一種木質纖維素類生物質高效酶水解的方法

2023-10-29 09:54:22 4

專利名稱：一種木質纖維素類生物質高效酶水解的方法
技術領域：
本發明屬於生物化學及化工領域的木質纖維素水解技術，具體涉及一種木質纖維素類生物質高效酶水解的方法。
背景技術：
隨著社會的高度發展，化石燃料的消耗越來越大，由於化石燃料的不可再生性，尋找替代能源成為人們關注的焦點。燃料乙醇由於具有高的辛烷值、清潔及低(X)2排放而倍受青睞。製備乙醇的傳統原料來自於玉米、小麥、甘蔗等糧食和糖類作物，生產技術成熟，但存在「與人爭糧、與農爭地」的問題。利用玉米秸稈、玉米芯、水稻稈等各種作物秸稈、木屑、 樹枝等農林廢棄物等木質纖維素類生物質製備纖維素乙醇，被稱作「第二代燃料乙醇」，其在提高農林廢棄物的附加值、降低環境汙染，推動農村經濟發展等方面有重要意義。纖維素乙醇製備的主流技術包括預處理、酶水解和發酵。這是因為木質纖維素類生物質主要由纖維素、半纖維素和木質素三大組分組成，各組分之間通過化學鍵連接形成緻密的結構，其中纖維素和半纖維素是糖基高分子聚合物，將其通過預處理和纖維素酶水解，獲得半纖維素和纖維素中的糖類產物，即可將其發酵製取乙醇。高效獲取木質纖維素類生物質中的糖類產物，是纖維乙醇工藝中最關鍵的技術難點。糖類產物的獲取主要來自預處理和酶水解。預處理的目的是降低木質素和半纖維素的含量，降低纖維素的結晶度，增加纖維素酶對預處理後纖維素原料的可及性，同時獲得半纖維素中的糖；酶水解是以纖維素酶將預處理後的纖維素原料水解成葡萄糖。目前預處理技術存在的最主要問題是化學法工藝(酸、鹼及有機溶劑等)過程往往存在汙染，生物法預處理(利用白腐菌等降解木質素)效率低下，導致預處理成本高；酶水解中用到的纖維素酶成本較高，生成的糖類產物濃度較低，導致酶水解效率較低。與其他預處理方式相比，高溫液態水處理屬物理方法，被譽為綠色預處理工藝，其處理過程中除了水以外無需添加化學試劑，降低了對環境的汙染，產生較少量的發酵抑制物，幾乎不會對發酵產生負面影響，能將大部分的半纖維素轉化為糖類產物，能去除部分木質素，促進了纖維素原料的酶的可及性。但該預處理方法不能大量去除木質素，導致高濃度的預處理物料酶解效率低，產糖濃度不高。以高濃度的原料進行酶水解，對提高產出的糖類產物濃度是非常有效的方法，但當預處理後的木質纖維素固體原料濃度較高時，必然帶來黏度大，混合不均勻的問題，也會抑制酶水解的順利進行。通過中華人民共和國國家知識產權局網站進行專利查詢，目前國內有關木質纖維素類生物質經預處理後再酶解的相關專利如下(1)、一種高效預處理木質纖維素的工藝，公開(公告)號CN101736631A ；(2)、將纖維素材料轉化成乙醇的方法和設備，公開(公告)號CN101268121A ；(3)、一種生物質綠色高效預處理方法，公開(公告)號CN101586136 ；(4)、一種甘蔗渣高效糖化的方法，公開(公告)號CN101619332A ；
(5)、一種高效水解木質纖維素類生物質同時製備多組分糖液及木質素的方法，公開(公告)號:CN101285106A ；(6)、一種使草漿類纖維素高效糖化的方法，公開(公告)號CN101613728A ；專利(1) ( 是有關高溫液態水預處理木質纖維素再水解的專利。專利(1)對木質纖維素採取了兩步預處理，高溫液態水是其中的第一步，第二步是稀酸處理，這有別於本發明對木質纖維素的預處理。專利( 雖然也採取了高溫液態水預處理，但對預處理後的木質纖維素的處理方式與本發明有著本質的區別。專利( 與本發明有著一定的相關性，但其側重點在於提出一種新的預處理工藝，即兩步分段變溫高溫液態水水解工藝，沒有涉及後續的酶水解。專利(4) (6)採用的預處理方法是鹼處理或酸處理，這與本發明有著本質的區別。當然，有關酶水解木質纖維素的相關專利不止這些。由於它們採取的預處理方法和酶水解方法與本發明存在本質上的區別，因此不一一羅列。

發明內容
本發明的目的是提供一種簡單、環保、酶水解處理原料濃度高、產糖濃度高和水解效率高的木質纖維素類生物質高效酶水解的方法。本發明採用高溫液態水預處理方法對木質纖維素類生物質進行預處理後，獲得木質纖維素原料，以一定濃度分散於乙酸-乙酸鈉緩衝液中，再加入一定比例的非離子表面活性劑和纖維素酶，採取攪拌的物料混合方式水解一段時間後，再分二次向反應體系中加入一定量的物料，同時按一定比例加入非離子表面活性劑和纖維素酶繼續水解，獲得主要來自於纖維素的糖類化合物和木質纖維素殘渣，從而實現在提高酶解原料濃度同時，產出高濃度糖，提高酶解效率的目的。本發明的木質纖維素類生物質高效酶水解的方法，其特徵在於，包括以下步驟在pH4. 5 4. 8，溫度為45 55°C的條件下，起初以質量體積分數為10% 15% g/mL的比率，將木質纖維素類生物質經高溫液態水預處理後獲得的木質纖維素原料，添加至0. 05 0. IM乙酸-乙酸鈉的緩衝溶液中，按10 20FPU/g纖維素的量加入纖維素酶， 按0. 075 0. 2mL/g木質纖維素原料的比率加入非離子表面活性劑，水解12 M小時後， 再按起始加入量的一半加入木質纖維素原料，同時按10 20FPU/g纖維素的量加入纖維素酶，按0. 075 0. 2mL/g木質纖維素原料的比率加入非離子表面活性劑，水解36 48小時後，再加入木質纖維素原料，使三次加入的木質纖維素原料的總計質量體積分數為20% 30% g/ml,同時按10 20FPU/g纖維素的量加入纖維素酶，按0. 075 0. 2mL/g木質纖維素原料的比率加入非離子表面活性劑，繼續水解到108 120小時，整個水解過程以攪拌的方式混勻物料。所述的木質纖維素類生物質高效酶水解的方法，優選步驟為在PH4.8，溫度為 50°C的條件下，起初以質量體積分數為10% g/mL的比率，將木質纖維素類生物質經高溫液態水預處理後獲得的木質纖維素原料，添加至0. 05M乙酸-乙酸鈉的緩衝溶液中，按20FPU/ g纖維素的量加入纖維素酶，按0. 075mL/g木質纖維素原料的比率加入Tween 80，水解M 小時後，再按起始加入量的一半加入木質纖維素原料，按20FPU/g纖維素的量加入纖維素酶，按0.075mL/g木質纖維素原料的比率加入Tween 80，水解48小時後，再加入木質纖維素原料，使三次加入的木質纖維素原料的總計質量體積分數為20% g/ml，按20FPU/g纖維素的量加入纖維素酶，按0. 075mL/g木質纖維素原料的比率加入Tween 80，繼續水解到120 小時，整個水解過程以攪拌的方式混勻物料。所述的將木質纖維素類生物質經高溫液態水預處理後獲得的木質纖維素原料，優選步驟為將木質纖維素類生物質粉碎至40 60目，按物料幹基固液比為1 10 20g/ mL的比率，加水到反應系統中，反應條件為2 4MPa，170 190°C，300 500rpm，15 30min，處理結束後，固液分離，將預處理殘渣用水洗淨，獲得木質纖維素原料。所述的木質纖維素類生物質優選包括甜高粱稈渣、甘蔗渣、玉米秸稈、玉米芯、稻草杆和木屑等農林廢棄物和速生能源林等主要成分為半纖維素、纖維素和木質素的木質纖維素類生物質。所述的非離子表面活性劑優選為Tween 80。Tween 80不會對環境造成汙染，且對微生物無害。攪拌方式可為磁力攪拌或機械攪拌。以攪拌的方式可以更好的混勻物料，增加酶和底物的反應機率，從而提高酶解效率。本發明的有益效果如下高溫液態水預處理具有價廉、環保、易於操作等優點，無需對預處理後的殘渣進行脫毒處理，簡化工藝，節約成本。酶水解過程中加入的非離子表面活性劑，可顯著提高物料酶解效率，這是因為非離子表面活性劑可通過疏水作用與木質素結合，屏蔽木質素上的纖維素酶結合位點，降低木質素對纖維素酶的無效吸附，增加游離酶的量，從而促進纖維素酶水解反應進程，提高酶解效率，而且有利於降低酶的用量，從而降低酶解反應成本。酶水解過程中，採取分3個批次，每次添加一定量的木質纖維素原料，加入一定量的纖維素酶和非離子表面活性劑，水解一定的時間，優化酶解條件，從而有效的降低了酶解物料的粘度，提高了產糖率，從而提高了水解效率。本發明將高溫液態水預處理和特定條件下的分批酶水解工藝耦合，水解效率高， 並且極大的提高了酶水解處理的木質纖維素原料濃度，濃度可達30% g/ml (質量體積分數)，在高濃度的木質纖維素原料的情況下，經過本發明的工藝，其產糖濃度高，水解效率也高，從而成功的解決了在高濃度的木質纖維素原料所引起的粘度大，混合不均勻，抑制酶水解的順利進行，而造成產糖濃度低，水解效率低的難題，實現在提高酶解原料濃度同時，產出高濃度糖，提高酶解效率的目的，從而實現了木質纖維素類生物質的高效酶水解。


圖1是本發明的工藝流程圖。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步闡述，而不是對本發明的限制。如圖1所示，將木質纖維素類生物質除去粉塵和砂石等雜質，粉碎至40 60目， 按物料幹基固液比為1 10 20g/mL的比率，加入去離子水到反應系統中，反應條件為 2 4MPa，170 190°C，300 500rpm，15 30min，處理完後，固液分離，獲得半纖維素水解液和預處理殘渣，將預處理殘渣用水洗滌乾淨，目的是去掉少量的糠醛、乙酸等影響酶解和發酵的抑制物，獲得酶水解的原料-木質纖維素原料。將此原料按以下操作加入到酶水解罐中，在pH4. 5 4. 8，溫度為45 55°C的條件下，起初以質量體積分數為10% 15% g/mL的比率，將木質纖維素原料，添加至0. 05 0. IM乙酸-乙酸鈉的緩衝溶液中，按10 20FPU/g纖維素即葡聚糖的量加入纖維素酶，按0. 075 0. 2mL/g木質纖維素原料的比率加入非離子表面活性劑，以10 200rpm的攪拌速度水解12 M小時後，再按起始加入量的一半加入木質纖維素原料至酶解罐中，同時按10 20FPU/g纖維素的量加入纖維素酶， 按0. 075 0. 2mL/g木質纖維素原料的比率加入非離子表面活性劑，同樣的反應條件下，水解36 48小時後，再加入木質纖維素原料，使三次加入的木質纖維素原料的總計質量體積分數為20% 30% g/mL,按10 20FPU/g纖維素的量加入纖維素酶，按0. 075 0. 2mL/ g木質纖維素原料的比率加入非離子表面活性劑，在相同的反應條件下，繼續水解到108 120小時，整個水解過程以攪拌的方式混勻物料，酶解結束後，固液分離，獲得主要來自於纖維素的糖類產物和木質素殘渣。對比例1取粉碎至60目的榨汁後無糖的甜高粱稈渣2g，加入IOmL 0. 05M乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4.8)中，以20FPU/g葡聚糖的比率加入纖維素酶，在50°C下進行振蕩水解120h，用 DNS法測定總還原糖濃度，得到總還原糖濃度為15. :3mg/mL，總糖回收率為13.7%。實施例1把榨汁後無糖的甜高粱稈渣粉碎到40目，按固液比1 10g/mL的比率，加入到高溫液態水反應釜中，在2Mpa、170°C、300rpm的高溫液態水環境下，處理15min，完成預處理，固液分離，獲得半纖維素水解產物和預處理後的甜高粱稈渣底物。用清水洗淨，除去酶水解及發酵抑制物，作為酶水解原料。取Ig甜高粱稈渣底物作為酶水解原料，加入IOmL 0. 05M乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4.幻中，以10FPU/g纖維素即葡聚糖的比率加入纖維素酶， 同時加入0. 075mL Tween80，在45°C下攪拌水解12小時後，再加入0. 5g甜高粱稈渣底物， 以10FPU/g葡聚糖的比率加入纖維素酶，同時加入0. 0375mL Tween80，攪拌水解3 後，再加入0. 5g預處理後的甜高粱稈渣底物，以10FPU/g葡聚糖的比率加入纖維素酶，同時加入 0. 0375mLTween80，水解至108h，用DNS法測定總還原糖濃度，得到總還原糖濃度為52. Img/ mL，總糖回收率為30.4%。實施例2把榨汁後的甜高粱稈渣粉碎到60目，按固液比1 20g/mL加入到高溫液態水反應釜中，在4Mpa、190°C、500rpm的高溫液態水環境下，處理30min，完成預處理，固液分離， 獲得半纖維素水解產物和預處理後的甜高粱稈渣底物，用清水洗淨，除去酶水解及發酵抑制物，作為酶水解原料。取1. 5g作為酶水解原料，加入IOmL 0. IM乙酸-乙酸鈉緩衝液 (PH4.8)中，以20FPU/g葡聚糖的比率加入纖維素酶，同時加入0. 3mL Tween80，在55°C下磁力攪拌水解M小時後，再加入0. 75g底物，以20FPU/g葡聚糖的比率加入纖維素酶，同時加入0. 15mLTween80，磁力攪拌水解48h後，再加入0. 75g預處理料，以20FPU/g葡聚糖的比率加入纖維素酶，同時加入0. 15mL Tween80，水解至120h，用DNS法測定總還原糖濃度，得到總還原糖濃度為92. :3mg/mL，總糖回收率為58. 2%。實施例3把榨汁後的甜高粱稈渣粉碎到60目，按固液比1 20g/mL加入到高溫液態水反應釜中，在4Mpa、180°C、400rpm的高溫液態水環境下處理20min，完成預處理，固液分離，獲得半纖維素水解產物和預處理後的甜高粱稈渣底物，用清水洗淨，除去酶水解及發酵抑制物，作為酶水解原料。取Ig做為酶水解原料，加入IOmL 0. 05M乙酸-乙酸鈉緩衝液 (pH4. 8)，以20FPU/g葡聚糖的比率加入纖維素酶，同時加入0. 075mL/g Tween80，在50°C下磁力攪拌水解M小時後，再加入0. 5g預處理料，以20FPU/g葡聚糖的比率加入纖維素酶， 同時加入0. 0375mL Tween80,磁力攪拌水解48h後，再加入0. 5g預處理的底物，以20FPU/ g葡聚糖的比率加入纖維素酶，同時加入0. 0375mL Tween80，水解至120h，用DNS法測定總還原糖濃度，得到總還原糖濃度為120. ang/mL，總糖回收率為89. 3%。對比例2把榨汁後的甜高粱稈渣粉碎到60目，按固液比1 20g/mL加入到高溫液態水反應釜中，在4Mpa、180°C、400rpm的高溫液態水環境下處理20min，完成預處理，固液分離，獲得半纖維素水解產物和預處理後的甜高粱稈渣底物，用清水洗淨，除去酶水解及發酵抑制物，作為酶水解原料。取2g做為酶水解原料，加入IOmL 0. 05M乙酸-乙酸鈉緩衝液 (pH4. 8)，以20FPU/g葡聚糖的比率加入纖維素酶，同時加入0. 15mL Tween80，在50°C下進行磁力攪拌水解120h，用DNS法測定總還原糖濃度，得到總還原糖濃度為105. 5mg/mL,總糖回收率為64. 9% ο由實施例1-3與對比例1可見，原料經高溫液態水預處理後採用分批加料攪拌及添加非離子表面活性劑水解，無論在糖產物濃度和糖回收率上，都高於只用纖維酶水解的工藝。由實施例3和對比例2可見，以同樣的甜高粱稈渣底物為原料，經過本發明的實施例3的處理工藝後，與一次性水解的對比例2的處理工藝後相比，其總還原糖濃度和總糖回收率得到了很大的提高，表明其水解效率也得到了很大的提高。從以上實施例中可以看出，木質纖維素類生物質在經過高溫液態水預處理後，採取添加TweenSO、攪拌方式以及分批水解工藝相結合的工藝進行水解，可提高酶解原料的濃度到30%，並可大幅提高總還原糖濃度和總糖回收率。
權利要求
1.一種木質纖維素類生物質高效酶水解的方法，其特徵在於，包括以下步驟在pH4. 5 4. 8，溫度為45 55°C的條件下，起初以質量體積分數為10% 15% g/ mL的比率，將木質纖維素類生物質經高溫液態水預處理後獲得的木質纖維素原料，添加至 0. 05 0. IM乙酸-乙酸鈉的緩衝溶液中，按10 20FPU/g纖維素的量加入纖維素酶，按 0. 075 0. 2mL/g木質纖維素原料的比率加入非離子表面活性劑，水解12 M小時後，再按起始加入量的一半加入木質纖維素原料，同時按10 20FPU/g纖維素的量加入纖維素酶，按0. 075 0. 2mL/g木質纖維素原料的比率加入非離子表面活性劑，水解36 48小時後，再加入木質纖維素原料，使三次加入的木質纖維素原料的總計質量體積分數為20% 30% g/ml,同時按10 20FPU/g纖維素的量加入纖維素酶，按0. 075 0. 2mL/g木質纖維素原料的比率加入非離子表面活性劑，繼續水解到108 120小時，整個水解過程以攪拌的方式混勻物料。
2.根據權利要求1所述的木質纖維素類生物質高效酶水解的方法，其特徵在於，所述的木質纖維素類生物質高效酶水解的方法，步驟為在PH4.8，溫度為50°C的條件下，起初以質量體積分數為10% g/mL的比率，將木質纖維素類生物質經高溫液態水預處理後獲得的木質纖維素原料，添加至0. 05M乙酸-乙酸鈉的緩衝溶液中，按20FPU/g纖維素的量加入纖維素酶，按0. 075mL/g木質纖維素原料的比率加入Tween 80，水解M小時後，再按起始加入量的一半加入木質纖維素原料，按20FPU/g纖維素的量加入纖維素酶，按0. 075mL/g木質纖維素原料的比率加入Tween 80，水解48小時後，再加入木質纖維素原料，使三次加入的木質纖維素原料的總計質量體積分數為20% g/ml，按20FPU/g纖維素的量加入纖維素酶， 按0. 075mL/g木質纖維素原料的比率加入Tween 80，繼續水解到120小時，整個水解過程以攪拌的方式混勻物料。
3.根據權利要求1或2所述的木質纖維素類生物質高效酶水解的方法，其特徵在於，所述的將木質纖維素類生物質經高溫液態水預處理後獲得的木質纖維素原料，步驟為將木質纖維素類生物質粉碎至40 60目，按物料幹基固液比為1 10 20g/mL的比率，加水到反應系統中，反應條件為2 4MPa，170 190°C，300 500rpm，15 30min，處理結束後，固液分離，將預處理殘渣用水洗淨，獲得木質纖維素原料。
4.根據權利要求1或2所述的木質纖維素類生物質高效酶水解的方法，其特徵在於，所述的木質纖維素類生物質選自甜高粱稈渣、甘蔗渣、玉米秸稈、玉米芯、稻草杆、木屑和速生能源林。
5.根據權利要求1所述的木質纖維素類生物質高效酶水解的方法，其特徵在於，所述的非離子表面活性劑為Tween 80。
6.根據權利要求1所述的木質纖維素類生物質高效酶水解的方法，其特徵在於，所述的攪拌方式包括磁力攪拌和機械攪拌。
全文摘要
本發明公開一種木質纖維素類生物質高效酶水解的方法。它以木質纖維素類生物質經高溫液態水預處理後獲得的木質纖維素原料為底物，一定濃度分散於乙酸-乙酸鈉緩衝液，再加入非離子表面活性劑和纖維素酶，攪拌物料水解一段時間後，再分二次加入一定量的物料，同時加入非離子表面活性劑和纖維素酶繼續水解，獲得糖類化合物和木質纖維素殘渣。本發明將高溫液態水預處理和分批加料、添加非離子表面活性劑攪拌酶水解工藝耦合，水解效率高，極大地提高了酶水解的木質纖維素原料濃度，濃度達30％。在高濃度的木質纖維素原料的情況下，產糖濃度、水解效率高，在提高酶解原料濃度的同時產出高濃度糖，提高了酶解效率，實現了木質纖維素類生物質的高效酶水解。
文檔編號C12P7/10GK102174594SQ201110063789
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月16日 優先權日2011年3月16日
發明者亓偉, 莊新姝, 徐惠娟, 王瓊, 王聞, 袁振宏, 許敬亮, 譚雪松, 馬隆龍 申請人:中國科學院廣州能源研究所