨沉澱提取得到的I型和新型鴨病毒性肝炎二價蛋黃抗體，抗體純度高、效價高、副反應小、治療效果明顯，能夠安全方便的同時用於I型以及新型鴨肝炎的防治。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]圖1為採用不同方法提取得到的IgY的SDS-PAGE電泳圖。
[0048]1、蛋白Marker ;2、酸化水法提取的IgY ;3、聚乙二醇法提取的IgY ;4、氯仿法提取的IgY ;5、辛酸法提取的IgY ;6、本發明的海藻酸鈉-硫酸銨法提取的IgY。
【具體實施方式】
[0049]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
`[0050]實施例1 I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體的製備
[0051]1、生產用毒株
[0052]制苗免疫原用血清I型鴨肝炎病毒SD株和新型鴨肝炎病毒JS株，均由哈藥集團生物疫苗有限公司分離、鑑定、保管和供應。
[0053]血清I型鴨肝炎病毒SD株(DHAV-SD)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，微生物保藏編號為=CGMCC N0.8560。
[0054]新型鴨肝炎病毒JS株(DHAV-JS)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中，微生物保藏編號是=CGMCC N0.6852。
[0055]2、疫苗(免疫原)的製備
[0056]2.1血清I型鴨肝炎病毒SD株原液的製備
[0057]取血清I型鴨肝炎病毒SD株，用滅菌生理鹽水稀釋1000倍，經尿囊腔接種11日齡鴨胚，每胚0.2ml，置37°C繼續孵育。鴨胚接種後，將24小時前死亡的鴨胚棄去。在24~96小時內死亡的鴨胚隨時取出，氣室向上直立於2~8°C冷卻12小時後,無菌收取絨毛尿囊、胎兒、胚液及羊水，勻漿後、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合於無菌容器中，置2~8°C保存。
[0058]2.2新型鴨肝炎病毒JS株原液的製備
[0059]取新型鴨肝炎病毒JS株，用滅菌生理鹽水稀釋1000倍，經尿囊腔接種11日齡鴨胚，每胚0.2ml，置37°C繼續孵育。鴨胚接種後，將24小時前死亡的鴨胚棄去。在24~96小時內死亡的鴨胚隨時取出，氣室向上直立於2~8°C冷卻12小時後，無菌收取絨毛尿囊、胎兒、胚液及羊水，勻漿後、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合於無菌容器中，置2~8°C保存。
[0060]2.3抗原的濃縮
[0061 ] 將鴨肝炎病毒SD株鴨胚液和JS株鴨胚液分別倒入透析袋，紮緊透析袋兩端，放入400g/L的PEG20000中進行濃縮，當濃縮到原體積的1/20時取出，加適量pH7.2PBS衝洗袋壁，使最終體積為原液的1/10，並按現行《中國獸藥典》規定進行無菌檢驗，無菌生長，並測定毒價。每0.2ml病毒含量均不低於105_°ELD5(i。
[0062]2.4 滅活
[0063]濃縮後的抗原加入終濃度為0.2% (v/v)的甲醛溶液，密封置37°C作用48小時(期間6~8小時振搖I次)。
[0064]2.5滅活檢驗
[0065]將滅活後的SD株和JS株病毒抗原分別經尿囊腔接種11日齡鴨胚10枚，每胚
0.2ml置37°C培養觀察168小時。鴨胚全部健活且無病變。
[0066]2.6油乳劑滅活疫苗的製備
[0067]2.6.1水相製備
[0068]取濃縮並檢驗合格的SD株和JS株病毒鴨胚液，分別按每96ml鴨胚液加入4ml吐溫-80，各自於滅菌容器內充分振搖使吐溫-80完全溶解為止。
[0069]2.6.2油相製備
[0070]按注射用白油94份，司本-806份，硬脂酸鋁1.5份的比例配製油相，混合加熱完全熔解後，在115°C滅菌40分鐘，冷至室溫備用。
[0071]2.6.3 乳化
[0072]按水相和油相1:1.5的比例，將油相分別注入預混罐中，低溫攪拌的同時，各自緩慢加入兩種水相，再注入乳化罐乳化5分鐘。即成為接種蛋雞鴨肝炎病毒JS株和SD株滅
活疫苗。
[0073]2.7滅活疫苗檢驗
[0074]2.7.1 性狀
[0075]外觀:乳白色乳劑
[0076]劑型:油包水型。取一清潔吸管吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均不擴散。
[0077]穩定性:吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相< 0.5ml ο
[0078]黏度:用Iml吸管(下口內徑為1.2謹，上口內徑為2.7謹)吸取25°C左右疫苗1ml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需的時間，結果:在8秒以內。
[0079]2.7.2無菌檢驗
[0080]按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，結果:無菌生長。
[0081]2.7.3安全檢驗
[0082]取健康雛鴨20隻，其中10隻肌肉多點注射鴨肝炎病毒JS株滅活疫苗2ml，另10隻肌肉多點注射鴨肝炎病毒SD株滅活疫苗2ml。同時用條件相同的對照雛鴨10隻與免疫雛鴨同條件飼養，觀察10日，注射組和對照組雛鴨均健活。
[0083]3高免蛋的製備
[0084]3.1高免蛋雞的選擇
[0085]產蛋雞應具有商品蛋雞的生產性能，產蛋率維持在80%以上。按0.5%抽樣ELISA檢測禽白血病、禽傳染性貧血、禽網狀內皮組織增殖病，全部為陰性；監測雞白痢和雞支原體，二者的陽性率不超過0.1%。
[0086]3.2產蛋雞的免疫
[0087]3.2.1基礎免疫接種
[0088]將產蛋雞肌肉多點注射鴨肝炎病毒SD株和JS株滅活疫苗各1.0ml0
[0089]3.2.2加強免疫接種
[0090]在基礎免疫後10日進行第2次接種，產蛋雞肌肉多點注射鴨肝炎病毒SD株和JS株滅活疫苗各2.0ml0
[0091]3.2.3強化免疫接種[0092]在加強免疫後10日進行第3次接種，產蛋雞肌肉多點注射鴨肝炎病毒SD株和JS株滅活疫苗各3.0ml0
[0093]3.2.4維持免疫接種
[0094]在強化免疫接種後根據抗體效價，每隔2~3個月再加強接種I次，產蛋雞肌肉多點注射鴨肝炎病毒SD株和JS株滅活疫苗各3.0ml0
[0095]4.1型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體的製備
[0096]4.1高免蛋的採集
[0097]產蛋雞強化免疫接種結束後10日，每隔5日抽樣測定高免雞蛋黃中的鴨肝炎病毒抗體效價。經中和試驗檢測，血清I型和新型鴨肝炎病毒抗體效價均> 1:1024時收集雞蛋，置2~8°C貯存。
[0098]4.2蛋殼消毒與分離卵黃
[0099]將採集的高免蛋浸入1%。(v/v)新潔爾滅水溶液中消毒15分鐘。然後用甲醛燻蒸雞蛋30分鐘。打破蛋殼，除去蛋清、胚盤和系帶，收集卵黃。
[0100]4.3 除脂
[0101]量取卵黃體積，加入滅菌玻瓶內，按其2倍體積量加0.12%海藻酸鈉溶液(按重量百分比計，含0.12% (w/w)海藻酸鈉以及0.05% (w/w) NaCl，其餘為純化水)混合併調至PH5.2，置2~8°C保存過夜。
[0102]4.4 鹽析
[0103]次日，吸取上清液，調pH7.2，加入硫酸銨至終濃度為28% (w/w)，再攪拌均勻。以4000r/min離心20分鐘，棄掉上清。沉澱用適量的PBS (0.15mol/L, pH7.2)溶解沉澱。
[0104]4.5抗體純化
[0105]溶解液經截留分子量為50KD的超濾膜包過濾濃縮至原體積1/5，加入PBS(0.15mol/L, pH7.2)恢復至原體積再在進行濃縮，反覆3次，脫去硫酸銨，獲得卵黃抗體原液，置2~8°C保存。
[0106]4.6抗體的滅活除菌
[0107]提取的卵黃抗體用滅菌生理鹽水稀釋至血清I型和新型鴨肝炎病毒抗體中和效價均≥1:512,經終濃度為0.04% (v/v)的甲醛溶液37°C滅活24h ;再用0.45 μ m濾膜過濾得到最終的卵黃抗體提取液。
[0108]5成品檢驗
[0109]5.1性狀檢驗
[0110]本品為略帶白色澄明液體，久置有少量沉澱。
[0111]5.2無菌檢驗
[0112]按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，無菌生長。
[0113]5.3支原體檢驗
[0114]按現行《中國獸藥典》 附錄進行檢驗，無支原體生長。
[0115]5.4外源病毒檢驗
[0116]按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，無外源病毒汙染。
[0117]5.5安全檢驗
[0118]用3日齡易感雛鴨10隻，各頸部皮下注射抗體2.0ml/只，觀察10日，全部健活。用體重18~22g小白鼠5隻,各皮下注射抗體0.5ml/只,觀察10日，小白鼠全部健活。
[0119]5.6銨鹽殘留量測定
[0120]按現行《中國藥品檢驗標準操作規範》銨鹽檢查法進行測定，符合規定。
[0121]按照上述方法，分別製備了三批I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體，批號為201301，201302,201303。
[0122]實施例2 I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體對I型、新型鴨肝炎的預防和治療效果
[0123]1、中和試驗
[0124]按現行《中國獸藥典》2010版附錄中和試驗法固定病毒稀釋血清法，使用檢驗用種毒與系列稀釋的I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體(實施例1製備)中和後，分別尿囊腔接種11日齡鴨胚，連續觀察7天，進行測定。結果:I型和新型鴨肝炎病毒抗體中和效價均≥ 1:512。
[0125]2、攻毒保護試驗
[0126]3個批次抗體各選取3日齡易感雛鴨200隻，隨機分為1、2組，每組100隻，同時選取同批次雛鴨40隻，設置為對照組3、4組，每組20隻。1、2組每隻頸部皮下注射I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體(實施例1製備)0.5ml, 3,4組每隻頸部皮下注射生理鹽水0.5ml。24小時後，1、3組每隻分別頸部皮下注射鴨肝炎病毒SD株強毒，每隻0.5ml (含1000個LD5tl);
2、4組每隻分別頸部皮下注射鴨肝炎病毒JS株強毒，每隻0.5ml (含1000個LD5tl)觀察10日。3個批次的抗體攻毒保護試驗，結果見表1，卵黃抗體對I型和新型鴨肝炎強毒的攻毒保護率均達98%以上，對照組雛鴨80%以上死亡。結果表明提取的卵黃抗體對I型和新型鴨肝炎病毒有較好的攻毒保護效果。
[0127]表1 I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體的攻毒保護效果
【權利要求】
1.一種卵黃抗體(egg yolk antibodies, IgY)的提取方法,其特徵在於包括以下步驟: (1)收集高免蛋； (2)將高免蛋浸入新潔爾滅水溶液中消毒，然後用甲醛燻蒸高免蛋，打破蛋殼，除去蛋清、胚盤和系帶，收集卵黃； (3)除脂 量取卵黃體積，加入滅菌玻璃瓶內， 按其體積的1.5-2.5倍加入海藻酸鈉溶液，混合併調至ρΗ5.0-5.2，置2~8°C保存過夜； 其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計，含有0.1-0.15%的海藻酸鈉以及0.02-0.08%的NaCl，其餘為純化水； (4)鹽析 次日，吸取上清液，調PH7.2，加入硫酸銨至終濃度為28%，再攪拌均勻，離心，棄掉上清，沉澱用PBS緩衝液溶解沉澱； (5)抗體的純化 沉澱溶解液經截留分子量為50KD的超濾膜包過濾濃縮至原體積1/5，加入PBS緩衝液恢復至原體積再進行濃縮，反覆3次，獲得卵黃抗體原液，置2~8°C保存； (6)抗體的滅活除菌 獲得的卵黃抗體原液用滅菌生理鹽水稀釋後經甲醛溶液滅活，然後經濾膜過濾得到最終的卵黃抗體提取液。
2.如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於步驟(2)中是將高免蛋浸入1%。新潔爾滅水溶液中消毒15分鐘，然後用甲醛燻蒸30分鐘。
3.如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於步驟(3)中按所量取的卵黃體積的2倍加入海藻酸鈉溶液，其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計，含有0.12%的海藻酸鈉以及0.05%的NaCl，其餘為純化水。
4.如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於步驟(6)中將獲得的卵黃抗體原液用滅菌生理鹽水稀釋至病毒抗體中和效價≥1:512，經終濃度為0.04%的甲醛溶液37°C滅活24h ;再用0.45 μ m濾膜過濾得到最終的卵黃抗體提取液。
5.一種I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體的製備方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)收集高免蛋，所述的高免蛋中含有抗血清I型鴨肝炎病毒和新型鴨肝炎病毒的抗體，所述的血清I型鴨肝炎病毒為鴨A型肝炎病毒SD株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2013年12月9日，微生物保藏編號為=CGMCCN0.8560 ;所述的新型鴨肝炎病毒為鴨A肝病毒JS株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012年11月13日，微生物保藏編號為=CGMCC N0.6852 ； (2)將高免蛋浸入新潔爾滅水溶液中消毒，然後用甲醛燻蒸高免蛋，打破蛋殼，除去蛋清、胚盤和系帶，收集卵黃； (3)除脂 量取卵黃體積，加入滅菌玻璃瓶內，按其體積的1.5-2.5倍加入海藻酸鈉溶液，混合併調至ρΗ5.0-5.2，置2~8°C保存過夜； 其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計，含有0.1-0.15%的海藻酸鈉以及.0.02-0.08%的NaCl，其餘為純化水； (4)鹽析 次日，吸取上清液，調PH7.2，加入硫酸銨至終濃度為28%，再攪拌均勻，離心，棄掉上清，沉澱用PBS緩衝液溶解沉澱； (5)抗體的純化 沉澱溶解液經截留分子量為50KD的超濾膜包過濾濃縮至原體積1/5，加入PBS緩衝液恢復至原體積再在進行濃縮，反覆3次，獲得卵黃抗體原液，置2~8°C保存； (6)抗體的滅活除菌 將獲得的卵黃抗體原液用滅菌生理鹽水稀釋至血清I型鴨肝炎病毒和新型鴨肝炎病毒的抗體中和效價≥1:512，經終濃度為0.04%的甲醛溶液37°C滅活24h ;再用0.45 μ m濾膜過濾得到最終的I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體提取液。
6.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於步驟(1)中所述的高免蛋，經中和試驗檢測，血清I型鴨肝炎病毒和新型鴨肝炎病毒的抗體效價均> 1:1024。
7.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)中是將高免蛋浸入1%。新潔爾滅水溶液中消毒15分鐘，然後用甲醛燻蒸30分鐘。
8.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於步驟(3)中按所量取的卵黃體積的2倍加入海藻酸鈉溶液，其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計，含有0.12%的海藻酸鈉以及0.05 %的NaCl，其餘為純化水。
9.由權利要求5-8所述的製備方法製備得到的I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體。
10.權利要求9所述的I型、新型鴨肝炎二價卵黃抗體在製備預防或治療I型及/或新型鴨肝炎藥物中的應用。
【文檔編號】C07K16/02GK103709247SQ201310744694
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月30日 優先權日:2013年12月30日
【發明者】宋揚, 王彬, 柴華, 藏玉婷, 於洪濤, 閆冰, 王昊, 陳海娟, 田野, 戴金玲 申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司