一種從黨參藥材中快速分離純化黨參炔苷單體的方法
2023-10-07 21:49:59 1
專利名稱：一種從黨參藥材中快速分離純化黨參炔苷單體的方法
技術領域：
本發明涉及能工業化地從藥材黨參中快速分離純化黨參炔苷單體的工藝方法。
背景技術：
桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf.、素花黨參 Codonopsis pilosula Nannf.var. modesta (Nannf.) L. T. Shen或川黨參Codonopsis tangshen Oliv.的乾燥根為歷版藥典收載品種。因產地、種類不同而有多種商品, 比如潞黨參、臺黨參、東黨參及文黨參等，都具有補中益氣，健脾益肺等功效，他 們都共同含有其活性成分黨參炔苷，2005版藥典已經由黨參多糖作為特徵成分 改為採用黨參炔苷作為薄層鑑定的特徵成分，為了更好地控制黨參的內在質量， 對黨參炔苷的需求將會越來越大，而目前市場上僅有少數幾家提供毫克級量的廠 家。目前文獻報導的黨參炔苷的含量很低，為萬分之三到千分之一，且黨參炔苷 不穩定，見光受熱易分解。目前文獻報導(賀慶等人)的黨參炔苷的方法為分 部位萃取後反覆柱層析，包括矽膠柱層析和葡聚糖層析等，此方法耗時長，溶劑 消耗大，回收溶劑繁瑣。
發明內容
本發明的目的在於提供能中藥材黨參中工業化地、快速地、低成本地分離高 純度黨參炔苷單體的方法。
完成本發明的任務包括如下步驟
一種從藥材黨參中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，在25X:—58'C條件 下，最好是在55'C條件下進行以下步驟
A.冷浸提取:用黨參乾燥塊根粉與乙醇或甲醇混合浸泡24小時一36小時， 冷浸過濾除渣，所得液體用減壓回收除去乙醇或甲醇獲得濃浸膏；混合比例是黨
參體積與乙醇或甲醇體積比為1: 3;乙醇濃度為95%—100%，甲醇濃度為100%。 B.樹脂粗分用水稀釋上步所得濃浸膏作為樣品，在大孔樹脂上樣之前， 用200目左右的細紗布過濾，以除去沙塵等固體雜質，再上樣到經過活化處理的
大孔吸附樹脂柱，用50%--70%乙醇洗脫大孔吸附樹脂，將乙醇洗脫液減壓旋轉 蒸發除去乙醇；大孔吸附樹選用D131或者D101大孔吸附樹脂，可用安徽三星樹 脂有限公司提供的D131或者D101大孔吸附樹脂。洗脫分三步第一步用水洗至 幾乎沒有顏色，除去大部分多糖等大極性雜質，第二步用兩個柱體積的(2BV) 30%乙醇洗脫，進一步除去雜質而使黨參炔苷保留在樹脂上，第三步用50%—70% 乙醇洗脫，黨參炔苷主要集中在50%—70%乙醇洗脫液中，得到黨參炔苷粗品， 純度為60%左右，見圖l。這種三步法洗脫使其能保證大部分極性比黨參炔苷大 的雜質被除去，大大提高了提取物中的黨參炔苷的含量，這是本發明的要點之一。
C. 色譜分離用丙酮溶解C18 (十八烷基鍵合矽膠，購自日本Fuji公司) 填料攪拌均勻使其成勻漿狀後，採用動態軸向壓縮法裝柱，柱規格為 25cm*5cm—25cm*30cm。將黨參炔苷粗品用乙腈-水的流動相稀釋後進樣， 一次制 備色譜分離循環大約持續30min，分段收集流出液即流分,用分析型高效液相色 譜儀對各餾分進行純度檢測，純度為98%以上的流分為本步驟的合格品，純度低 於95%的流分重複上述步驟，純度98%以上的流分回收產品後，得到黃色油狀物， 然後進入下一個步驟。
本步驟中，乙腈-水的流動相中乙腈佔水的體積比例為15%-30%，高壓輸液 泵和UV (紫外-可見光)檢測器由北京創新通恆科技有限公司和成都普思生物科 技有限公司聯合提供。檢測波長為267nm，流速為250ml/min，進樣量為50ml， 色譜柱為成都普思生物科技有限公司自主研製，C18反相填料裝柱，C18粒徑為 10nm-25iim，孔徑為100 A。
本步驟的樣品回收方法由於流動相中含大量水，在55'C的溫度下很難濃 縮除去水。所以濃縮過程採取減壓回收乙腈後，用D101大孔吸附樹脂富集，用 95%的乙醇洗脫，減壓回收乙醇的方法，可以快速地，且保證黨參炔苷不會因為 溫度過高和長久受熱而分解。製備分離的在線監測圖譜見圖2。
D. 脫色純化將純度達98%以上的黃色油狀黨參炔苷浸膏加入聚醯胺樹脂 後，用水洗脫聚醯胺樹脂得水洗脫液；為回收產品，將水洗脫液加入大孔吸附樹 脂，再用95%的乙醇洗脫大孔吸附樹脂上的黨參炔苷，減壓回收除去乙醇，最
後得到純度高達98.5%以上的黨參炔苷產品。聚醯胺樹脂可選上海摩速科學器材 有限公司的120目的聚醯胺樹脂。見圖3。
圖1是D101大孔吸附樹脂粗分後的HPLC圖譜； 圖2是製備型液相色譜分離黨參炔苷的在線監測圖譜； 圖3是黨參炔苷純品的HPLC圖譜。
本發明的優點
1、B.樹脂粗分步驟中，三步法洗脫使其能保證大部分極性比黨參炔苷大的 雜質被除去，大大提高了提取物中的黨參炔苷的含量，這是本發明的要點之一。
2、 能工業化的大量分離獲得黨參炔苷產品傳統用直徑5cm的矽膠柱分離 一次分離量小，僅為10mg左右，分離效率低，本方法用製備型高效液相色譜分離， 一次可上樣500mg以上,故可以工業化生產分離獲得黨參炔苷產品。
3、 得率高100kg黨參原藥材含黨參炔苷50g左右，本技術最後可得到黨參 炔苷純品45g，得率達到卯％以上。
3、 產品純度高，純度可達98.5%以上，為黨參炔苷的含量檢測和黨參的質量 控制打下了堅實的基礎。
4、 溶劑消耗少，可回收利用採用常規方法的溶劑用量大，且用氯仿-甲醇, 氯仿-甲醇-水等的混合體系，回收步驟繁瑣，本方法主要用乙腈-水的體系，乙腈 能有效回收再利用。
5、 成本低本發明需消耗材料包括黨參原藥材，溶劑(乙醇、乙腈、水等)， 而現有的常規方法方法分離需消耗黨參原藥材，溶劑(石油醚、乙酸乙酯、正丁 醇、氯仿、甲醇、水等)、聚醯胺等。可見本發明工藝步驟簡潔，傳統的方法經歷 了萃取，矽膠柱層析，葡聚糖層析，ODS(反相矽膠)層析等步驟，消耗大量溶劑成 本和人力成本，而本方法僅經過大孔樹脂粗分，製備型高效液相色譜分離和聚醯 胺脫色三個步驟，耗費溶劑和人力成本都少，工藝周期短。
6、具有較高的學術價值:本發明用製備型高效液相色譜為主要設備進行分離，
製備高效液相在國內外天然產物的分離純化中應用得越來越廣，對普及這一先進 的技術是一種強有力的推動，而現有技術分部位萃取後反覆柱層析，包括矽膠柱 層析和葡聚糖層析等。
具體實施例
實例1
一種從山西產黨參藥材中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，在55'C條件 下進行以下步驟
A.冷浸提取用黨參乾燥塊根粉碎過60目篩後與乙醇混合浸泡24小時小 時，冷浸過濾除渣，所得液體用減壓回收除去乙醇獲得濃浸膏；混合比例是黨參 粉體積與乙醇或甲醇體積比為1: 3。乙醇濃度為95%。
B. 樹脂粗分用水稀釋上步濃浸膏後，在上大孔樹脂之前，用200目左右 的細紗布過濾，以除去沙塵等固體雜質，再通入經過活化處理的大孔吸附樹脂柱， 用50%乙醇洗脫大孔吸附樹脂，將乙醇洗脫液減壓旋轉蒸發除去乙醇，濃浸膏用 水稀釋倍數以2倍水為宜，大孔吸附樹選用D131大孔吸附樹脂，用安徽三星樹 脂有限公司提供的D131大孔吸附樹脂。洗脫分三步第一步用水洗至幾乎沒有 顏色，除去大部分多糖等大極性雜質，第二步用兩個柱體積的(2BV) 30%乙醇 洗脫，進一步除去雜質而使黨參炔苷保留在樹脂上，第三步用50%乙醇洗脫，黨 參炔苷主要集中在這部分洗脫液中，得到黨參炔苷粗品，純度為60%左右。
大孔吸附樹脂活化處理的方法為在層析柱中加入高於樹脂層10 CM的乙 醇浸漬4小時，然後用乙醇淋洗，洗至流出液在試管中用水稀釋不渾濁時為止。 最後用水反覆洗滌至乙醇含量小於1%或無明顯乙醇氣味後即可。
C. 色譜分離用丙酮溶解C18 (十八烷基鍵合矽膠，購自曰本Fuji公司) 填料攪拌均勻使其成勻漿狀後，採用動態軸向壓縮法裝柱，柱規格為25Cm*5cm。 將黨參炔苷粗品用乙腈-水的流動相稀釋後進樣，主峰出峰時間為25.66min，從 25.00min開始，至25.86min以及29.08min以後，分為前段，中段，後段三個 部分分別收集流出液，由於前段和後段流出液的黨參炔苷粗品(HPLC)達不到 純度為98%，則將前段和後段流出液再次進樣。中段黨參炔苷粗品(HPLC) — 般能到達到純度為98%，所以將中段流出液分別減壓濃縮，得到黃色油狀物，含 黨參炔苷粗品(HPLC)達到純度為98%的濃縮收集液才進行下述步驟。
本步驟中，乙腈-水的流動相中乙腈佔水的體積比例為15%，高壓輸液泵和 UV (紫外-可見光)檢測器由北京創新通恆科技有限公司和成都普思生物科技有 限公司聯合提供。檢測波長為267nm，流速為250ml/min，進樣量為50ml，色譜柱為成都普思生物科技有限公司自主研製，C18小顆粒球形反相矽膠裝柱，C18 粒徑為10um-30um,孔徑為100A。
本步驟的產品濃縮方法由於流動相中含大量水，在55'C的溫度下很難濃 縮除去水。所以去水濃縮過程採取回收乙腈後，用D101大孔吸附樹脂富集，用 95。％的乙醇洗脫，減壓回收乙醇的方法，可以快速地濃縮，且保證黨參炔苷不會 因為溫度過高和長久受熱而分解。製備色譜的分析圖譜見圖2。
D.脫色純化將純度達98%以上的黃色油狀黨參炔苷浸膏加入聚醯胺樹脂 後，用水洗脫聚醯胺樹脂；洗脫液用D101大孔樹脂富集，再用95%的乙醇洗脫 大孔吸附樹脂上的黨參炔苷，減壓回收除去乙醇，最後得到高純度達到98.5%的 黨參炔苷產品。聚醯胺樹脂可選上海摩速科學器材有限公司的120目的聚醯胺樹 脂。見圖3。 實例2
一種從山西產黨參藥材中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，在25'C條件 下進行以下步驟
A.冷浸提取用黨參乾燥塊根粉與乙醇混合浸泡36小時，冷浸過濾除渣， 所得液體用減壓回收除去乙醇獲得濃浸膏；混合比例是黨參粉體積與乙醇體積比 為h 3;乙醇濃度為100%，黨參乾燥塊根粉的粒度為40目。
B. 樹脂粗分用水稀釋上步濃浸膏後，在上大孔樹脂之前，用200目左右 的細紗布過濾，以除去沙塵等固體雜質，再通入經過活化處理的大孔吸附樹脂柱， 用60%乙醇洗脫大孔吸附樹脂，將乙醇洗脫液減壓旋轉蒸發除去乙醇；濃浸膏用 水稀釋倍數以3倍水為宜，大孔吸附樹選用D101大孔吸附樹脂，可用安徽三星 樹脂有限公司提供的D101大孔吸附樹脂。洗脫分三步第一步用水洗至幾乎沒 有顏色，除去大部分多糖等大極性雜質，第二步用兩個柱體積的(2BV) 30%乙醇 洗脫，進一步除去雜質而使黨參炔苷保留在樹脂上，第三步用60%乙醇洗脫，黨 參炔苷主要集中在這部分乙醇洗脫液中，得到黨參炔苷粗品，純度為60%左右。
大孔吸附樹脂活化處理的方法同於實例1。
C. 色譜分離本步驟所有步驟和材料同於實例l，僅乙腈-水的流動相中乙 腈佔水的體積比例為30%。
D. 脫色純化將純度達98%以上的黃色油狀黨參炔苷浸膏加入聚醯胺樹脂 後，用水洗脫聚醯胺樹脂得水洗脫液，洗脫液用D101大孔樹脂富集，再用95% 的乙醇洗脫大孔吸附樹脂上的黨參炔苷，減壓回收除去乙醇，最後得到高純度達 到98.5%的黨參炔苷產品。聚醯胺樹脂可選上海摩速科學器材有限公司的120目 的聚醯胺樹脂。見圖3。 實例3
一種從山西產黨參藥材中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，在58'C條件
下進行以下步驟
A.冷浸提取用黨參乾燥塊根粉與乙醇混合浸泡30小時，冷浸過濾除渣， 所得液體用減壓回收除去乙醇獲得濃浸膏；混合比例是黨參粉體積與乙醇體積比
為l: 3;乙醇濃度為100%，黨參乾燥塊根粉的粒度為100目。
B. 樹脂粗分用水稀釋上步濃浸膏後，在上大孔樹脂之前，用200目左右
的細紗布過濾，以除去沙塵等固體雜質，再通入經過活化處理的大孔吸附樹脂柱，
用70%乙醇洗脫大孔吸附樹脂，將乙醇洗脫液減壓旋轉蒸發除去乙醇；濃浸膏用 水稀釋倍數以3倍水為宜，大孔吸附樹選用D101大孔吸附樹脂，可用安徽三星
樹脂有限公司提供的D101大孔吸附樹脂。洗脫分三步第一步用水洗至幾乎沒
有顏色，除去大部分多糖等大極性雜質，第二步用兩個柱體積的(2BV) 30%乙醇 洗脫，進一步除去雜質而使黨參炔苷保留在樹脂上，第三步用70%乙醇洗脫，黨 參炔苷主要集中在這部分乙醇洗脫液中，得到黨參炔苷粗品，純度為60%左右。 大孔吸附樹脂活化處理的方法同於實例1。
C. 色譜分離本步驟所有步驟和材料同於實例l，僅乙腈-水的流動相中乙 腈佔水的體積比例為20%。
D. 脫色純化本步驟所有步驟和材料同於實例1，所得黨參炔苷精品純度 為98. 5%。
實例4、所有步驟和材料同於實例1，僅是A.冷浸提取中，用100%濃度的 甲醇代替95%濃度的乙醇。
實例5、所有步驟和材料同於實例2，僅是A.冷浸提取中，用100%濃度的 甲醇代替100%濃度的乙醇。
權利要求
1.一種從黨參藥材中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，在25℃--58℃條件下進行以下步驟A.冷浸提取用黨參乾燥塊根粉與乙醇或甲醇混合浸泡24小時-36小時，冷浸過濾除渣，所得液體用減壓回收除去乙醇或甲醇獲得濃浸膏；混合比例是黨參粉體積與乙醇或甲醇體積比為1∶3；乙醇濃度為95％--100％，甲醇濃度為100％；B.樹脂粗分用水稀釋A步驟所得的濃浸膏後，上樣進入經過活化處理的大孔吸附樹脂柱，用50％--70％乙醇洗脫大孔吸附樹脂，將乙醇洗脫液減壓旋轉蒸發除去乙醇，得到黨參炔苷粗品；C.色譜分離將B步驟黨參炔苷粗品用乙腈-水作流動相稀釋後，進樣，分段收集製備色譜儀流出的液體；將純度能達到98％的流出液體即流分濃縮後進行下述D步驟；將純度沒有達到98％的流分重複本步驟；乙腈-水的流動相中乙腈佔水的體積比例為15％-30％；D.脫色純化將上步驟達98％純度的黃色油狀黨參炔苷浸膏加入聚醯胺樹脂後，用水洗脫聚醯胺樹脂得水洗脫液；濃縮水洗脫液的水，最後得到98.5％高純度的黨參炔苷產品。
2、 根據權利要求1所述的從藥材黨參中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，在 B樹脂粗分步驟中，洗脫分三步第一步用水洗至幾乎沒有顏色，除去大部 分多糖等大極性雜質，第二步用30%乙醇洗脫，進一步除去雜質而使黨參炔 苷保留在樹脂上，第三步用50%--70%乙醇洗脫，黨參炔苷主要集中在 50%—70%乙醇洗脫液中。
3、 根據權利要求1所述的從藥材黨參中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，在 B步驟中，大孔吸附樹脂是D131或者D101型大孔吸附樹脂。
4、 根據權利要求1所述的從藥材黨參中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，其 特徵在於在C步驟中，色譜柱裝填的填料用C18 (十八烷基鍵合矽膠)球 形反相填料裝柱，粒徑為10pm-25um,孔徑為100 A，用丙酮稀釋為勻漿後 採用動態軸向壓縮法裝柱。色譜柱規格為25cm*5cm-25cm*30cm。
5、 根據權利要求1所述的從藥材黨參中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，其 特徵在於在D.脫色純化步驟中，所用聚醯胺為120目。 6、根據權利要求1所述的從藥材黨參中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，C和D步驟濃縮產品的方法為減壓回收乙腈後，用D101樹脂富集和用95%的乙醇洗脫後，濃縮除去乙醇。
全文摘要
本發明涉及一種從黨參藥材中快速分離純化黨參炔苷單體的方法。它包括四步驟，1.冷浸提取乙醇或甲醇冷浸；2.樹脂粗分上樣進入經過活化處理的大孔吸附樹脂柱，用水、30％乙醇、50％-70％乙醇分三步分別洗脫吸附有黨參炔苷的大孔樹脂；3.色譜分離用乙腈-水的流動相稀釋樣品後，進樣，分段收集流出液；4.脫色純化上樣到聚醯胺樹脂中，濃縮水洗脫液，回收得98.5％高純度的黨參炔苷產品。本方法簡單快速，溶劑消耗少，經濟環保，且得率高，適合於工業化生產，具有較高的經濟價值和學術價值。
文檔編號C07H15/203GK101177440SQ20071005022
公開日2008年5月14日 申請日期2007年10月12日 優先權日2007年10月12日
發明者丁 劉, 黎 張, 兵 楊, 董維珍 申請人:成都普思生物科技有限公司