一種白及多倍體植株的培育方法

2023-10-29 06:02:07

專利名稱：一種白及多倍體植株的培育方法
技術領域：
本發明涉及一種白及多倍體植株的培育方法。
背景技術：
白及為蘭科植物白及(Bletilla sfriata(Thunb.)Reiehb.f.)的乾燥塊莖，具有收斂止血，消腫生肌等功效，用於治療咯血，吐血，外傷出血，瘡瘍腫毒，皮膚皸裂等症。白及不僅藥用價值高，而且極具觀賞價值，是我國現代醫藥工業和化妝品工業的重要原材料。近年來，隨著我國中醫藥事業的發展，白及在臨床上的應用範圍不斷擴大，白及的用藥需求急劇增加。但白及種子非常細小且無胚乳，因此在自然條件下很難萌發和生長，實生苗的栽培較為困難，僅靠分株繁殖，而白及分株繁殖周期長，繁殖效率低，而且耗種量大，很難滿足大量栽培的需要。白及正面臨著資源難以滿足市場的嚴峻現實。白及種質的好壞是影響白及產量重要的因素。因此，加強白及優良品種的選育至關重要。多倍體植物在自然界中是普遍存在的，由於它們在生理上較普通植物有更強的適應性和遺傳上有較大的可塑性，使得育種學家自20世紀30年代開始就熱衷於多倍體誘導育種的研究。目前多倍體誘導育種工作在農作物、果樹、蔬菜、花卉等領域廣泛開展，取得了很好的成績，如目前多倍體馬鈴薯、西瓜等都已經投入到生產應用中，已經帶來了巨大的經濟效益和社會效益。藥用植物多倍體育種工作開展得也比較早，自從1937年布萊克斯裡用秋水仙素處理曼佗羅獲得多倍體，半個多世紀以來，育種學家對多種藥用植物進行了多倍體育種的研究，培育了許多高產優質新品種，現今，已在卷葉貝母、青蒿、金銀花、羅勒、丹參、紫錐菊、黃芪等藥用植物上誘導成功。藥用植物多倍體具有以下的優點:1.生物廣量提聞藥用植物大多以收穫根、莖、葉等營養器官為主，具有巨大性的特點，藥用植物可以利用其優勢來提高藥材產量。川黃柏同源四倍體較原植物葉子寬大而厚實，莖杆粗壯；四倍體決明種子比二倍體決明種子增重70% ；S.Amiri等研就表明多倍體曼陀羅葉片寬大，植株乾重、葉綠素含量較原植物聞。2.抗逆性提高多數的多倍體對外界環境條件具有較強的適應性，多倍體植株莖杆粗壯故能較好的抗倒伏有的還有抗旱、抗病、抗寒等特性。例如張笑藝對不同倍性的盾葉薯蕷進行高溫抗性研究，測定葉片內與高溫脅迫相關的各項生理指標，表明四倍體盾葉薯蕷對高溫脅迫具有更好的耐受性。3.藥用活性成分含量高藥用植物的多倍體育種一方面要提高產量，另一方面應使藥用植物內的化學藥效成分含量明顯增加，並且可增添新的藥效成分。例如，有研究表現盾葉薯蕷的同源四倍體中有效成分薯蕷皂苷的含量比原植物高1.2倍左右；隨著生物技術的發展，藥用植物的多倍體育種工作也取得了較大的進展，獲得了一些多倍體新品種，以其速 生、優質、高抗逆性等特性在生產上取得了較好效果。藥用植物多倍體育種拓寬了種質資源，防止了由於長期的栽培而導致的藥用植物品種退化。可以預見，生物技術在中藥材品種改良方面具有很好的應用前景，將隨著人類對其應用價值認識的提高，以及有關新技術方法的應用，從而帶動未來藥用植物的可持續、高效發展。

發明內容
本發明目的提供一種白及多倍體植株的製備方法，利用該方法可以獲得具有四倍體特徵的白及植株，且操作簡單，適合規模化生產。本發明採用的技術方案是:一種白及多倍體植株的培育方法，所述方法包括:(I)將消毒後的白及種子抖入秋水仙素溶液中，黑暗條件下培養6 8d後，離心、洗漆去除秋水仙素；所述秋水仙素溶液中秋水仙素濃度為0.1 0.4%(w/w),pH5.8 6.2,溶劑為1/2MS或MS培養液，其中還可添加0.lmg/L-1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤；白及種子可直接對蒴果進行消毒，也可將蒴果中的種子取出後進行消毒；(2)將秋水仙素處理過的白及種子轉接到白及種子萌發培養基中，先於培養箱中黑暗條件下培養5 6d，再移至培養室， 培養溫度23 27°C，光照度2000 25001x，光照12h/d，培養三個月得到多倍體白及幼苗；所述白及種子萌發培養基組成如下:1-萘乙酸0.2 0.5mg/L, pH5.8 6.2，溶劑為 1/2MS 或 MS 培養液；(3)將上述培養得到的白及幼苗，挑選出莖變粗、葉片加厚、葉色加深的植株，轉接到白及增殖培養基中進行穩定擴繁，選取2 3代性狀穩定的植株進行多倍體的鑑定；所述白及增殖培養基組成如下:6_節氨基嘌呤1.0 2.0mg/L, 1-萘乙酸0.1 0.5mg/L,pH5.8 6.2，溶劑為1/2MS或MS培養液；(4)鑑定為多倍體的植株轉接到生根壯苗培養基中進行培養，即獲得白及多倍體植株的幼苗；所述生根壯苗培養基組成如下:1-萘乙酸0.5 0.6mg/L，香蕉汁(香蕉去皮切片加水煮，按照重量最後定容後過濾即為香蕉汁，約300g香蕉定容至1L)5 10%(v/v)，PH5.8 6.2，溶劑為1/2MS或MS培養液。幼苗在生根壯苗培養基中待根長到2cm以上時，打開瓶蓋，至於室溫下培養2 4天後，取出小苗，洗去根部培養基，栽入營養土中，澆透水，並用塑料薄膜覆蓋一周後去除地膜，定期進行澆水施肥等管理，直至長成白及四倍體植株，塊莖巨大，故稱為巨莖白及(參見圖5)。步驟(I)所述消毒方法可如下:取白及蒴果，用洗衣粉浸泡8 lOmin，自來水衝洗5 5min,然後用75%乙醇消毒2 3min,無菌水衝洗,0.1%升萊消毒15 20min,無菌水衝洗，無菌吸水紙將蒴果表面殘留的水吸乾，消毒後的白及蒴果切開即獲得消毒後的白及種子。步驟(I)所述消毒方法如下:白及蒴果切開，取白及種子，加入75%乙醇，IOs後立即加入無菌水，離心或過濾，取白及種子加入0.1%升汞溶液，5min後加入無菌水，離心或過濾，取白及種子用無菌吸水紙上吸乾，即得消毒後的白及種子。具體可如下:直接取白及種子，每100 200mg的種子中加入0.5 Iml的75%乙醇，IOs後立即加入30 50ml的無菌水，1000 1500rpm離心2 5min使種子沉澱,去除液體,或者用無菌濾膜過濾出白及種子，之後加入0.5 Iml的0.1%升萊溶液,5min後加入,30 50ml的無菌水，1000 1500rpm離心2 5min使種子沉澱，去除液體，或者用無菌濾膜過濾出白及種子，無菌吸水紙上將殘留的水吸淨，可得無菌白及種子。多倍體的鑑定方法如下:於上午8 9時取組培苗植株的根尖，立即將材料放進
0.002mol/L8-0H喹啉溶液，在4°C下預處理4 6h，蒸餾水清洗3遍，在4°C下，卡諾氏液(冰醋酸:無水乙醇體積比=1:3，混勻，現用現配)在4°C下固定24h，蒸餾水漂洗3次，每次lOmin，用l.0mol/L的鹽酸常溫解離15 20min，至除根尖外根段透明呈黃色時為宜，將根尖置於蒸餾水中低滲處理約30min或更長時間，用改良苯酚品紅溶液和醋酸洋紅溶液進行染色，30min後壓片，壓至根尖分開成雲霧狀，鏡檢觀察2n=4X=64 (圖1)，作為普通白及2n=2X=32，故可確定獲得的植株為四倍體植株。多倍體的鑑定染色體中流式分析的具體內容如下:(a)細胞核提取液的配製組成為15mM Tris ；80mM KCl ；20mM NaCl ；20mMEDTA-Na2巰基乙醇；4mMMgCl2.6H20 ；0.l%TritonX-100 ；PH7.5。(b)製備RNA酶及染色液將RNA 酶 A 溶於 lOmmol/L Tris-HCl (pH7.5)、15mmol/L NaCl 中，配成 lOmg/mL的溶液，於100°c水浴中加熱15min，緩慢冷卻至室溫後分裝成小份，保存於-20°c中。碘化丙錠(propidium iodide, PI)及RNase (DNase-free)加入到細胞核提取液中，使其終濃度為lOOiig/ml，現配現用。(C)處理材料及結果分析取白及多倍體葉片以及普通白及葉片各Ig左右，加入1.8ml冰浴預冷的細胞核提取液，在培養皿裡用銳利的眼 科剪快速將其剪碎，以二倍體白及葉片作對照。然後經350目尼龍網過濾至1.5ml離心管中，4°C條件下，IOOOrpm離心5min,吸取上清液200 300 U I,加入等體積上述染色液，懸起，暗處染色5-15min,進行流式細胞儀檢測及軟體分析,發現對照組即普通白及含2C DNA，多倍體白及含4C DNA (圖2)，進一步表明本發明所得到的白及多倍體植株為四倍體植株。按照本發明方法得到的白及四倍體幼苗，其特徵如下:與二倍體白及相比，葉片明顯變厚，顏色變深，整個植株形態上明顯比二倍體白及粗大(圖3)，4X 100倍鏡下單個視野氣孔數目為5±0.907 (二倍體14±4.90)，保衛細胞長和寬分別為2.111±0.231、1.867±0.239 (二倍體白及保衛細胞長和寬分別為1.414±0.408、1.083±0.427)(圖4)。在本發明中，MS培養液配方舉例如下:大量元素母液:NH4N0316.5g ；MgS04 7H203.7g ；KH2PO41.7g ；KN0319g,加水溶解，定容至500ml ；鈣鹽母液:CaCl23.32g，加水溶解，定容至500ml ；微量元素母液:K10.0415g ;Na2Mo04 2H200.0125g ;H3B030.31g ;CuSO4 5H200.00125g ；MnS04 H2O0.845g ；CoCl2 6H200.00125g ；ZnSO4 7H200.43g，加水溶解，定容至500ml ；鐵鹽母液:EDTA二鈉 3.725g，加 100ml 水加熱溶解，FeSO4 7H202.785g，加 100ml水溶解後兩者混勻，加水配成500ml ；維生素母液:鹽酸吡哆醇(VB6) 0.025g ;鹽酸硫胺素(VBl) 0.025g ;煙酸0.025g,甘氨酸0.lg，加水溶解，定容至500ml ；
配ILMS培養液:取大量元素母液50ml，鈣鹽母液50ml，微量元素母液10ml，維生素母液IOml,鐵鹽母液5ml,加肌醇0.1g,鹿糖或白砂糖20 30g,蒸懼水定容至1L。1/2MS指溶液中所含的大量元素和鈣鹽為MS的一半，其他不變。本發明所獲得的多倍體白及植株具有能顯著提高單個塊莖的重量，植株形態特徵為:株高40 70cm，花葶長35 50cm，葉5片，葉距3 7cm，頂葉長40 _55cm，寬7 IOcm,最寬葉寬8 12cm, 45 55cm。花序著花數13 17枚,蒴果長3 5cm,直徑0.7
1.5cm。蒴果平均重1200 1800mg,最大蒴果重2300mg,單個塊莖重50 120g,直徑5 15cm0本發明的有益效果主要體現在:本發明利用白及種子為材料獲得的白及多倍體植株，具有顯著的多倍體特徵，且製備方法簡單，對白及新品種的培育工作具有重要的指導意義，本發明獲得的白及多倍體具有較高的應用價值。


圖1為實施例1步驟4)染色體計數結果，a為二倍體白及，b為四倍體白及(即本發明製備的多倍體植株)，4X 100倍鏡下觀察並拍照；圖2為實施例1步驟4)流式分析結果，a為二倍體白及，b為本發明所製備的四倍體植株；圖3為實施例1步驟5)生 根壯苗後得到的植株，a為本發明所製備的植株，b為二倍體白及植株；圖4為實施例1步驟5)得到的白及多倍體幼苗的氣孔大小結果，左邊為二倍體白及，右邊為本發明得到的多倍體白及植株，4X40倍鏡下單個視野中的氣孔數目和大小。圖5為實施例1步驟6 )中的白及塊莖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此:實施例1:I)取白及蒴果一個,用洗衣粉浸泡IOmin,用自來水衝洗5min。然後用75%乙醇消毒2min，無菌水衝洗，0.1%升汞消毒15min，無菌水將殘留的升汞衝洗乾淨，無菌吸水紙將蒴果表面殘留的水吸乾；2)將白及蒴果切開，取蒴果中的種子接入0.1%秋水仙素溶液中(以1/2MS為溶劑)，黑暗條件下培養7d。處理完畢後，IOOOrpm離心Imin使種子沉澱，取種子，用無菌蒸餾水洗滌三次，得到初步萌發的白及種子；3)將上述秋水仙素處理過的白及種子轉接到MS+0.2mg/Ll-萘乙酸的培養基中，放在培養箱進行暗培養5d，再移至培養室，培養溫度(25±2)°C，光照度2000 25001x，光照12h/d，培養三個月得到多倍體白及幼苗；4)將上述培養得到的白及幼苗，挑選出莖變粗、葉片加厚、葉色加深等外觀形態特徵的植株，轉接到MS+1.0mg/L6-節氨基嘌呤+0.lmg/Ll-萘乙酸的培養基中進行穩定擴繁，相同培養基中續代培養2 4代，2 3代後若性狀仍穩定，則進行多倍體的鑑定；
具體步驟為:於上午8 9時取多倍體以及普通白及組培苗植株的根尖，立即將材料放進0.002mol/L8-0H喹啉溶液，在4°C下預處理4 6h，蒸餾水清洗3遍，在4°C下，卡諾氏液(冰醋酸:無水乙醇=1:3，混勻，現用現配)在4°C下固定24h，蒸餾水漂洗3次，每次lOmin，用1.0mol/L的鹽酸常溫解離15 20min，至除根尖外根段透明呈黃色時為宜，將根尖置於蒸餾水中低滲處理約30min或更長時間，用改良苯酚品紅溶液和醋酸洋紅溶液進行染色，30min後壓片，壓至根尖分開成雲霧狀，鏡檢觀察多倍體植株2n=4X=64，普通白及植株2n=2X=32，確定所得到的為四倍體植株。進一步進行流式分析，主要方法步驟為:取白及多倍體葉片以及普通白及葉片各Ig左右，加入1.8ml冰浴預冷的細胞核提取液，在培養皿裡用銳利的眼科剪快速將其剪碎，以二倍體白及葉片作對照。然後經350目尼龍網過濾至1.5ml離心管中，4°C條件下，IOOOrpm離心5min,吸取上清液200 300 U I,加入等體積上述染色液，懸起，暗處染色5 15min,進行流式細胞儀檢測及軟體分析,發現對照組即普通白及含2C DNA，多倍體白及含4C DNA (圖2)，進一步表明本發明所得到的白及多倍體植株為四倍體植株。5)將四倍體白及轉接到MS+0.5mg/Ll-萘乙酸+10%香蕉汁的培養基中，待根長到2cm以上時，打開瓶蓋，至於室溫下2 4天，取出小苗，洗去根部培養基，栽入營養土中，澆透水，並用塑料薄膜覆蓋一周；6)上述白及苗在地膜覆蓋一周後去除地膜，定期進行澆水施肥等管理，三年後長成白及四倍體植株，取其中一棵植株，測得株高:66cm，塊莖直徑分別為:10X9X4cm (長X寬X厚);13X9X5cm。葉片5片，葉距3 7cm，頂葉長41cm，寬3.5 5cm，中間葉片長33cm,寬5 8cm,塊莖重93.0lg,整個植株重138g,蒴果長2.5cm,直徑0.7cm。實施例2:`
具體步驟如實施例1所述，不同的是步驟2中的秋水仙素濃度為0.20%,處理時間為9d，變異率為41.07 ± 1.34%。最後，還需注意的是，以上實施例子僅是本發明的若干個具體實施例子，本發明不限於上述的實施例，還有許多變形，本領域相關的人員能從本發明內容中直接導出或者聯想出的所有變形，均認為是本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種白及多倍體植株的培育方法，所述方法包括: (1)將消毒後的白及種子抖入秋水仙素溶液中，黑暗條件下培養6 8d後，離心、洗滌去除秋水仙素；所述秋水仙素溶液濃度為0.1 0.4%，pH5.8 6.2，溶劑為1/2MS或MS培養液； (2)將秋水仙素處理過的白及種子轉接到白及種子萌發培養基中，先於培養箱中黑暗條件下培養5 6d，再移至培養室，培養溫度23 27°C，光照度2000 25001x，光照12h/d，培養三個月得到多倍體白及幼苗；所述白及種子萌發培養基組成如下:1-萘乙酸0.2 0.5mg/L，pH5.8 6.2，溶劑為 1/2MS 或 MS 培養液； (3)將上述培養得到的白及幼苗，挑選出莖變粗、葉片加厚、葉色加深的植株，轉接到白及增殖培養基中進行穩定擴繁，選取2 3代性狀穩定的植株進行多倍體的鑑定；所述白及增殖培養基組成如下:6_節氨基嘌呤1.0 2.0mg/L, 1-萘乙酸0.1 0.5mg/L, pH5.8 6.2，溶劑為1/2MS或MS培養液； (4)鑑定為多倍體的植株轉接到生根壯苗培養基中進行培養，即獲得白及多倍體植株的幼苗；所述生根壯苗培養基組成如下:1-萘乙酸0.5 1.0mg/L,香蕉汁5 10%，PH5.8 6.2，溶劑為1/2MS或MS培養液。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(I)所述消毒方法如下:取白及蒴果，用洗衣粉浸泡8 IOmin,自來水衝洗5 5min,然後用75%乙醇消毒2 3min,無菌水衝洗，0.1%升汞消毒15 20min，無菌水衝洗，無菌吸水紙將蒴果表面殘留的水吸乾，消毒後的白及蒴果切開即獲得消毒後的白及種子。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(I)所述消毒方法如下:白及蒴果切開，取白及種子，加入75%乙醇，IOs後立即加入無菌水，離心或過濾，取白及種子加入0.1%升汞溶液，5min後加入無菌水 ，離心或過濾，取白及種子用無菌吸水紙上吸乾，即得消毒後的白及種子。
全文摘要
本發明提供了一種白及多倍體植株的培育方法，所述方法包括秋水仙素處理白及種子、白及種子萌發培養、白及幼苗增殖培養等步驟，鑑定為多倍體的植株再轉接到生根壯苗培養基中進行培養，即獲得白及多倍體植株的幼苗；本發明利用白及種子為材料獲得的白及多倍體植株，具有顯著的多倍體特徵，且製備方法簡單，對白及新品種的培育工作具有重要的指導意義，本發明獲得的白及多倍體具有較高的應用價值。
文檔編號A01H4/00GK103168685SQ20131008525
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月15日 優先權日2013年3月15日
發明者蔣福升, 丁志山, 呂迪, 李偉平, 金波, 丁濱, 高承賢 申請人:浙江中醫藥大學