一種聚乙二醇修飾幹擾素反應液中回收幹擾素的方法

2023-10-07 18:37:59

專利名稱：一種聚乙二醇修飾幹擾素反應液中回收幹擾素的方法
技術領域：
本發明屬於聚乙二醇修飾幹擾素反應液中的各組分分離純化領域，具體涉及一種聚乙二醇修飾幹擾素反應液中回收幹擾素的方法。

背景技術：
幹擾素(Interferon，IFN)由英國科學家Isaacs和LinderMann於1957年發現，是一類具有廣譜抗病毒活性的蛋白質，其中α幹擾素臨床上主要用於治療B型肝炎、C型肝炎等病毒性疾病，也用於一些腫瘤化療藥物的聯合用藥。
蛋白及多肽類藥物的缺陷在於易被酶水解和被腎臟清除，臨床半衰期短，需要多次注射以保持藥效濃度。蛋白及多肽經聚乙二醇(PEG)修飾以後，所得蛋白PEG偶聯物具有不易被酶水解、免疫原性降低、熱穩定性提高以及不易被腎小球代謝等特徵。自1977年Abuchowski A等首次將PEG偶聯劑用於修飾蛋白質以來，蛋白質PEG修飾技術迅速發展，PEG蛋白藥物也陸續上市已有包括PEG化的腺苷脫氨酶(PEG-ADA)；PEG化IFNα-2b(PEG-INTRONTM)；PEG化IFNα-2a(PEGASYSTM)；PEG化G-CSF(NEULASTATM)等40多種PEG化蛋白及多肽藥物用於臨床治療，同未修飾的蛋白藥物相比較，PEG化蛋白在療效和安全性等各方面具有極大的治療優勢。
PEG修飾蛋白質過程中，通常以單PEG化IFNα-2b的得率及PEG修飾多聚體和二聚體生成量作為主要考核指標，以對反應條件的進行優化。為了減少PEG修飾多聚體和二聚體的生成，以有利於下遊純化工作，必須控制一定的反應條件，這樣就有一定量的游離蛋白未與PEG偶聯。根據現有文獻記載，在PEG修飾IFNα-2b的反應中，往往約有30％～50％的IFNα-2b未與PEG偶聯，而IFNα-2b作為重組蛋白產品，生產條件苛刻，工藝複雜且價格昂貴，因此有必要對未被修飾的IFNα-2b進行回收利用。
目前已有多種層析技術可運用於蛋白質的分離純化，其中離子交換層析技術是運用最為廣泛的一種，其原理在於混合物中各種分子由於酸鹼性、極性、大小以及形狀等差異，與層析介質「手臂」通過庫倫引力/斥力發生相互作用，其結果是有的組分分子與層析介質「手臂」不吸附或弱吸附，而有的組分分子與層析介質「手臂」強吸附，隨後再通過控制洗脫條件，以實現各組分的柱口分離。當介質「手臂」所帶電荷為陰離子時，其反離子為陽離子，被稱為陽離子交換層析；當介質「手臂」所帶電荷為陽離子時，其反離子為陰離子，被稱為陰離子交換層析。
蛋白質是由多個胺基酸組成的高分子量化合物，其極性強弱主要取決於組成胺基酸的種類，極性胺基酸(帶電荷或不帶電荷)的多寡將影響蛋白質的極性，表現為蛋白質親水或疏水的變化；當蛋白質為親水性時，所帶電荷種類則會影響蛋白質的酸鹼性當所帶鹼性胺基酸(如Lys、Arg)較多時，蛋白質通常呈鹼性；所帶酸性胺基酸(Asp、Glu)較多時，蛋白質通常呈酸性。蛋白質的酸鹼性可以通過等電點PI來測定，蛋白質PI是蛋白質呈中性時的pH值，即蛋白質淨電荷為零時的pH值。當溶液的pH值低於蛋白質PI時，蛋白質帶正電荷，可與陽離子交換介質吸附；相反，若當溶液的pH值高於蛋白質PI時，蛋白質帶負電荷，可與陰離子交換介質吸附。
蛋白質經PEG修飾以後，與離子交換介質的吸附能力大大降低，PEG分子的屏蔽作用是最主要的原因，線性的PEG分子纏繞在蛋白質周圍，使得帶電荷殘基無法與介質「手臂」靠近。此時，為了保證PEG修飾蛋白的充分吸附，需要將加樣緩衝液的pH值更遠離PI，當層析介質為陽離子型時，可降低加樣緩衝液的pH以使殘基質子化程度提高，增加蛋白質正電荷數目，加強蛋白與介質的吸附能力；同樣，層析介質為陰離子型時，可增加加樣緩衝液的pH以使殘基去質子化程度提高，增加蛋白質負電荷數目。
基於以上理論，採用常規方法(姜忠義，高蓉，許松偉等，藥物蛋白的聚乙二醇修飾，中國藥學雜誌；37(6)409～414)純化PEG修飾蛋白時，一般用低pH或高pH緩衝液稀釋反應液，將稀釋液上陽離子或陰離子交換柱，使PEG修飾蛋白及未修飾蛋白均被吸附，利用二者吸附能力的差異，採用NaCl濃度梯度洗脫方式，以獲取PEG修飾蛋白。
在上述過程中，由於PEG的位阻作用，為了將PEG修飾蛋白充分吸附，加樣緩衝液的pH值通常遠離PI，因此使得未修飾蛋白往往吸附得相當牢固，需要高濃度鹽才能洗脫。然而採用高濃度鹽洗脫時往往會導致蛋白變性沉澱，同時採用高濃度鹽洗脫時，一些雜質如變性蛋白、內毒素、反應副產物或PEG修飾劑水解脫落基團也會一同被洗脫，從而導致回收蛋白的純度、比活及內毒素水平均受影響，這種方法所回收得到的蛋白，往往因沒有利用價值而被捨棄，不但提高了PEG化蛋白的生產成本，也造成了相當程度的浪費。


發明內容
本發明的目的是提供一種自PEG修飾IFN反應液中回收IFN的方法，本方法不影響PEG化IFN的收率以及純度，同時從反應液中所回收的IFN的各項質控指標應與對照品保持一致，能夠重複利用。
為實現上述目的，本發明包括如下步驟 a、將聚乙二醇修飾幹擾素反應液用酸或鹼調至pH值位於5.0～8.0之間； b、將上述所得反應液置換到等pH加樣緩衝液，調節加樣緩衝液離子強度，再經離子交換層析，使聚乙二醇修飾幹擾素穿透，而游離幹擾素被吸附； c、將上述離子交換層析柱充分平衡後，採用濃度為0～200毫摩爾/升的NaCl溶液洗脫，所得洗脫峰即為回收的游離幹擾素。
由於PEG的位阻作用，PEG修飾IFN同未經修飾的IFN相比，二者與離子交換層析介質的吸附能力存在很大的差異，此時通過控制加樣緩衝液的pH值和離子強度，可以使PEG修飾IFN以穿透峰流出，而未修飾蛋白則被吸附；與前述的常規方法相比較，本方法中加樣緩衝液pH值更接近於蛋白質等電點，因此未修飾IFN經低鹽即可洗脫，從而可以保證回收的IFN的質量。
所述的步驟a中聚乙二醇的分子量為20～40KD，酸為HAc，鹼為NaOH。
可以有效實施本發明的加樣緩衝液的pH值範圍很寬，這主要取決於PEG修飾劑的分子量大小及加樣緩衝液的種類和離子強度，如使用陰離子交換介質時，加樣緩衝液的pH值範圍包括7.0～8.0；使用陽離子交換介質時，所述加樣緩衝液的pH值範圍包括5.0～5.8，優選5.0～5.6。
可以有效實施本發明的加樣緩衝液的種類很多，就陰離子交換層析而言，理論上可以使用pH值在6.0～8.5之間的具有緩衝能力的緩衝液，優選pH值在7.0～7.5之間的具有緩衝能力的磷酸鹽緩衝液、Tris-鹽酸、巴比妥鈉-鹽酸等緩衝液。就陽離子交換層析而言，理論上可以使用pH值在4.0～6.0之間的具有緩衝能力的緩衝液，優選pH值在5.0～5.6之間的具有緩衝能力的醋酸-醋酸鈉、磷酸氫二鈉-檸檬酸、檸檬酸-檸檬酸鈉等緩衝液。
所述的步驟b中，將聚乙二醇修飾幹擾素反應液置換到等pH加樣緩衝液，調節加樣緩衝液離子強度時可以採用如下兩種方法改變加樣緩衝液組分的濃度或者向加樣緩衝液中另外加入中性鹽。
可以有效實施本發明的加樣緩衝液離子強度取決於加樣緩衝液的種類，包括緩衝液離子解離程度，反離子交換蛋白質能力的強弱。本發明加樣緩衝液中組分的濃度範圍選擇為2～50毫摩爾/升(mM)，優選20～40mM。一般情況下，由於PEG修飾蛋白與未修飾蛋白的性質差異較大，通過調節緩衝液組分的濃度即可達到分離目的，但也可以通過加入中性鹽以增加離子強度來達到分離目的，所述的中性鹽比如NaCl和/或KCl，NaCl和/或KCl的濃度範圍選擇為0～50mM，優選2～20mM。
本發明的回收方法尤其適用於自聚乙二醇修飾幹擾素α-2b反應液中回收幹擾素α-2b。
本發明中的回收幹擾素的方法同常規方法相比，具有以下不同點及優勢 1.本發明收集的穿透峰可用HAc或NaOH調pH，增加蛋白表面殘基質子化或去質子化程度，然後再經陽離子或陰離子交換層析，並用鹽梯度洗脫，以獲取主要含單PEG化IFN的目標峰，同常規純化方法相比，本發明的回收方法不影響PEG化IFN的純化收率及純度。
2.本發明收集穿透峰以後，用低鹽即可洗脫，所得洗脫峰即為回收IFN，回收得到的IFN的比活、純度、內毒素等質控指標均能與對照品保持一致，且能夠重複利用。
3.現有技術中，多位點PEG修飾蛋白與單位點PEG修飾蛋白的分離是PEG修飾蛋白技術的難點之一，離子交換介質載量是影響PEG修飾蛋白純化的重要原因之一。本發明的方法中，通過步驟b中的穿透峰將游離幹擾素去除後，調節pH後重新上樣，相對於常規方法，其加樣量更小，因此，更有利於提高PEG修飾蛋白的分離效果。



圖1A、1B分別為實施例一中SDS-PAGE電泳檢測的碘染色圖和考馬斯亮藍染色圖； 圖1C為實施例一中SEHPLC鑑定回收IFNα-2b純度的鑑定結果圖； 圖2A、2B分別為實施例二中SDS-PAGE電泳檢測的碘染色圖和考馬斯亮藍染色圖； 圖2C為實施例二中SEHPLC鑑定回收IFNα-2b純度的鑑定結果圖； 圖3A、3B分別為實施例四中SDS-PAGE電泳檢測的碘染色圖和考馬斯亮藍染色圖； 圖3C為實施例四中SEHPLC鑑定回收IFNα-2b純度的鑑定結果圖； 圖4A、4B分別為實施例五中SDS-PAGE電泳檢測的碘染色圖和考馬斯亮藍染色圖； 圖4C為實施例五中SEHPLC鑑定回收IFNα-2b純度的鑑定結果圖； 附圖中標記符號的含義如下 1-A液(反應液)；2-E液(穿透峰)；3-低分子量Mark； 4-洗脫峰(回收IFNα-2b)；5-對照品IFNα-2b
具體實施例方式 以下通過具體實施例對本發明作詳細說明 實施例一採用陰離子介質Q-sepharose回收IFNα-2b 1、PEG修飾IFNα-2b反應液的製備 IFNα-2b原液加硼酸緩衝液，調pH值至7.0～9.0之間，按投料比2.0～3.0∶1加入mPEG-NHS(分子量20KD)，室溫反應2hrs，製成A液。
2、IFNα-2b的回收及單PEG化IFNα-2b的純化 2.1、相關工作液的配製 B液(加樣緩衝液)磷酸鹽緩衝液(磷酸氫二鈉—磷酸二氫鈉)，pH7.5，20mM。
C液(置換處理後的反應液)用B液充分置換A液(透析或超濾)，得到C液。
D液(IFN洗脫液)向B液中加入NaCl，NaCl終濃度為100mM。
E液(PEG-IFN純化工作液)Tris-HCl緩衝液，pH8.5，20mM。
2.2、IFNα-2b的回收 Q-sepharose處理再生後，以B液為工作液，充分平衡Q-sepharose；取一定量C液，經Q-sepharose，收集穿透峰(F)，Q-sepharose仍用B液平衡，並用D洗脫，收集洗脫峰(G)，G即為回收IFN。
2.3、單PEG化IFNα-2b的純化 Q-sepharose處理再生後，以E液為工作液，充分平衡Q-sepharose；取一定量F，並用NaOH調pH至8.5，上樣，以E液為工作液，平衡後，0～200mM NaCl梯度洗脫，收集主要含單PEG化IFNα-2b的目標峰。濃縮後用Sephacryl S-300層析收集單PEG化IFNα-2b，流動相為生理鹽水。
3、回收IFNα-2b質控指標鑑定 3.1、活性鑑定 採用微量病毒抑制(WISH/VSV)法。
3.2、SDS-PAGE電泳檢測 12％分離膠，5％濃縮膠，利用凝膠系統掃描純度，分別用考馬斯亮藍染色和碘染色，檢測結果分別參見附圖1A和1B，因碘染色的特異性針對PEG，故附圖1A中的3、4、5未經染色。
3.3、SEHPLC鑑定回收IFNα-2b純度。
鑑定條件為中國藥典方法，鑑定結果參見附圖1C。
3.4、內毒素水平檢測 採用鱟試劑檢測法，其內毒素水平能與對照品保持一致。
3.5、異常毒性檢測 小鼠異常毒性試驗見表1 表1Q-sepharose回收IFNα-2b各項質控指標檢測結果 以上各項質控指標檢測結果顯示，同對照品相比，本方法所回收IFNα-2b均能與其保持一致，且符合中國藥典規定。
實施例二採用陰離子介質Q-sepharose回收IFNα-2b B液(加樣緩衝液)Tris-鹽酸作為加樣緩衝液，pH8.0，50mM； D液(IFN洗脫液)向B液中加入NaCl，NaCl終濃度為20mM。
其餘條件同實施例一。
檢測與鑑定結果分別參見附圖2A、2B、2C，因碘染色的特異性針對PEG，故附圖2A中的3、4、5未經染色。
各項質控指標檢測結果顯示，同對照品相比，本方法所回收IFNα-2b均能與其保持一致，且符合中國藥典規定。
實施例三採用陰離子介質Q-sepharose回收IFNα-2b 1、PEG修飾IFNα-2b反應液的製備 IFNα-2b原液加硼酸緩衝液，調pH值至7.0～9.0之間，按投料比2.0～3.0∶1加入mPEG-NHS(分子量40KD)，室溫反應2hrs，製成A液。
其餘條件同實施例一。
各項質控指標檢測結果顯示，同對照品相比，本方法所回收IFNα-2b均能與其保持一致，且符合中國藥典規定。
實施例四採用陽離子介質SP-sepharose回收IFNα-2b 1、PEG修飾IFNα-2b反應液的製備 IFNα-2b原液加硼酸緩衝液，調pH值至7.0～9.0之間，按投料比2.0～3.0∶1加入mPEG-NHS(分子量20KD)，室溫反應2hrs，製成A液。
2、IFNα-2b的回收及單PEG化IFNα-2b的純化 2.1、相關工作液的配製 B液(加樣緩衝液)醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH5.6，40mM。
C液(置換處理後的反應液)用B液充分置換A液(透析或超濾)，得到C液。
D液(IFN洗脫液)向B液中加入NaCl，NaCl終濃度為150mM。
E液(PEG-IFN純化工作液)醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH4.0，20mM。
2.2、IFNα-2b的回收 SP-sepharose處理再生後，以B液為工作液，充分平衡SP-sepharose；取一定量C液，經SP-sepharose，收集穿透峰(F)，SP-sepharose仍用B液平衡，並用D洗脫，收集洗脫峰(G)，G即為回收IFN。
2.3、單PEG化IFNα-2b的純化 SP-sepharose處理再生後，以E液為工作液，充分平衡SP-sepharose；取一定量F，並用HAC調pH至4.0，上樣，以E液為工作液，平衡後，0～200mM NaCl梯度洗脫，收集主要含單PEG化IFNα-2b的目標峰。濃縮後用Sephacryl S-300層析收集單PEG化IFNα-2b，流動相為生理鹽水。
3、回收IFNα-2b質控指標鑑定 鑑定方法同實施例一，檢測與鑑定結果分別參見附圖3A、3B、3C，因碘染色的特異性針對PEG，故附圖3A中的3、4、5未經染色。
小鼠異常毒性試驗見表2 表2SP-sepharose回收IFNα-2b各項質控指標檢測結果 以上各項質控指標檢測結果顯示，同對照品相比，本方法所回收IFNα-2b均能與其保持一致，且符合中國藥典規定。
實施例五採用陽離子介質SP-sepharose回收IFNα-2b B液(加樣緩衝液)檸檬酸-檸檬酸鈉，pH5.0，10～20mM； D液(IFN洗脫液)向B液中加入KCl，KCl終濃度為20～30mM。
其餘條件同實施例四。
檢測與鑑定結果分別參見附圖4A、4B、4C，因碘染色的特異性針對PEG，故附圖4A中的3、4、5未經染色。
各項質控指標檢測結果顯示，同對照品相比，本方法所回收IFNα-2b均能與其保持一致，且符合中國藥典規定。
實施例六採用陽離子介質SP-sepharose回收IFNα-2b B液(加樣緩衝液)醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH5.8，10mM； D液(IFN洗脫液)向B液中加入NaCl，NaCl終濃度為10～15mM。
其餘條件同實施例四。
各項質控指標檢測結果顯示，同對照品相比，本方法所回收IFNα-2b均能與其保持一致，且符合中國藥典規定。
權利要求
1.一種聚乙二醇修飾幹擾素反應液中回收幹擾素的方法，包括如下步驟
a、將聚乙二醇修飾幹擾素反應液用酸或鹼調至pH值位於5.0～8.0之間；
b、將上述所得反應液置換到等pH加樣緩衝液，調節加樣緩衝液離子強度，再經離子交換層析，使聚乙二醇修飾幹擾素穿透，而游離幹擾素被吸附；
c、將上述離子交換層析柱充分平衡後，採用濃度為0～200毫摩爾/升的NaCl溶液洗脫，所得洗脫峰即為回收的游離幹擾素。
2.根據權利要求1所述的聚乙二醇修飾幹擾素反應液中回收幹擾素的方法，其特徵在於所述的幹擾素為α-2b幹擾素。
3.根據權利要求1或2所述的聚乙二醇修飾幹擾素反應液中回收幹擾素的方法，其特徵在於所述的步驟a中聚乙二醇的分子量為20～40KD，酸為HAc，鹼為NaOH。
4.根據權利要求3所述的聚乙二醇修飾幹擾素反應液中回收幹擾素的方法，其特徵在於所述的步驟b中，當離子交換層析為陰離子交換層析時，步驟a中的聚乙二醇修飾幹擾素反應液的pH值調至7.0～8.0之間；若離子交換層析為陽離子交換層析時，步驟a中的聚乙二醇修飾幹擾素反應液的pH值調至5.0～5.8之間。
5.根據權利要求4所述的聚乙二醇修飾幹擾素反應液中回收幹擾素的方法，其特徵在於所述的步驟b中，當離子交換層析為陰離子交換層析時，等pH加樣緩衝液為pH值位於7.0～7.5之間的磷酸鹽緩衝液或Tris-鹽酸或巴比妥鈉-鹽酸；若離子交換層析為陽離子交換層析時，加樣緩衝液為pH值位於5.0～5.6之間的醋酸-醋酸鈉或磷酸氫二鈉-檸檬酸或檸檬酸-檸檬酸鈉。
6.根據權利要求5所述的聚乙二醇修飾幹擾素反應液中回收幹擾素的方法，其特徵在於所述的磷酸鹽緩衝液或Tris-鹽酸或巴比妥鈉-鹽酸的濃度為2～50毫摩爾/升，醋酸-醋酸鈉或磷酸氫二鈉-檸檬酸或檸檬酸-檸檬酸鈉的濃度為2～50毫摩爾/升。
7.根據權利要求5所述的聚乙二醇修飾幹擾素反應液中回收幹擾素的方法，其特徵在於所述的聚乙二醇修飾幹擾素反應液置換到等pH加樣緩衝液後，向緩衝液中加入中性鹽以調節加樣緩衝液的離子強度，中性鹽的濃度為0～50毫摩爾/升。
8.根據權利要求6所述的聚乙二醇修飾幹擾素反應液中回收幹擾素的方法，其特徵在於所述的所述的磷酸鹽緩衝液或Tris-鹽酸或巴比妥鈉-鹽酸的濃度為20～40毫摩爾/升，醋酸-醋酸鈉或磷酸氫二鈉-檸檬酸或檸檬酸-檸檬酸鈉的濃度為20～40毫摩爾/升。
9.根據權利要求7所述的聚乙二醇修飾幹擾素反應液中回收幹擾素的方法，其特徵在於所述的中性鹽為NaCl和/或KCl。
10.根據權利要求7所述的聚乙二醇修飾幹擾素反應液中回收幹擾素的方法，其特徵在於所述的中性鹽的濃度為2～20毫摩爾/升。
全文摘要
本發明屬於聚乙二醇修飾幹擾素反應液中的各組分分離純化領域，具體涉及一種聚乙二醇修飾幹擾素反應液中回收幹擾素的方法。本發明包括如下步驟a、將聚乙二醇修飾幹擾素反應液用酸或鹼調至pH值位於5.0～8.0之間；b、將上述所得反應液置換到等pH加樣緩衝液，調節加樣緩衝液離子強度，再經離子交換層析，使聚乙二醇修飾幹擾素穿透，而游離幹擾素被吸附；c、將上述離子交換層析柱處理再生後，低鹽洗脫，所得洗脫峰即為回收的游離幹擾素。本發明中的方法不影響PEG化IFN的收率以及純度，同時從反應液中所回收的IFN的各項質控指標應與對照品保持一致，能夠重複利用。
文檔編號C07K1/18GK101768205SQ20101011553
公開日2010年7月7日 申請日期2010年3月1日 優先權日2010年3月1日
發明者宋禮華, 許培, 戎隆富, 程婷, 鄔婧 申請人:安徽安科生物工程(集團)股份有限公司