利用臍帶血治療患有疾病、紊亂或狀況的個體的用途的製作方法
2023-09-24 12:29:40
專利名稱:利用臍帶血治療患有疾病、紊亂或狀況的個體的用途的製作方法
1.導言本發明涉及沒有進行輸血前HLA分型的大劑量臍血組合物的用途。臍血具有許多用途和應用,包括但不限於,用於移植的治療用途、診斷和研究的用途。特別地,臍血可用於疾病或紊亂的治療,包括血管病、神經病學疾病或紊亂、自身免疫病或紊亂、和涉及炎症的疾病或紊亂。
2.發明背景對人幹細胞的鑑定、分離和產生存在著相當大的興趣。人幹細胞是全能性或多能性的前體細胞,能夠產生多種成熟的人細胞系。這種能力起著器官和組織發育所必需的細胞分化和特化基礎的作用。
在這種幹細胞移植中的最新成就已經為由於疾病而進行的骨髓去除、暴露於有毒的化學藥品和/或輻射後恢復和/或補充骨髓提供了新的臨床工具。存在進一步的證據表明可使用幹細胞來使許多、不一定是所有的組織重新建群,並且恢復生理性和解剖學功能。幹細胞在組織工程、基因治療遞送和細胞治療學中的應用也是突飛猛進的。
已經表徵了許多不同類型的哺乳動物幹細胞。例如,胚胎幹細胞、胚胎生殖細胞、成人幹細胞或其他分型的幹細胞或祖細胞是已知的。不只分離和表徵了某些幹細胞,也已經在容許分化至有限程度的條件下進行培養。然而仍然存在基本的問題,因為獲得能夠分化成為所有細胞類型的足夠數量和群體的人幹細胞近乎是不可能的。提供足夠數量和品質的匹配的幹細胞單元仍然是個挑戰,儘管這對於治療多種紊亂,包括惡性腫瘤、先天性代謝缺陷、血紅蛋白病和免疫缺陷是很重要的。
臍帶血(″臍血″)是造血祖代幹細胞的已知備選來源。通常冷藏來自臍血的幹細胞供造血重建,即用於骨髓和其他相關移植的廣泛使用的治療方法之用(參見例如,Boyse等人,US 5,004,681,″血液的胎兒和新生兒促紅細胞生成素幹和祖細胞的保存″,Boyse等人,美國專利號5,192,553,名稱為″血液的胎兒和新生兒造血幹和祖細胞的分離和保存和治療使用的方法″,1993年3月9日公開)。用於收集臍血的常規技術是以針或插管的使用為基礎的,其被用於藉助重力從胎盤排乾臍血(即,放血)(Boyse等人,美國專利號5,192,553,1993年3月9日公開;Boyse等人,美國專利號5,004,681,1991年4月2日公開;Anderson,美國專利號5,372,581,名稱為用於胎盤血收集的方法和裝置,1994年12月13日公開;Hessel等人,美國專利號5,415,665,名稱為臍帶卡鉗、截點、和血液收集的設備和方法,1995年5月16日公開)。通常將針或插管置於臍靜脈中,並且溫和地按揉胎盤以幫助從胎盤排乾臍血。然而此後,認為排乾的胎盤已經沒有進一步的用途而一般加以丟棄。此外從臍血獲得幹細胞的主要限制是經常不能獲得足夠體積的臍帶血,而導致細胞數目不足以在移植後有效地重建骨髓。
Naughton等人(美國專利號5,962,325,名稱為″三維基質的組織培養″,1999年10月5日公開)公開了可從臍帶或胎盤組織或臍帶血獲得胎兒細胞,包括成纖維細胞樣細胞和軟骨祖細胞。
用於離體擴增細胞群的現用方法也是勞動強度很大的。例如,Emerson等人(美國專利號6,326,198,名稱為″用於離體複製幹細胞、用於優化造血祖細胞培養、和用於增加人基質細胞的代謝、GM-CSF分泌和/或IL-6分泌的方法和組合物″,2001 12月4日公開);公開了用於離體培養人幹細胞分裂和/或優化人造血祖代幹細胞的方法和培養基條件。根據公開的方法,將來源於骨髓的人幹細胞或祖細胞在以每ml培養物每大約24至大約48小時期間1ml培養基的比率,連續地或周期性地替換,優選灌流的液體培養基中培養。除去代謝產物並且補足消耗的營養成分,而保持在生理學可接受的條件下進行培養。
Kraus等人(美國專利號6,338,942,名稱為″靶細胞群體的選擇性擴增″,2002年1月15日公開)公開了可通過將來自臍血或外周血的細胞起始樣品導入生長培養基,導致靶細胞群體的細胞分裂,並且使生長培養基中的細胞與包括具有針對預定的細胞群體(例如CD34細胞)的特異親合力(例如針對CD34的單克隆抗體)的結合分子的選擇元件接觸,以使得從生長培養基中的其它細胞選擇出預定的靶群體細胞,來選擇性地擴增預定的細胞靶群體。
Rodgers等人(美國專利號6,335,195,名稱為″用於促進造血和間質細胞增殖和分化的方法,″2002年1月1日公開)公開了用於離體培養造血和間質幹細胞,並且通過在存在單獨或與其它生長因子和細胞因子組合的血管緊張素原、血管緊張素I(AI)、AI類似物、AI片段及其類似物、血管緊張素II(AII)、AII類似物、AII片段及其類似物或AII AT22型受體拮抗劑時生長,來誘導譜系-特異的細胞增殖和分化的方法。幹細胞來源於骨髓、外周血或臍帶血。然而正如上文所論述的,這種方法的缺陷是用於誘導幹細胞增殖和分化的這種離體方法是耗時的,並且也導致了幹細胞的低產率。
Naughton等人(美國專利號6,022,743,名稱為″體外製備培養的活基質組織的胰腺實質細胞的三維培養,″2002年2月8日公開)公開了其中使幹細胞或祖細胞(例如基質細胞,例如來源於臍帶細胞、胎盤細胞、間質幹細胞或胎兒細胞的基質細胞)在例如培養容器,例如培養瓶或培養皿中的三維支持物而不是二維單層上增殖的組織培養系統。
由於對幹細胞收集和使用的限制,和一般從臍血收集的細胞的數目不足,幹細胞是極其短缺的。幹細胞具有用於治療多種紊亂,包括惡性腫瘤、先天性代謝缺陷、血紅蛋白病和免疫缺陷的潛能。存在對大量人幹細胞的易得到來源用於多種治療和其他醫學上相關目的的關鍵需要。本發明強調了這種需要和其它需要。
另外,預期本發明的組合物可用於治療神經病學狀況,例如肌萎縮性側索硬化(ALS)。利用家族性ALS,即一種較不普遍形式的ALS的經輻射小鼠模型的若干最近的研究已經暗示了臍血可用於治療這種疾病。參見Ende等人,Life Sci.6753059(2000)。
3.發明概述本發明提供治療個體的方法,包括將臍帶血或由此而來的細胞級分單獨或與來源於包括胎盤的其它來源的細胞組合施用於所述的個體。將高劑量的臍帶血提供給個體,即每個個體每次施用5-25×109個總的有核細胞。本發明的方法也具體說明了可從多個不同來源收集臍血,而不特異地需要在受體和供體之間匹配HLA型。
本發明涉及使用臍血組合物或由此而來的幹或祖細胞來治療疾病、紊亂或狀況的用途。這種疾病、紊亂或狀況可能是本質是自身免疫,或包括炎症症狀,並且可能影響機體的任何器官或組織,特別是神經系統或血管系統。
在一個實施方案中,本發明提供治療有需要的患者的方法,包括施用大量臍帶血細胞。在具體的實施方案中,所述的患者患有神經系統疾病、紊亂或狀況。在更具體的實施方案中,所述的疾病、紊亂或狀況影響中樞神經系統。在更具體的實施方案中,所述的疾病、紊亂或狀況是肌萎縮性側索硬化。在另一個更具體的實施方案中,所述的疾病、紊亂或狀況是多發性硬化。在另一個更具體的實施方案中,所述的疾病、紊亂或狀況影響周圍神經系統。在另一個更具體的實施方案中,所述的疾病、紊亂或狀況影響血管系統。在另一個更具體的實施方案中,所述的疾病、紊亂或狀況涉及炎症或由炎症所引起。在另一個更具體的實施方案中,所述的疾病、紊亂或狀況是自身免疫病、紊亂或狀況。
在另一個實施方案中,本發明提供治療脊髓發育不良的方法,其包括將臍帶血細胞(或由其分離的幹細胞)施用於需要其的患者。
3.1.定義如在此所使用的,術語″同種異基因細胞″是指″外源的″細胞,即異源的細胞(即,來源於除了胎盤供體之外的來源的″非自身″的細胞)或自體的細胞(即,來源於胎盤供體的″自身″細胞),其來源於除了胎盤外的器官或組織。
如在此所使用的,術語″祖細胞″是指定向分化為細胞的特定類型或形成特定組織類型的細胞。
如在此所使用的,術語″幹細胞″是指可不確定地分化以形成組織和器官的特化細胞的主要細胞。幹細胞是發育性地全能或多能細胞。幹細胞可分裂產生2個子代幹細胞,或1個子代幹細胞和1個祖代(″轉變的″)細胞,然後其增殖成為組織的成熟的、完全形成的細胞。
如在此所使用的,術語″臍血來源的幹細胞″包括臍血來源的祖細胞,除非另外具體地指出。
4.發明詳述本發明部分地基於發明人的出乎意料的發現,即可將高劑量的臍血施用於個體而不需要HLA分型。這是令人驚訝的,因為組織移植一般包括供體和受體組織類型的精細匹配以容許同種異基因細胞成功、耐久地移植入受體並且減少移植物抗宿主疾病(GvHD)的發生率。這極大地便於從多個供體收集臍血用於施用於單個個體。高劑量的施用容許提供足夠的臍血來源的幹細胞以提供所施用細胞長期植入的高可能性。根據本發明,高劑量的臍血具有許多用途和應用,包括但不限於,用於移植的治療用途和疾病的治療和預防、以及診斷和研究的用途。
本發明也提供用生長因子,例如細胞因子和/或白細胞介素處理臍血以誘導細胞分化的方法。
本發明提供包括單獨的臍血或與來自胎盤的細胞組合的臍血的藥物組合物。根據本發明,來自臍帶血的幹細胞群具有許多用途,包括治療和診斷的用途。幹細胞可用於移植或治療或預防疾病。在本發明的一個實施方案中,臍血或臍血來源的幹細胞用來更新和恢復組織和器官,由此替換或修復病變組織、器官或其部分。在另一個實施方案中,臍血或臍血來源的幹細胞可用來診斷篩選遺傳性紊亂或對於特定疾病或紊亂的易患病體質。
本發明也提供通過施用臍血或臍血來源的幹細胞治療有需要的患者的方法。
4.1.臍帶血的收集可以任何醫學上或藥物學上可接受的方式收集臍帶血。已經描述了用於收集臍血的多種方法。參見例如,Coe,美國專利號6,102,871;Haswell,美國專利號6,179,819B1.可將臍血收集進入例如,血袋、轉送袋、或無菌的塑料試管。臍血或由其來源的幹細胞可儲存為收集自單個個體(即,作為單個單位)而用於施用,或可與其它用於稍後施用的單位合併。
4.2.臍血來源的幹細胞根據本發明的方法獲得的臍血來源的幹細胞可包括多潛能的細胞,即具有自我更新的完全分化多能性,並且可在組織內保持靜止或休眠狀態的細胞。臍血主要包含CD34+和CD38+造血祖細胞,以及更未分化的或原始的幹細胞的較小群體。
可誘導通過本發明的方法獲得的臍血來源的幹細胞沿著特定的細胞系分化,包括造血的、血管生成的、神經原的、和生成肝組織的細胞系。在某些實施方案中,誘導臍血來源的幹細胞分化供移植和離體的治療方法之用。在某些實施方案中,誘導通過本發明的方法獲得的臍血來源的幹細胞分化成為特定的細胞類型並且進行遺傳工程化以提供治療性的基因產物。
收集後也可利用本領域公知的方法,例如通過在飼養細胞,例如經輻射的成纖維細胞上,或在獲得自飼養細胞培養物的條件培養基中培養,以便獲得連續的長期培養物來進一步培養臍血來源的幹細胞。也可在收集前或體外收集後擴增幹細胞。在某些實施方案中,使待擴增的幹細胞暴露於抑制細胞分化的試劑,或在存在該試劑時進行培養。這種試劑是本領域已知的,包括但不限於人Delta-1和人Serrate-1多肽(參見,Sakano等人,美國專利號6,337,387,名稱為″抑制分化的多肽″,2002年1月8日公開)、白血病抑制因子(LIF)和幹細胞因子。用於擴增細胞群的方法也是本領域已知的(參見例如,Emerson等人,美國專利號6,326,198,名稱為″用於離體複製幹細胞、用於優化造血祖細胞培養、和用於增加人基質細胞的代謝、GM-CSF分泌和/或IL-6分泌的方法和組合物″,2001年12月4日公開;Kraus等人,美國專利號6,338,942,名稱為″靶細胞群的選擇性擴增″,2002年1月16日公開)。
可利用本領域已知的標準技術評估臍血來源的幹細胞的存活力、增殖潛力、和壽命,例如臺盼藍排染測定、螢光素二乙酸酯攝取測定、碘化丙啶攝取測定(評估存活力);和胸腺嘧啶脫氧核苷攝取測定、MTT細胞增殖測定(評估增殖)。可通過本領域公知的方法測定壽命,例如通過測定擴充的培養中群體加倍的最大數目。
可誘導幹或祖細胞分化的試劑是本領域已知的,包括但不限於Ca2+、EGF、α-FGF、β-FGF、PDGF、角質細胞生長因子(KGF)、TGF-β、細胞因子(例如,IL-1α、IL-1β、IL-1γ、TFN)、視黃酸、轉鐵蛋白、激素(例如,雄激素、雌激素、胰島素、催乳激素、三碘甲腺原氨酸、氫化可的松、地塞米松)、丁酸鈉、TPA、DMSO、NMF、DMF、基質因子(例如,膠原、層粘連蛋白、硫酸乙醯肝素、MatrigelTM)、或其組合。在某些實施方案中,根據本領域公知的方法,通過暴露於生長因子而誘導臍血來源的幹或祖細胞分化成為特定的細胞類型。在具體的實施方案中,生長因子是GM-CSF、IL-4、Flt3L、CD40L、IFN-α、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、視黃酸、鹼性成纖維細胞生長因子、TGF-β-1、TGF-β-3、肝細胞生長因子、表皮生長因子、促心肌素-1、血管緊張素原、血管緊張素I(AI)、血管緊張素II(AII)、AII AT22型受體拮抗劑、或其類似物或片段。
抑制細胞分化的試劑也是本領域已知的,包括但不限於人Delta-1和人Serrate-1多肽(參見,Sakano等人,美國專利號6,337,387,名稱為″抑制分化的多肽″,2002年1月8日公開)、白血病抑制因子(LIF)和幹細胞因子。
確定幹細胞已經分化成為特定細胞類型,可伴隨有本領域眾所周知的方法,例如,利用例如流式細胞術或免疫細胞化學(例如,用組織特異的或細胞標記特異的抗體染色細胞)的技術測量形態學變化和細胞表面標記,利用光或共聚焦顯微鏡術檢驗細胞的形態學,或利用本領域公知的技術,例如PCR和基因-表達圖譜測量基因表達的變化。
在一個實施方案中,根據本領域公知的方法,例如根據第5.1.1.s節中公開的方法,通過暴露於β-巰基乙醇或DMSO/丁基化羥基苯甲醚誘導臍血來源的幹或祖細胞分化成為神經元。
在另一個實施方案中,根據本領域公知的方法,例如根據第5.1.2節中公開的方法,通過暴露於地塞米松、吲哚美辛、胰島素和IBMX誘導幹或祖細胞分化成為脂肪細胞。
在另一個實施方案中,根據本領域公知的方法,例如根據第5.1.3節中公開的方法,通過暴露於TGF-β-3誘導幹或祖細胞分化成為軟骨細胞。
在另一個實施方案中,根據本領域公知的方法,例如根據第5.1.4節中公開的方法通過暴露於地塞米松、抗壞血酸-2-磷酸酯和β-磷酸甘油誘導幹或祖細胞分化成為骨細胞。
在另一個實施方案中,根據本領域公知的方法,例如根據第5.1.5節中公開的方法,通過暴露於IL-6+/-IL-15誘導幹或祖細胞分化成為肝細胞。
在另一個實施方案中,根據本領域公知的方法,例如根據第5.1.6節中公開的方法,通過暴露於鹼性成纖維細胞生長因子,和轉化生長因子β-1誘導幹或祖細胞分化成為胰腺細胞。
在另一個實施方案中,根據本領域公知的方法,例如根據第5.1.7節公開的方法,通過暴露於視黃酸、鹼性成纖維細胞生長因子、TGF-β-1和表皮生長因子、通過暴露於促心肌素-1或通過暴露於人心肌提取物誘導幹或祖細胞分化成為心臟細胞。
在另一個實施方案中,例如,通過施用促紅細胞生成素、細胞因子、淋巴激活素、幹擾素、集落刺激因子(CSF′s)、幹擾素、趨化因子、白細胞介素、重組的人造血生長因子,包括配體、幹細胞因子、血小板生成素(Tpo)、白細胞介素,以及粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或其他生長因子來刺激幹細胞增殖。
可將包含轉基因的載體通過本領域公知的方法導入令人感興趣的幹細胞,例如,轉染、轉化、轉導、電穿孔、感染、微注射、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉澱、脂質體、LIEPOFECTETM、溶酶體融合、合成的陽離子脂類、利用基因槍或DNA載體運送蛋白,以使轉基因轉送到子代細胞。對於轉化或轉染哺乳動物細胞的多種技術,參見Keown等人,1990,Methods Enzymol.185527-37;Sambrook等人,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第三版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,N.Y.。
優選地,利用任何技術導入轉基因,只要不是對細胞的核膜或其他存在的細胞或遺傳結構有害的。在某些實施方案中,通過微注射將轉基因插入核遺傳物質中。細胞和細胞結構的微注射通常是本領域已知和可實施的。
對於培養的哺乳動物細胞的穩定轉染,只有小部分細胞可將外源DNA整合到其基因組中。整合的效率取決於所使用的載體和轉染技術。為了鑑定和選擇整合體,一般將編碼可選擇標記(例如,對於抗生素的抗藥性)的基因與目的基因序列一起導入幹細胞。優選的可選擇標記包括賦予抗藥性的標記,例如G418、潮黴素和氨甲蝶呤。可通過藥物選擇(例如,已經整合可選擇的標記基因的細胞將存活,而其他的細胞將死亡)鑑定用導入的核酸穩定轉染的細胞。這些方法對涉及在導入或移植重組細胞進入受試個體或患者前,在哺乳動物細胞中同源重組的方法是特別有用的。
許多選擇系統可用來選擇轉化的臍血來源的幹細胞。特別地,載體可包含某些可檢測的或可選擇的標記。選擇的其它方法包括但不限於選擇另一個標記,例如單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人,1977,Cell 11223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤轉磷酸核糖基轉移酶(Szybalska和Szybalski,1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026)、和腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Lowy等人,1980,Cell 22817)基因可分別用於tk-、hgprt-或aprt-細胞。也可使用抗代謝物抗性作為選擇下列基因的基礎dhfr,其賦予對氨甲蝶呤的抗性(Wigler等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773567;O′Hare等人,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527);gpt,其賦予對黴酚酸的抗性(Mulligan和Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072);neo,其賦予對氨基糖苷類G-418的抗性(Colberre-Garapin等人,1981,J.Mol.Biol.1501);和hygro,其賦予對潮黴素的抗性(Santerre等人,1984,基因Gene 30147).
轉基因可整合進入令人感興趣的細胞的基因組,優選為隨機整合。在其他的實施方案中,轉基因可通過直接的方法,例如通過直接的同源重組整合(即,在令人感興趣的細胞基因組中″敲入″或″敲除″令人感興趣的基因),Chappel,美國專利號5,272,071;和1991年5月16日公開的PCT公開號WO 91/06667;Capecchi等人,1995年11月7日公開的美國專利5,464,764;Capecehi等人,1997年5月6日公開的美國專利5,627,059;Capecchi等人,1996年1月30日發表的美國專利5,487,992)。
用於通過同源重組產生具有靶基因修飾的細胞的方法是本領域已知的。構建體可包括令人感興趣的、具有所需要的遺傳修飾的基因的至少一部分,並且可包括與靶基因座同源的區域,即宿主基因組中靶基因的內源性拷貝。用於隨機整合的DNA構建體,與用於同源重組的構建體相比,不必包括同源區域以介導重組。可將標記包括入用於進行陽性和陰性選擇轉基因插入的靶構建體或隨機構建體中。
為了產生同源重組細胞,例如同源重組的臍血來源的幹細胞,製備同源重組載體,其中令人感興趣的基因在與靶細胞基因組內源的基因序列的5′和3′末端的側翼,以容許同源重組發生在由載體攜帶的令人感興趣的基因和靶細胞基因組中的內源基因之間。附加的側翼核酸序列具有足夠的長度以用於與靶細胞基因組中的內源基因成功地同源重組。一般地,側翼DNA的幾千個鹼基(在5′和3′末端)包括在載體中。用於構建同源重組載體的方法和來自重組幹細胞的同源重組動物通常是本領域已知的(參見例如,Thomas和Capecchi,1987,Cell 51503;Bradley,1991,Curr.Opin.Bio/Technol.2823-29;和PCT公開號WO90/11354、WO 91/01140、和WO 93/04169。
在具體的實施方案中,使用Bonadio等人的方法(1999年8月24日公開,題目為用於將多種基因轉入骨細胞的方法和組合物的美國專利號5,942,496;和1995年8月24日公開,題目為用於刺激骨細胞的方法和組合物的PCT W095/22611)將核酸導入令人感興趣的細胞,例如胎盤中培養的幹細胞、祖細胞或外源細胞,例如骨祖細胞。
可使用臍血來源的幹細胞,在具體的實施方案中,在自體的或異體的酶代替治療中治療的具體疾病或狀況,包括但不限於,溶酶體貯存疾病,例如Tay-Sachs、Niemann-Pick、Fabry′s、Gaucher′s、Hunter′s和Hurler′s症候群,以及其他神經節苷脂貯積症、粘多糖貯積症和糖原貯積症。
在其他的實施方案中,該細胞可用作基因治療中自體的或異體的轉基因載體,來矯正先天性代謝缺陷、腎上腺腦白質營養不良、囊性纖維化、糖原貯積病、甲狀腺機能減退症、鐮刀形紅細胞貧血病、Pearson症候群、Pompe′s病、苯丙酮尿症(PKU)、卟啉症、槭糖尿病、高胱氨酸尿症、粘多糖沉積症、慢性肉芽腫病和酪氨酸血症和泰-薩二氏病或治療癌症、腫瘤或其他病理學狀況。
在其他的實施方案中,該細胞可用於自體的或異體的組織再生或替代治療或方法,包括但不限於治療角膜上皮細胞缺陷、軟骨修復、面部皮膚擦除、黏膜、鼓膜、腸被膜、神經學結構(例如,視網膜、基底膜中的聽覺神經元、嗅上皮中的嗅覺神經元)、用於皮膚創傷性損傷的燒傷和創傷修復,或用於其他受損或病變器官或組織的重建。
用於本發明方法的大量臍血來源的幹細胞和/或祖細胞可在某些實施方案中減少對大量骨髓捐贈的需要。每千克患者的重量必須注入大約1×108至2×108個骨髓單核細胞,用於骨髓移植中的移入(即,對於70kg的供體大約70ml的骨髓)。為了獲得70ml,在捐贈過程中需要大量的捐贈和顯著的失血。在具體的實施方案中,來自小的骨髓捐贈物(例如,7-10ml)的細胞可在輸注進入受體前通過在胎盤生物反應器中增殖而擴大。
此外,少量幹細胞和祖細胞在血流中正常循環。在另一個實施方案中,通過血液提取法收集這種外源幹細胞或外源祖細胞,在該方法中取出血液,有選擇地除去一種或多種成分,而將血液的其餘部分再注入供體。
在另一個實施方案中,施用高劑量的臍血或臍血來源的幹細胞用作除化療外的輔助治療。大多數用於導向和破壞癌細胞的化療試劑通過殺死所有的增殖細胞,即經歷細胞分裂的細胞而起作用。因為骨髓是機體內最活躍增殖的一種組織,造血幹細胞經常由於化療試劑而受到損傷或破壞並因此減少或降低血細胞的產生。必須以一定間隔終止化療以容許患者的造血系統在重新開始化療前補足血細胞供給。這可能需要1個月或更多時間,使原先休眠的幹細胞增殖,並使白細胞計數增加到可接受的水平,以便化療可重新開始(當再次進行,骨髓幹細胞被破壞)。
血細胞在化療治療之間再生,然而,癌症也有時間生長並且可能由於自然選擇對化療藥物變得更有抗性。因此,化療進行越久以及治療之間持續時間越短,成功殺滅癌症的機率越大。為了縮短化療治療之間的時間,可將臍血或臍血來源的幹細胞導入患者。這種治療可減少患者顯示低血細胞計數的時間,並且因此容許化學治療的較早再開始。
4.3.臍血和臍血來源的幹細胞的用途臍血和臍血來源的幹細胞可用於多種治療性方法,其中機體的組織或器官通過移入、移植或輸注所需要的細胞群,例如幹細胞或祖細胞群而增大、修復或替代。
在本發明優選的實施方案中,臍血或臍血來源的幹細胞可使用作自體的和異體的,包括匹配和錯配的HLA型造血移植物。然而根據利用臍血或臍血來源的幹細胞作為異源造血的移植物,可處理宿主以減少供體細胞的免疫排斥,例如如1998年9月1日公開的美國專利號5,800,539;和1998年9月15日公開的美國專利號5,806,529所描述的,其在此引入作為參考。
臍血或臍血來源的幹細胞可用於修復由疾病導致的組織和器官的損傷。在這種實施方案中,可對患者施用臍血或臍血來源的幹細胞來使已經由於疾病而損傷的組織或器官再生或恢復,例如,在化療或放療後增強免疫系統,在心肌梗塞後修復心臟組織。
臍血或臍血來源的幹細胞可用於在骨髓移植中增加或替代骨髓細胞。目前將人自體和異體的骨髓移植用於治療疾病,例如白血病、淋巴瘤和其他危脅生命的紊亂。然而這些方法的缺陷是必須移出大量的供體骨髓以保證有足夠的細胞用於移入。
臍血或臍血來源的幹細胞可提供減少對大量骨髓捐贈的需要的幹細胞和祖細胞。根據本發明的方法也獲得小的骨髓捐贈物,然後在輸注或移植進入受體前,在胎盤中培養和擴增增加幹細胞和祖細胞的數目。
可使用臍血或臍血來源的幹細胞,在具體的實施方案中,在自體的或異體的酶代替治療中治療的具體疾病或狀況,包括但不限於,溶酶體貯存疾病,例如Tay-Sachs、Niemann-Pick、Fabry′s、Gaucher′s、Hunter′s和Hurler′s症候群,以及其他神經節苷脂貯積症、粘多糖貯積症和糖原貯積症。
在其他的實施方案中,可使用細胞作為基因治療中自體的或異體的轉基因載體,來矯正先天性代謝缺陷,例如腎上腺腦白質營養不良、囊性纖維化、糖原貯積病、甲狀腺機能減退症、鐮刀形紅細胞貧血病、Pearson症候群、Pompe′s病、苯丙酮尿症(PKU)、和泰-薩二氏病、卟啉症、械糖尿病、高胱氨酸尿症、粘多糖沉積症、慢性肉芽腫病和酪氨酸血症,或治療癌症、腫瘤或其他病理學或腫瘤狀況。
在其他的實施方案中,該細胞可用於自體的或異體的組織再生或置換治療或方法,包括但不限於治療角膜上皮細胞缺陷、軟骨、面部皮膚擦除、黏膜、鼓膜、腸被膜、神經學結構(例如,視網膜、基底膜中的聽覺神經元、嗅上皮中的嗅覺神經元)、用於皮膚創傷性損傷的燒傷和創傷修復,頭皮(毛髮)移植,或用於其他受損或病變器官或組織的重建。
大量的臍血或大量的臍血或臍血來源的幹細胞可在某些實施方案中減少對大量的骨髓捐贈的需要。每千克患者的重量必須注入大約1×108至2×108個骨髓單核細胞,用於骨髓移植中的移入(即,對於70kg的供體大約70ml的骨髓)。為了獲得70ml,在捐贈過程中需要大量的捐贈和顯著的失血。在具體的實施方案中,來自小的骨髓捐贈物(例如,7-10ml)的細胞可在輸注進入受體前通過在胎盤生物反應器中增殖而擴大。
在另一個實施方案中,臍血或臍血來源的幹細胞可被用於除化療外的輔助治療。大多數用於導向和破壞癌細胞的化療試劑通過殺死所有的增殖細胞,即經歷細胞分裂的細胞而起作用。因為骨髓是體內最活躍增殖的一種組織,造血幹細胞經常由於化療試劑而受到損傷或破壞並因此減少或降低血細胞的產生。必須以一定間隔終止化療以容許患者的造血系統在重新開始化療前補足血細胞供給。這可能需要1個月或更多時間,使原先休眠的幹細胞增殖,並使白細胞計數增加到可接受的水平,以便化療可重新開始(當再次進行,骨髓幹細胞被破壞)。
血細胞在化療治療之間再生,然而,癌症也有時間生長並且可能由於自然選擇對化療藥物變得更有抗性。因此,化療進行越久以及治療之間持續時間越短,成功殺滅癌症的機率越大。為了縮短化療治療之間的時間,可將臍血或臍血來源的幹細胞導入患者。這種治療可減少患者顯示低血細胞計數的時間,並且因此容許化學治療的較早再開始。
在另一個實施方案中,人胎盤幹細胞可用於治療或防止例如慢性肉芽腫病的遺傳性疾病。
4.4.藥物組合物本發明包括藥物組合物,其包括當單次或多次施用時的劑量和/或有效劑量,在移植調節的或未調節的人祖代幹細胞前或之後,發揮作用足夠抑制、調製和/或調節人全能和多能的胎盤起源的祖代幹細胞分化成為中胚層和/或造血系細胞。
在一個實施方案中,本發明提供具有高濃度(或更大群體)的同質造血幹細胞的藥物組合物,包括但不限於CD34+/CD38-細胞;和CD34-/CD38-細胞。可將一種或多種的這些細胞群體與其它的幹細胞或與其它的幹細胞作為混合物進行使用,供移植和其他用途之用。
在具體的實施方案中,使臍血或臍血來源的幹細胞包含在袋子中。在另一個實施方案中,本發明提供在冷凍前″調節的(conditioned)″臍血或臍血來源的幹細胞。
在另一個實施方案中,可根據標準方法通過除去紅細胞和/或粒細胞調節臍血或臍血來源的幹細胞,因此保持有核細胞的群體用於富集幹細胞。可不解凍而使用這種幹細胞的富集群體,或冷凍後稍晚再使用。如果將要冷凍細胞群體,在冷凍前向富集的細胞群加入標準的冷凍保護劑(例如,DMSO、甘油、EpilifeTM細胞冷凍培養基(CascadeBiologics))。
在另一個實施方案中,可在已經冷凍和解凍後通過除去紅細胞和/或粒細胞調節臍血或臍血來源的幹細胞。
根據本發明,誘導細胞分化的試劑可用來調節臍血或臍血來源的幹細胞。在某些實施方案中,可向容器內的細胞群加入誘導分化的試劑,包括但不限於Ca2+、EGF、α-FGF、β-FGF、PDGF、角質細胞生長因子(KGF)、TGF-β、細胞因子(例如,IL-1α、IL-1β、IFN-γ、TFN)、視黃酸、轉鐵蛋白、激素(例如,雄激素、雌激素、胰島素、催乳激素、三碘甲腺原氨酸、氫化可的松、地塞米松)、丁酸鈉、TPA、DMSO、NMF、DMF、基質因子(例如,膠原、層粘連蛋白、硫酸乙醯肝素、MatrigelTM)、或其組合。
在另一個實施方案中,可向臍血或臍血來源的幹細胞加入抑制細胞分化的試劑。在某些實施方案中,可向容器內的細胞群加入抑制分化的試劑,包括但不限於人Delta-1和人Serrate-1多肽(參見,Sakano等人,美國專利號6,337,387,名稱為″抑制分化的多肽″,2002年1月8日公開)、白血病抑制因子(LIF)、幹細胞因子、或其組合。
在某些實施方案中,將臍血、或一種或多種臍血來源的幹細胞群遞送給有需要的患者。在某些實施方案中,從單個容器或單個遞送系統遞送兩種或多種新鮮(從未冷凍)的細胞群。
在另一個實施方案中,從單個容器或單個遞送系統遞送兩種或多種冷凍和解凍的細胞群。
在另一個實施方案中,將兩種或多種新鮮(從未冷凍)的細胞群中的每一種轉移至單個容器或單個遞送系統或由其遞送。在另一個實施方案中,轉移和遞送將兩種或多種冷凍和解凍的細胞群中的每一種轉移至單個容器或單個遞送系統或由其遞送。在這些實施方案的另一個方面,從不同的IV輸液袋(例如,來自Baxter,Becton-Dickinson,Medcep,National Hospital Products或Terumo)遞送每個群體。可通過分開的遞送系統遞送各個容器(例如,IV輸液袋)的內容物,或各個容器可以是″自動分段控制″,因此其內容物可在從單個遞送系統遞送前組合或混合。例如,可將兩種或多種細胞群加入普通的流水線(例如,管道)和/或在其內混合,或可將它們注入普通的容器(例如,隔室或袋子)和/或在其內混合。
根據本發明,可在施用前、在施用或遞送期間或在施用或遞送同時組合細胞的兩種或多種群體。
在一個實施方案中,將最少1.7×107個有核細胞/kg遞送給需要其的患者。優選地,將至少2.5×107個有核細胞/kg遞送給需要其的患者。
4.5.治療的方法在一個實施方案中,本發明提供治療或防止受試個體中疾病或紊亂的方法,包括施用於受試個體治療有效量的本發明的幹細胞,該受試個體中需要這種治療或預防。
在另一個實施方案中,本發明提供治療或防止受試個體中疾病或紊亂的方法,包括施用於受試個體治療治療有效量的臍血或臍血來源的幹細胞,該受試個體中這種治療或預防需要。
當被施用於經受炎症的個體時,預期臍血或臍血來源的幹細胞具有抗炎效果。在優選的實施方案中,臍血或臍血來源的幹細胞可用來治療由炎症產生或與炎症相關的任何疾病、狀況或紊亂。炎症可存在於任何器官或組織中,例如肌肉;神經系統,包括腦、脊髓和周圍神經系統;血管組織,包括心臟組織;胰腺;腸或其它消化道器官;肺;腎臟;肝;生殖器官;內皮組織、或內胚層組織。
臍血或臍血來源的幹細胞也可用來治療免疫相關的紊亂,特別是自身免疫紊亂,包括與炎症相關的紊亂。因此,在某些實施方案中,本發明提供治療患有自身免疫病或狀況的個體的方法,包括對這種個體施用治療有效量的臍血或臍血來源的幹細胞,其中所述的疾病或紊亂可以是但不限於糖尿病、肌萎縮性側索硬化、重症肌無力、糖尿病性神經病或狼瘡。臍血或臍血來源的幹細胞也可用來治療急性或慢性過敏,例如季節性過敏、食物過敏、對自身抗原的過敏等。
在某些實施方案中,疾病或紊亂包括但不限於在此公開的任何疾病或紊亂,包括但不限於再生障礙性貧血、脊髓發育不良、心肌梗塞、癲癇病症、多發性硬化、中風、低血壓、心跳驟停、局部缺血、炎症、年齡相關的認知功能喪失、輻射損傷、大腦性麻痺、神經變性疾病、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、Leigh病、AIDS痴呆、記憶喪失、肌萎縮性側索硬化(ALS)、缺血性腎病、腦或脊髓創傷、心肺旁路、青光眼、視網膜局部缺血、視網膜創傷、溶酶體儲存疾病、例如Tay-Sachs、Niemann-Pick、Fabry′s、Gaucher′s、Hunter′s、和Hurler′s症候群,以及其它的神經節苷脂貯積症、粘多糖貯積症、糖原貯積病、先天性代謝缺陷、腎上腺腦白質、囊性纖維化、糖原貯積病、甲狀腺機能減退症、鐮刀形紅細胞貧血病、Pearson症候群、Pompe′s病、苯丙酮尿症(PKU)、卟啉症、槭糖尿病、高胱氨酸尿症、粘多糖沉積症、慢性肉芽腫病和酪氨酸血症、泰-薩二氏病、癌症、腫瘤或其他病理學或腫瘤狀況。
在其他的實施方案中,細胞可用於治療由於創傷,特別是涉及炎症的創傷造成的任何種類的損傷。這種創傷相關狀況的實例包括中樞神經系統(CNS)損傷,包括腦、脊髓、或CNS損傷周圍組織至周圍神經系統(PNS)的損傷;或機體的任何其它部分的損傷。這種創傷可能是由事故造成的,或可能是例如外科手術或血管成形術的醫學方法的正常或異常結果。創傷也可能是血管的破裂、衰退或堵塞的結果,例如中風或靜脈炎。在具體的實施方案中,該細胞可用於自體的或異體的組織再生或替代治療或方法,包括但不限於治療角膜上皮細胞缺損、軟骨修復、面部皮膚擦除、黏膜、鼓膜、腸被膜、神經學結構(例如,視網膜、基底膜中的聽覺神經元、嗅上皮中的嗅覺神經元)、用於皮膚創傷性損傷的燒傷和創傷修復,或用於其他受損害或病變器官或組織的重建。
在具體的實施方案中,疾病或紊亂是再生障礙性貧血、脊髓發育不良、白血病、骨髓失調或造血器官疾病或紊亂。在另一個具體的實施方案中,受試個體是人。
在另一個實施方案中,本發明提供治療患有與炎症相關或由炎症產生的疾病、紊亂或狀況的個體的方法。在具體的實施方案中,所述的疾病、紊亂或狀況是神經系統疾病、紊亂或狀況。在更具體的實施方案中,所述的神經系統疾病是肌萎縮性側索硬化(ALS)。在另一個更具體的實施方案中,所述的神經系統疾病是帕金森氏病。在另一個具體的實施方案中,所述的疾病是血管或心血管疾病。在更具體的實施方案中,所述的疾病是動脈粥樣硬化。在另一個具體的實施方案中,所述的疾病是糖尿病。
臍血或臍血來源的幹細胞的特別有用的方面是不必在施用前對細胞進行HLA-分型。換言之,臍血或臍血來源的幹細胞可取自異源的供體,或多個異源供體,並移植到需要這種細胞的個體,並且移植的細胞無限地保持在宿主內。這消除了對HLA分型的需要,極大地方便了移植方法本身和鑑定用於移植的供體。然而臍血或臍血來源的幹細胞可能在施用前是HLA分型的。
本發明人已經發現如果預調節這些細胞,則用臍血或臍血來源的幹細胞治療個體的效果得到增強。預調節包括使細胞在大約-5至23℃、0至10℃、或優選4-5℃下儲存在透氣的容器中一段時期。該時段可在18小時和21天之間,在48小時和10天之間,以及優選在3-5天之間。在預處理前細胞可以是冷藏的,或優選在施用前立即預處理。
因此,在一個實施方案中,本發明提供治療個體的方法,包括將從至少一個供體收集的臍血或臍血來源的幹細胞施用於所述的個體。在此″供體″是指成人、兒童、嬰兒或優選胎盤。在另一個優選的實施方案中,本方法包括將從多個供體收集並合併的臍血或臍血來源的幹細胞施用於所述的個體。備選地,臍血或臍血來源的幹細胞可分別取自多個供體,並且分開,例如順序地施用。在具體的實施方案中,臍血或臍血來源的幹細胞取自多個供體並且在不同的日期施用收集的量(單位)。
本發明特別有用的方面是將高劑量的幹細胞施用於個體;這種數目的細胞比其來源的材料(例如,骨髓或臍血)是更顯著有效的。在這裡,″高劑量″表示是例如將在骨髓移植中所施用的5、10、15或20倍數目的總的有核細胞,包括幹細胞,特別是臍血來源的幹細胞。一般地,接受幹細胞輸入的患者,例如對於骨髓移植,接受1個單位的細胞,其中1個單位是大約1×109個有核細胞(相當於1-2×108個幹細胞)。因此對於高劑量治療,可對患者施用至少30億、50億、100億、150億、200億、300億、400億、500億或更多總的有核細胞,或備選地至少3單位、5單位、10單位、20單位、30單位、40單位、50單位或更多。因此,在一個實施方案中,施用於個體的臍血的量或臍血來源的幹細胞的數目相當於通常在骨髓替代中所施用的至少5倍數目的有核細胞。在本方法的另一個具體的實施方案中,施用於個體的臍血的量或臍血來源的幹細胞的數目相當於通常在骨髓替代中所施用的至少10倍數目的有核細胞。在本方法的另一個具體的實施方案中,施用於個體的臍血的量或臍血來源的幹細胞的數目相當於通常在骨髓替代中所施用的至少15倍數目的有核細胞。在本方法的另一個實施方案中,施用於個體的包括幹細胞的有核細胞的總數在每公斤體重1-100×108之間。在另一個實施方案中,所施用的總的有核細胞的數目是至少50億個細胞。在另一個實施方案中,所施用的總的有核細胞的數目是至少150億個細胞。
在另一個實施方案中,所述的臍血或臍血來源的幹細胞可施用不止一次。在另一個實施方案中,通過在施用前儲存18小時至21天而預調節所述的臍血或臍血來源的幹細胞。在更具體的實施方案中,在施用前預調節細胞48小時至10天。在優選的具體實施方案中,在移植前預調節所述的細胞3-5天。在此處任何方法的優選實施方案中,所述的臍血或臍血來源的幹細胞在施用於個體前不是HLA分型的。
如果疾病、紊亂或狀況以任何方式得到可測定的改善,則可認為用臍血或臍血來源的幹細胞治療個體是有效的。可通過許多指標顯示這種改善。可測量的指標包括,例如與特定的疾病、紊亂或狀況相關的生理狀況或生理狀況系列的可檢測變化(包括但不限於,血壓、心率、呼吸率、多種血細胞類型的計數、血液中某些蛋白質的水平、碳水化合物、脂類或細胞因子或與疾病、紊亂或狀況相關的遺傳標記的調節表達)。如果通過變化至正常值內或接近於正常值的值,這些指標的任何一種對這種治療起反應,可認為用本發明的幹細胞或補充的細胞群治療個體是有效的。可通過本領域已知的多種指標的正常範圍,或與對照中的這種值相比來建立標準值。在醫學中,也經常根據個體的印象和個體健康狀態的主觀感覺表徵治療效果。因此也可通過主觀的指標表徵改善,例如在施用本發明的幹細胞或補充的細胞群後,改善個體的主觀感覺、增加舒適感、增加健康狀態、提高能量水平等。
可將臍血或臍血來源的幹細胞以任何藥物學上或醫學上可接受的方式,包括通過注射或輸液而施用於患者。細胞或補充的細胞群可包含或被包含於任何藥物學上可接受的載體。可在任何藥物學上或醫學上可接受的容器,例如血袋、轉送袋、塑料管或小瓶中攜帶、儲存、或運輸臍血或臍血來源的幹細胞。
4.6.試劑盒本發明也提供包括裝有一種或多種本發明的藥物組合物成分的一種或多種容器的藥包或試劑盒。任選與這種容器相關的可以是用於細胞培養的裝置、裝有細胞培養基或一種或多種細胞培養基成分的一種或多種容器、供遞送本發明組合物之用的裝置,例如用於靜脈注射本發明組合物的裝置、和/或以管理藥物或生物製品的製造、使用或銷售的政府機關規定形式的說明,該說明反映了用於人類施用的製造、使用或銷售的政府機關的許可。
提供下列實驗性的實施例是為了例證說明而不是為了加以限制。
5.實施例5.1實施例1誘導分化成為特定的細胞類型通過暴露於生長因子誘導臍血細胞和/或分化成為特定的細胞類型。用於誘導的生長因子包括但不限於GM-CSF、IL-4、Flt3L、CD40L、IFN-α、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、視黃酸、鹼性成纖維細胞生長因子、TGF-β-1、TGF-β-3、肝細胞生長因子、表皮生長因子、促心肌素-1、血管緊張素原、血管緊張素I(AI)、血管緊張素II(AII)、AIIAT22型受體拮抗劑、或其類似物或片段。
5.1.1誘導分化成為神經元這個實施例描述了誘導臍血細胞分化成為神經元。使用下列方法誘導神經元的分化1.使幹細胞在由DMEM/20%FBS和1mM β-巰基乙醇組成的預誘導培養基中生長24hr。
2.除去預誘導的培養基並且用PBS洗滌細胞。
3.加入由DMEM和1-10mM β-巰基乙醇組成的神經元誘導培養基。備選地,由DMEM/2%DMSO/200μM丁基化羥基苯甲醚組成的誘導培養基可用來增強神經元分化的效力。
4.在某些實施方案中,可能早在暴露於無血清的培養基和β-巰基乙醇後60分鐘發生形態學和分子的變化(Woodbury等人,J.Neurosci.Res.,61364-370)。RT/PCR可用來評估例如神經生長因子受體和神經絲重鏈基因的表達。
5.1.2誘導分化成為脂肪細胞這個實施例描述了誘導臍血細胞分化成為脂肪細胞。使用下列方法誘導產生脂肪的分化
1.使幹細胞生長在MSCGM(Bio Whittaker)或補充有15%臍血血清的DMEM中。
2.使用3個循環的誘導/維持。每個循環由用脂肪形成誘導培養基(Bio Whittaker)飼養的胎盤幹細胞組成,並且培養該細胞3天(在37℃,5%CO2),然後在脂肪形成維持培養基中(Bio Whittaker)培養1-3天組成。所使用的誘導培養基包含1μM地塞米松、0.2mM吲哚美辛、0.01mg/ml胰島素、0.5mM IBMX、DMEM-高葡萄糖、FBS、和抗生素。
3.3個誘導/維持的完全循環後,使細胞另外在脂肪形成維持培養基中培養7天,每隔2-3天替換培養基。
4.可通過利用親脂性的染色油紅O容易觀察到的多個胞質內脂類泡的產生來評估脂肪形成。使用RT/PCR測定來檢驗脂肪酶和脂肪酸結合蛋白基因的表達。
5.1.3誘導分化成為軟骨細胞這個實施例描述了誘導臍血細胞分化成為軟骨細胞。使用下列方法誘導軟骨形成分化1.使幹細胞維持在MSCGM(Bio Whittaker)或補充有15%臍血血清的DMEM中。
2.等分胎盤幹細胞到無菌的聚丙烯試管中。離心細胞(150×g,5分鐘),並且在不完全的軟骨形成培養基(Bio Whittaker)中洗滌兩次。
3.最後的洗滌後,將細胞以5×10(5)個細胞/ml的濃度重懸在包含0.01μg/ml TGF-β-3的完全軟骨形成培養基(Bio Whittaker)中。
4.等分0.5ml的細胞到15ml的聚丙烯培養試管中。在150×g沉澱細胞5分鐘。將沉澱完整地留在培養基中。
5.將松蓋的試管在37℃,5%CO2培養24小時。
6.每隔2-3天用新鮮製備的完全軟骨形成培養基培養細胞沉澱顆粒。
7.利用低速渦旋通過每日攪動將沉澱顆粒保持懸浮在培養基中。
8.培養14-28天後收穫軟骨形成細胞的沉澱顆粒。
9.軟骨形成可通過例如,觀察嗜酸性基質的產生,評估細胞形態,和/或使用RT/PCR檢驗膠原2和膠原9的基因表達而鑑定。
5.1.4誘導分化成為骨細胞這個實施例描述了誘導臍血細胞分化成為骨細胞。使用下列方法誘導成骨的分化1.將臍血來源的幹細胞的附著培養物在MSCGM(BioWhittaker)或補充有15%臍血血清的DMEM中培養。
2.在組織培養瓶中靜置培養物24小時。
3.通過用包含0.1μM地塞米松、0.05mM抗壞血酸-2-磷酸酯、10mMβ磷酸甘油的成骨誘導培養基(Bio Whittaker)替代MSCGM誘導成骨的分化。
4.每隔3-4天用成骨誘導培養基飼養細胞2-3周。
5.利用鈣-特異的染色和用於鹼性磷酸酶和骨橋蛋白基因表達的RT/PCR分析分化。
5.1.5誘導分化成為肝細胞這個實施例描述了誘導臍血細胞分化成為肝細胞。使用下列方法誘導生成肝組織的分化1.在補充有肝細胞生長因子,20ng/ml;和表皮生長因子,100ng/ml的DMEM/20%CBS中培養臍血來源的幹細胞。可在FBS的替代中使用分液血清置換。
2.向誘導燒瓶加入IL-650ng/ml。
5.1.6誘導分化成為胰腺細胞這個實施例描述了誘導臍血細胞分化成為胰腺的細胞。使用下列方法誘導胰腺的分化1.在補充有鹼性成纖維細胞生長因子,10ng/ml;和轉化生長因子β-1,2ng/ml的DMEM/20%CBS培養臍血來源的幹細胞。可在CBS的替代中使用分液血清置換。
2.向培養基加入來自nestin-陽性的神經元細胞培養物的條件培養基到濃度為50/50。
3.培養細胞14-28天,每3-4天重新飼養。
4.通過分析胰島素蛋白質或通過RT/PCR分析胰島素基因的表達而鑑定分化。
5.1.7誘導分化成為心臟細胞這個實施例描述了誘導臍血細胞分化成為心臟細胞。使用下列方法誘導生肌性的分化1.在補充有視黃酸,1μM;鹼性成纖維細胞生長因子,10ng/ml;和轉化生長因於β-1,2ng/ml;以及表皮生長因子,100ng/ml的DMEM/20%CBS中培養臍血來源的幹細胞。可在CBS的替代中使用分液血清置換。
2.備選地,幹細胞在補充有50ng/ml促心肌素-1的DMEM/20%CBS中培養24小時。
3.備選地,幹細胞在無蛋白質的培養基中維持5-7天,然後用人心肌提取物刺激(逐步增加的劑量分析)。通過在補充有1%臍血血清的1%HEPES緩衝液中均質化1gm人心肌動蛋白產生心肌提取物。培養懸浮物60分鐘,然後離心並收集上清液。
4.培養細胞10-14天,每3-4天重新飼養。
5.利用心動蛋白RT/PCR基因表達分析評估分化。
5.1.8在分化前和/或分化後表徵臍血細胞利用例如流式細胞術和免疫細胞化學的技術測量形態學變化和細胞表面標記,以及利用例如PCR的技術測量基因表達變化而在分化前和/或分化後表徵臍血細胞。已經暴露於生長因子和/或已經分化的細胞特徵為存在或缺乏下列細胞表面標記CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、OCT-4+、和ABC-p+。優選地,在分化前通過存在細胞表面標記OCT-4+、APC-p+、CD34-和CD38-來表徵臍血來源的幹細胞。具有這些標記的幹細胞與人胚胎幹細胞一樣是多能的(例如多潛能的)。在分化前通過存在細胞表面標記CD34+和CD38+來表徵臍血細胞。來源於臍血細胞的分化細胞優選不表達這些標記。
5.2實施例2用臍血或臍血來源的幹細胞治療患有肌萎縮性側索硬化的個體肌萎縮性側索硬化(ALS),也稱為Lou Gehrig′s病,是影響皮層、腦幹和脊髓的運動神經元的致命的神經變性疾病。ALS影響多達20,000個美國人,美國每年發生5,000個新病例。大部分ALS病例是偶發的(S-ALS)而約5-10%是遺傳性的(家族性的-F-ALS)。當腦和脊髓中控制自主運動的特定神經細胞逐漸退化時,發生ALS。ALS的主要特性是喪失脊髓的運動神經元,導致在其控制下的肌肉變弱並且變得消耗導致麻痺。根據最初哪些肌肉變弱,ALS以不同的方式表現其自身。ALS發生在中年人中,其中男性比女性更多可能患上該疾病,是女性的1.5倍。診斷後5年內ALS通常是致命的。
ALS有家族性和偶發性的形式,並且現在已經使家族性的形式與幾個獨特的基因位點相聯繫。只有大約5-10%的ALS病例是家族性的。這些病例中,15-20%是由於編碼Cu/Zn超氧化物歧化酶1(SOD1)的基因中的突變。這些似乎是賦予該酶有毒特性的″獲得性的功能″突變。發現SOD突變作為ALS的原因已經為了解針對現有疾病的疾病動物模型中的一些進程鋪平了道路,並且正在發展和測試關於導致細胞死亡的分子事件的假說。
下文提供了用臍血或臍血來源的幹細胞治療患有ALS的個體的實例方法。該方法包括通過外周的、臨時的血管導管的靜脈內輸液。
最初通過進行標準的實驗室分析評估患有ALS的個體。這種分析可包括代謝的圖譜;伴有差示的CDC;脂類圖;纖維蛋白原水平;血液的ABO rH分型;肝功能試驗;和BUN/肌酸水平的測定。在移植前的當天指導個體攝取下列藥物苯海拉明(BenadrylTM),25mgt.i.d,和強的松,10mg。
從冷藏的原液解凍取出臍血或取出臍血來源的幹細胞,並且在移植前在大約5℃的溫度下維持大約2天。
在具有為靜脈內輸液、生理監護和物理觀察所必須的所有設備的門診患者臨床中心進行個體的移植。在移植前大約1小時,個體接受苯海拉明(BenadrylTM),25mg×1P.O.、和強的松,10mg×1P.O.。這是預防性的,是為了減少急性過敏反應的可能性。在輸液的時候,將18G存在於外周的靜脈線置入個體的四肢之一,並且通過以TKO速率輸入D5生理鹽水+20mEq KCl而保持開放的狀態。在移植之前,檢驗個體,具體是注意心率、呼吸速率、體溫。可進行其它的監測,例如心電圖和血壓測量。
然後以總計60ml液量、每小時1個單位的速率注入臍血或臍血來源的幹細胞,其中1個單位是大約1-2×109個總的有核細胞。備選地,遞送總液量為60ml的臍血或臍血來源的幹細胞的單位。根據來自小鼠中的臨床前研究的數據,每公斤體重應施用總共2.0-2.5×108個細胞。例如,70千克的個體可接受大約14-18×109個總的有核細胞。應監測該個體的過敏反應或超敏性的體徵,這是立即終止輸液的信號。
輸液後,應監測斜臥位的個體至少60分鐘,因此其可恢復正常的活動。
5.3實施例3用臍血或臍血來源的幹細胞治療患有動脈粥樣硬化的個體在實施例2中列出的輸液方法可用來將臍血或臍血來源的幹細胞施用於患有動脈粥樣硬化的患者。可將臍血或臍血來源的幹細胞施用於無症狀的個體、被候選進行血管成形術的個體、或最近(1周內)已經經受心臟手術的患者。
本發明不受限於在此所描述的具體實施方案的範圍。實際上,除在此所描述的實施方案外,根據上述說明書本發明的各種改變對於本領域的技術人員來說是顯而易見的。這種改變是屬於所附的權利要求的範圍內的。
在此引用的所有參考文獻在此全部引入作為參考,為了所有的目的達到相同的程度,正如各個單獨的出版物、專利、專利申請具體並且逐一地指明為所有目的全部引入作為參考。
引用任何出版物是為了引用在申請日之前的其所公開的內容,而不應認為是承認本發明由於在前發明的公開而不被授權。
權利要求
1.一種治療有需要的患者的方法,包括施用包括臍血或臍血來源的幹細胞的組合物,其中所述的施用遞送至少5×109個總的有核細胞。
2.權利要求2的方法,其中臍血或臍血來源的幹細胞適合於骨髓移植。
3.權利要求2的方法,其中臍血或臍血來源的幹細胞適合施用於人。
4.權利要求2的方法,其中大量臍血來源的幹細胞表達細胞表面標記CD34+和CD38-。
5.權利要求2的方法,其中大量臍帶血幹細胞表達細胞表面標記CD34+和CD38+。
6.權利要求2的方法,其中用生長因子處理臍血或臍血來源的幹細胞。
7.權利要求6的方法,其中生長因子是細胞因子、淋巴激活素、幹擾素、集落刺激因子(CSF)、幹擾素、趨化因子、白細胞介素、人造血生長因子、造血生長因子配體、幹細胞因子、血小板生成素(Tpo)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子、鹼性成纖維細胞生長因子、胎盤來源的生長因子或表皮生長因子。
8.權利要求6的方法,其中用生長因子處理臍血或臍血來源的幹細胞以誘導分化成為多種細胞類型。
9.權利要求6的方法,其中用生長因子處理臍血或臍血來源的幹細胞以防止或抑制分化成為特定的細胞類型。
10.一種治療脊髓發育不良的方法,其包括將臍血或臍血來源的幹細胞施用於有需要的患者。
11.權利要求1的方法,其中所述的施用遞送至少5×109個總的有核細胞。
12.權利要求1的方法,其中所述的施用遞送至少10×109個總的有核細胞。
13.權利要求1的方法,其中所述的施用遞送至少20×109個總的有核細胞。
14.權利要求1的方法,其中所述的患者患有包括炎症成分的疾病、紊亂或狀況。
15.權利要求1的方法,其中所述的患者患有血管疾病、紊亂或狀況。
16.權利要求15的方法,其中所述的疾病、紊亂或狀況是動脈粥樣硬化。
17.權利要求1的方法,其中所述的疾病、紊亂或狀況是神經疾病、紊亂或狀況。
18.權利要求17的方法,其中所述的疾病、紊亂或狀況選自肌萎縮性側索硬化和多發性硬化。
19.權利要求1的方法,其中所述的患者患有自身免疫紊亂。
20.權利要求19的方法,其中所述的自身免疫紊亂選自糖尿病和肌萎縮性側索硬化。
21.權利要求1的方法,其中所述的狀況由創傷或損傷造成或與創傷或損傷相關。
22.權利要求21的方法,其中所述的創傷或損傷是對中樞神經系統的創傷或損傷。
23.權利要求21的方法,其中所述的創傷或損傷是對周圍神經系統的創傷或損傷。
24.權利要求1的方法,其中所述的至少5×109個總的有核細胞包括來源於多個供體的細胞。
25.權利要求1的方法,其中在所述的施用前,所述組合物中的所述細胞都沒有進行HLA分型。
26.權利要求1的方法,其中在所述的施用前預調節所述的組合物18小時至21天。
27.權利要求1的方法,其中在所述的施用前預調節所述的組合物48小時至10天。
28.權利要求1的方法,其中在所述的施用前預調節所述的組合物3-5天。
全文摘要
本發明提供利用高劑量的臍血和臍血來源的幹細胞來治療多種狀況、疾病和紊亂的方法。高劑量的臍血和臍血來源的幹細胞具有許多用途和應用,包括但不限於,用於移植的治療用途和疾病的治療和預防、以及診斷和研究的用途。特別地,遞送高劑量的,例如每次治療遞送至少30億個有核細胞的臍血或臍血來源的幹細胞,其中該治療可包括單次或多次的輸注。本發明也提供來自多個供體而不需要HLA分型的臍血或臍血來源的幹細胞的用途。
文檔編號A61K45/00GK1770976SQ200480009600
公開日2006年5月10日 申請日期2004年2月13日 優先權日2003年2月13日
發明者R·J·哈裡裡 申請人:人類起源公司