小檗果提取物在製備抗癌藥物中的應用的製作方法

2023-10-08 00:17:34 1

小檗果提取物在製備抗癌藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種小檗果提取物的新用途，該新用途是小檗果提取物在製備抗癌藥物中的應用。所述提取物是按如下方法製備的：以小檗果為原料，用30%-90%乙醇提取，通過兩次大孔吸附樹脂純化得到，包括小檗果提取物A、小檗果提取物B。本發明所提供的小檗果提取物對製備抗癌藥物，尤其是抗肝癌、肺癌、胃癌藥物具有重要意義。
【專利說明】小棄果提取物在製備抗癌藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物醫藥領域，涉及一種中藥材提取物在製備抗癌藥物中的應用，具體是涉及小檗果提取物在製備抗癌藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]據2010年2月衛生部統計資料，每年全球癌症死亡人數達1000萬。目前全球四分之一人口死亡的原因是癌症所致，並預測按目前的趨勢發展下去，到2050年將有二分之一的死亡者是由於患了癌症。我國惡性癌發病率以每年2.5-5%速度增長，已成為嚴重危害人類生命的兀兇。在各種類型的癌症當中以肺癌、胃癌、肝癌等發病率較聞。
[0003]血管為正常組織器官的形成發生於功能維護所必需，它與人體發育失調和多種病因導致的種種疾病密切相關。腫瘤新血管形成在腫瘤發生、發展、轉移和復發起舉足輕重作用。一系列研究表明只要有效抑制腫瘤新血管形成，就能抑制腫瘤生成、轉移和復發。此外，糖尿病和風溼性關節炎等疾病都有血管增生，其血管異常與腫瘤血管非常相似。因此，血管增生抑制劑也可用於治療糖尿病和風溼性關節炎等血管增生性疾病。近年來，人們對腫瘤血管生成機制的研究不斷深入，許多抗腫瘤血管生成的藥物如Avastin、Angiostatin等相繼被開發出來，已在臨床上推廣應用。這類藥物不但可以用於大多數實體瘤的治療，還可以用於腫瘤的預防和血液系統惡性腫瘤的治療，同時對其他與血管生成有關的疾病如糖尿病視網膜病變、風溼性關節炎、銀屑病、血管瘤、動脈粥樣硬化等的預防與治療，都具有一定的理論和現實意義。
[0004]腫瘤中的腫瘤細胞可分為兩類。一類為普通的腫瘤細胞,一類為腫瘤幹細胞。普通的腫瘤細胞具有快速分裂，對抗腫瘤藥敏感，沒有自身更新能力等特點。因此普通的腫瘤細胞在分裂一定代數後會死亡。腫瘤幹細胞則具有如下特點:通常情況下處於靜止狀態，及不分裂狀態，對抗腫瘤藥不敏感，具有自身更新能力，即具有無限繁殖的能力。在腫瘤化療中，大量的腫瘤細胞被殺死(因為對化療藥敏感)，然而腫瘤幹細胞會生存下來(因為對化療藥不敏感)。腫瘤的復發是由於腫瘤化療藥對腫瘤幹細胞無效。找能有效治療腫瘤幹細胞的藥物是當前的一個方向。能否根除腫瘤的關鍵不在於能否殺滅普通的腫瘤細胞，而在於根除腫瘤幹細胞。
[0005]中醫藥治療癌症的歷史源遠流長，迄今已有紫杉、喜樹、砒霜、綠茶、靈芝、人參、長春花、天門冬、半枝蓮、天葵子等用於臨床治療癌症，取得了一些較好的效果。長期以來，人們應用傳統思維、理念和方法研發抗癌中草藥，雖然已取得了進步，但收效甚微。迄今中草藥尚未在國內外成為首選抗癌藥物，現有臨床中草藥的抗癌療效丞需進一步提高。因此，研發中草藥抗癌藥物是目前治療惡性癌的當務之急，而闡明內源性低分子抑瘤物的化學本質是這一領域研究的核心問題。
[0006]小檗果為小檗科植物紅果小檗Berberis nummularia Bge.的乾燥成熟果實。收載於1998年《中華人民共和國衛生部藥品標準維吾爾藥分冊》。其性平，具有健胃和中，生津止渴，清熱解毒之功效。用於消化不良，痢疾瀉下，口渴，口瘡，咽炎。為我國藏蒙等少數民族地區的常用藥物。但有關小檗果的基礎研究尚十分有限，使該藥材的後續推廣和應用受到限制。現代研究表明，小檗果含有小檗鹼、藥根鹼、巴馬亭等生物鹼類成分，以及天竺葵色素、錦葵色素等花色素類成分。其他化學成分不詳；藥理作用研究未見報導。
[0007]國內專利檢索結果，未見小檗果相關專利。
[0008]上述文獻及專利等，尚未見小檗果或小檗果提取物用於製備抗癌藥物的報導。

【發明內容】

[0009]本發明的目的在於提供小檗果提取物的一種小檗果提取物在製備抗癌藥物中的應用。
[0010]本發明是通過如下技術方案實現的:
本發明所用小檗果為小檗科植物紅果小檗Berberis nummularia Bge.的乾燥成熟果實。
[0011]本發明小檗果提取物在製備抗癌藥物中的應用，所述小檗果提取物的製備方法為:
(1)小檗果，用濃度30%-90%乙醇作為溶劑，提取溫度50°C_95°C，提取次數為1_3次，每次提取時間為1-4小時，每次溶劑用量為小檗果重量的6-15倍，濾過，合併提取液，回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.10-1.18，濾過，得藥液A ;
(2)將步驟(1)得到的藥液A，通過非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過極性大孔吸附樹脂，再用濃度50%-95%的乙醇溶液洗脫非極性大孔吸附樹脂，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物A ;再用濃度50%-95%的乙醇溶液洗脫極性大孔吸附樹脂，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物B ;
(3)上述小檗果提取物A、小檗果提取物B，其中一種或兩種按一定比例混勻，即得本發明的小檗果提取物。
[0012]小檗果提取物的製備方法為:
(1)小檗果，用濃度30%-90%乙醇作為溶劑，提取溫度50°C_95°C，提取次數為1_3次，每次提取時間為1-4小時，每次溶劑用量為小檗果重量的6-15倍，濾過，合併提取液，回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.10-1.18，濾過，得藥液A ;
(2)將步驟(1)得到的藥液A，通過非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過極性大孔吸附樹脂，再用濃度50%-95%的乙醇溶液洗脫非極性大孔吸附樹脂，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物A ;再用濃度50%-95%的乙醇溶液洗脫極性大孔吸附樹脂，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物B ;
(3)上述小檗果提取物A和小檗果提取物B混勻，即得本發明的小檗果提取物。
[0013]小檗果提取物的製備方法為:
(1)小檗果，用濃度70%乙醇作為溶劑，提取溫度70°C，提取次數為2次，每次提取時間為2.5小時，每次溶劑用量為小檗果重量的12倍；濾過，合併提取液，回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.15，濾過，得藥液A;
(2)將步驟(1)得到的藥液A，通過DlOl非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過LSA-40極性大孔吸附樹脂，再用濃度70%的乙醇溶液洗脫DlOl非極性大孔吸附樹月旨，收集70%濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物A ;再用濃度80%的乙醇溶液洗脫LSA-40極性大孔吸附樹脂，收集80%濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物B ；
(3)上述小檗果提取物A和小檗果提取物B混勻，即得本發明的小檗果提取物。
[0014]本發明的小檗果提取物中主要含有:小檗鹼、藥根鹼、巴馬亭、木蘭花鹼、天竺葵色素、錦葵色素。
[0015]本發明的小檗果提取物製備方法特徵在於:所採用的非極性大孔吸附樹脂為DlOl大孔吸附樹脂、AB-8大孔吸附樹脂；所採用的極性大孔吸附樹脂為LSA-40大孔吸附樹月旨、HPD600大孔吸附樹脂。
[0016]本發明的小檗果提取物，通過加入藥劑學允許的各種輔料，製成藥劑學上的片劑、顆粒劑、膠囊劑等口服劑型。 [0017]本發明所述抗癌藥物為抗肺癌藥物、抗肝癌藥物、抗胃癌藥物。本發明的小檗果提取物用於製備抗癌藥物，尤其是製備抗肺癌、抗肝癌、抗胃癌藥物。
[0018]本發明的小檗果提取物A、小檗果提取物B用於製備抗癌藥物，尤其是抗肺癌、抗肝癌、抗胃癌藥物。
[0019]本發明的小檗果提取物與化學藥或中藥或天然藥物組成的抗癌藥物。
[0020]本發明的的小檗果提取物A、小檗果提取物B與化學藥或中藥或天然藥物組成的抗癌藥物。
[0021]本發明首次探索研究以小檗科植物紅果小檗Berberis nummularia Bge.的乾燥成熟果實為原料提取製備抗癌提取物。本實驗研究表明，小檗果提取物對小鼠S180肉瘤的抑瘤率高，可見具有較強抗癌的作用，在此基礎上我們進一步研究其對血管生成的影響。評價癌血管生成程度的最客觀標準時癌組織內的微血管數目，本實驗通過小鼠移植性癌模型體內實驗，瘤體微血管標記染色，微血管密度計數顯示，小檗果各提取物均可抑制癌血管的生成，和對照組比較，具有顯著性差異。本發明測定小檗果提取物殺傷癌細胞(HepG2、GLC、MFC)的作用結果顯示，其主要表現為濃度依賴型的細胞毒作用特點，即隨著藥物劑量增加，抑制作用逐漸增強。
【具體實施方式】
[0022]下面通過具體實驗例和實施例對小檗果提取物在製備抗癌藥物中的應用做進一步說明，但不限於本發明。
[0023]實施例1:小檗果提取物及單體化合物製備
(1)小檗果15kg，用濃度70%乙醇作為溶劑，提取溫度70°C，提取次數為2次，每次提取時間為2.5小時，每次溶劑用量為小檗果重量的12倍；濾過，合併提取液，回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.15，濾過，得藥液A ;
(2)將步驟(1)得到的藥液A，通過DlOl非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過LSA-40極性大孔吸附樹脂，再用濃度70%的乙醇溶液洗脫DlOl非極性大孔吸附樹月旨，收集70%濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物A ;再用濃度80%的乙醇溶液洗脫LSA-40極性大孔吸附樹脂，收集80%濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物B ；
(3)上述小檗果提取物A和小檗果提取物B混勻，即得本發明的小檗果提取物。
[0024]小檗果提取物進行矽膠柱色譜、製備薄層色譜、以及S印hadex LH 一 20柱色譜，分別得到蛻小檗鹼、藥根鹼、巴馬亭、木蘭花鹼、天竺葵色素、錦葵色素。以上各化合物的化學結構均經質譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經高效液相色譜檢測均大於98%。
[0025]實施例2:小檗果提取物及單體化合物製備
(1)小檗果20kg，用濃度30%乙醇作為溶劑，提取溫度95°C，提取次數為I次，每次提取時間為4小時，每次溶劑用量為小檗果重量的15倍；濾過，合併提取液，回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.18，濾過，得藥液A;
(2)將步驟(1)得到的藥液A，通過AB-8非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過HPD600極性大孔吸附樹脂，再用濃度50%的乙醇溶液洗脫AB-8非極性大孔吸附樹月旨，收集50%濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物A ;再用濃度50%的乙醇溶液洗脫HPD600極性大孔吸附樹脂，收集50%濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物B ；
(3)上述小檗果提取物A和小檗果提取物B混勻，即得本發明的小檗果提取物。
[0026]小檗果提取物進行矽膠柱色譜、製備薄層色譜、以及S印hadex LH 一 20柱色譜，分別得到蛻小檗鹼、藥根鹼、巴馬亭、木蘭花鹼、天竺葵色素、錦葵色素。以上各化合物的化學結構均經質譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經高效液相色譜檢測均大於98%。
[0027]實施例3:小檗果提取物及單體化合物製備
(1)小檗果30kg，用濃度90%乙醇作為溶劑，提取溫度50°C，提取次數為3次，每次提取時間為I小時，每次溶劑用量為小檗果重量的6倍；濾過，合併提取液，回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.10，濾過，得藥液A ;
(2)將步驟(1)得到的藥液A，通過DlOl非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過HPD600極性大孔吸附樹脂，再用濃度95%的乙醇溶液洗脫DlOl非極性大孔吸附樹月旨，收集95%濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物A ;再用濃度95%的乙醇溶液洗脫HPD600極性大孔吸附樹脂，收集95%濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物B ；
(3)上述小檗果提取物A和小檗果提取物B混勻，即得本發明的小檗果提取物。
[0028]小檗果提取物進行矽膠柱色譜、製備薄層色譜、以及S印hadex LH 一 20柱色譜，分別得到蛻小檗鹼、藥根鹼、巴馬亭、木蘭花鹼、天竺葵色素、錦葵色素。以上各化合物的化學結構均經質譜和核磁共振等波譜手段確證，純度經高效液相色譜檢測均大於98%。
[0029]實施例4:小檗果提取物片劑的製備
取實施例1小檗果提取物320g，加入澱粉50g，混勻，制粒，乾燥，過篩，加微晶纖維素23g，硬脂酸鎂2.0g，混勻，壓製成1000片，即得小檗果提取物片劑。
[0030]實施例5:小檗果提取物膠囊的製備
取實施例2小檗果提取物245g，加入澱粉60g，混勻，制粒，乾燥，整粒，過篩，裝膠囊1000粒，即得小檗果提取物膠囊。
[0031]實施例6:小檗果提取物顆粒的製備
取實施例3小檗果提取物265g，加入糊精50g，澱粉50g，混勻，制粒，整粒，，即得小檗果提取物顆粒。
[0032]實驗例1: 小檗果提取物對小鼠移植性S18tl肉瘤血管形成抑制作用
方法:小鼠肉瘤S18tl瘤株，腹腔傳代接種。待腹水生長旺盛時，抽出腹水，細胞計數，調整細胞濃度為2*107個細胞/毫升，在小鼠腋下sc S180肉瘤細胞，每隻接種0.2ml。
[0033]實驗動物及瘤株:昆明小鼠，雌雄各半，6-8周齡，體重(20±2)g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供。小鼠肉瘤S18tl由武漢大學中國典型培養物保藏中心提供。[0034]藥品:小檗果提取物、小檗果提取物A、小檗果提取物B為按實施例1製備方法製備所得，批號分別為:20110506、20110507、20110508，分別配置成0.lg/ml生理鹽水溶液。
[0035]治療及分組:120隻小鼠於接種當天隨機分為5組:空白對照組、小檗果提取物組、小檗果提取物A組、小檗果提取物B組。小檗果提取物組、小檗果提取物A組、小檗果提取物B組，分別予以注射液25ml/kg。對照組予以生理鹽水0.2ml/只。治療IOd後處死小鼠，剝離瘤體稱重，按公式計算抑瘤率:抑瘤率=(對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重)/對照組平均瘤重*100%。
[0036]微血管染色:免疫組化SABC法染色血管，即用微型血管染色試劑盒(一抗為人相關第八因子)為武漢博士德生物公司產品。小檗果提取物各組和對照組瘤體剝離後，切取標本，固定，包埋，切片。經染色後的切片，內皮細胞褐染，血管呈黃褐色，易於辨認。MVD的測定按Bosari等報導的方法進行，先在低倍視野下選取癌微血管最豐富的區域，即「熱點」，再在400倍視野範圍計數被染成棕色的微血管數目，取3個數值的平均值作為MVD值。任何棕染的內皮細胞或內皮細胞簇，只要與臨近的微血管、癌細胞或其他結締組織分開，就視為一個血管，儘管血管腔常可看到，但並不作為判斷血管的標準。為了避免較大血管對計數的幹擾，對管壁有較厚平滑肌包繞或管腔>8個紅細胞面積的血管不予計數。
[0037]VEGF、bFGF免疫組化:VEGF、bFGF免疫組化檢測試劑盒(即用型)購自武漢博士德生物公司。陽性細胞呈棕黃色，免疫組化染色評分按Rahman等的方法進行，即VEGF、bFGF的評分標準是:根據著色細胞的比例(染色範圍)及染色強度，染色範圍(陽性細胞比率)分為0-4級，陰性為0分；陽性細胞1%_25%為I分；陽性細胞26%-50%為2分；陽性細胞51%-75%為3分；陽性細胞76%-100%為I分。染色強度劃分為0_3級；陰性為0分；弱陽性為I分；中等強度為2分；強陽性為3分，得分相加為最後評分。
[0038]統計方法:運用SPSS統計軟體，採用t檢驗。
[0039]結果:
(I)荷瘤鼠對治療措施的反應以及抑瘤率
接種後第6天，各組荷瘤鼠腋下移植瘤已有黃豆大小，小鼠活潑，飲食正常。對照組小鼠第8天後瘤體生長加快，部分小鼠不活潑，進食差；治療各組小鼠活潑，飲食正常，毛髮光澤正常，瘤體生長緩慢。各小檗果提取物組對小鼠S180肉瘤均有抑制作用。見表1表1小檗果提取物對小鼠S180肉瘤的抑制作用(n=10)。
【權利要求】
1.小檗果提取物在製備抗癌藥物中的應用，所述小檗果提取物的製備方法為: (1)小檗果，用濃度30%-90%乙醇作為溶劑，提取溫度50°C_95°C，提取次數為1_3次，每次提取時間為1-4小時，每次溶劑用量為小檗果重量的6-15倍，濾過，合併提取液，回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.10-1.18，濾過，得藥液A ; (2)將步驟(1)得到的藥液A，通過非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過極性大孔吸附樹脂，再用濃度50%-95%的乙醇溶液洗脫非極性大孔吸附樹脂，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物A ;再用濃度50%-95%的乙醇溶液洗脫極性大孔吸附樹脂，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物B ; (3)上述小檗果提取物A、小檗果提取物B，其中一種或兩種按一定比例混勻，即得本發明的小檗果提取物。
2.根據權利要求1所述小檗果提取物的製備方法為: (1)小檗果，用濃度30%-90%乙醇作為溶劑，提取溫度50°C_95°C，提取次數為1_3次，每次提取時間為1-4小時，每次溶劑用量為小檗果重量的6-15倍，濾過，合併提取液，回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.10-1.18，濾過，得藥液A ; (2)將步驟(1)得到的藥液A，通過非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過極性大孔吸附樹脂，再用濃度50%-95%的乙醇溶液洗脫非極性大孔吸附樹脂，收集不同濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物A ;再用濃度50%-95%的乙醇溶液洗脫極性大孔吸附樹脂，收集不同 濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物B ; (3)上述小檗果提取物A和小檗果提取物B混勻，即得本發明的小檗果提取物。
3.根據權利要求1所述小檗果提取物的製備方法為: (1)小檗果，用濃度70%乙醇作為溶劑，提取溫度70°C，提取次數為2次，每次提取時間為2.5小時，每次溶劑用量為小檗果重量的12倍；濾過，合併提取液，回收乙醇，濃縮至相對密度d=l.15，濾過，得藥液A; (2)將步驟(1)得到的藥液A，通過DlOl非極性大孔吸附樹脂，先用水洗脫，水洗脫液直接通過LSA-40極性大孔吸附樹脂，再用濃度70%的乙醇溶液洗脫DlOl非極性大孔吸附樹月旨，收集70%濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物A ;再用濃度80%的乙醇溶液洗脫LSA-40極性大孔吸附樹脂，收集80%濃度乙醇洗脫液，濃縮乾燥，即得小檗果提取物B ； (3)上述小檗果提取物A和小檗果提取物B混勻，即得本發明的小檗果提取物。
4.根據權利要求1、權利要求2、權利要求3所述的小檗果提取物，其特徵在於主要含有:小檗鹼、藥根鹼、巴馬亭、木蘭花鹼、天竺葵色素、錦葵色素。
5.根據權利要求1、權利要求2所述的小檗果提取物的製備方法，其特徵在於:所採用的非極性大孔吸附樹脂為DlOl大孔吸附樹脂、AB-8大孔吸附樹脂；所採用的極性大孔吸附樹脂為LSA-40大孔吸附樹脂、HPD600大孔吸附樹脂。
6.根據權利要求1、權利要求2、權利要求3所述的小檗果提取物，通過加入藥劑學允許的各種輔料，製成藥劑學上的片劑、顆粒劑、膠囊劑等口服劑型。
7.根據權利要求1所述抗癌藥物為抗肺癌藥物、抗肝癌藥物、抗胃癌藥物。
8.根據權利要求1所述的小檗果提取物與化學藥或中藥或天然藥物組成的抗癌藥物。
9.根據權利要求1所述的小檗果提取物A、小檗果提取物B在製備抗癌藥物中的應用。
10.根據權利要求1所述的小檗果提取物A、小檗果提取物B與化學藥或中藥或天然藥物組成的抗 癌藥物。
【文檔編號】A61K36/29GK103585237SQ201310525980
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月31日 優先權日:2013年10月31日
【發明者】孔倩倩 申請人:濟南星懿醫藥技術有限公司