一種重組人粒細胞集落刺激因子的純化方法與流程

2023-10-07 21:24:24

本發明涉及的是生物醫藥及生物工程下遊蛋白純化領域，具體涉及一種重組人粒細胞集落刺激因子(recombinanthumangranulocytecolonystimulatingfactor，rhg-csf)的純化方法，本發明操作簡單、時間短，適合於工業化放大生產。
背景技術：
：人粒細胞集落刺激因子(humangranulocytecolonystimulatingfactor，hg-csf)能夠特異地作用於粒系祖細胞，促進其增殖並分化為成熟的中性粒細胞，是調節骨髓中粒系造血細胞的主要細胞因子之一。其對於由癌症化療、急性白血病化療、骨髓增生異常症候群及再生障礙性貧血等疾病引起的中性粒細胞缺乏症和骨髓移植時的中性粒細胞增加等均有明顯的療效。hg-csf的來源是非常有限的，因此，大規模工業化生產均採用基因工程的方法獲得。目前國內外製藥企業大多採用應用廣泛的大腸桿菌系統來表達rhg-csf。由於大腸桿菌細胞內的還原環境不利於二硫鍵的形成，rhg-csf摺疊錯誤，容易聚集，基本以無生物活性的包涵體形式存在於細胞中。包涵體經過變性和復性才能獲得有活性的rhg-csf。目前，專利中對rhg-csf的復性方法報導眾多，研究極為清楚。無論採用哪種復性方法，不可否認，復性後樣品中仍含有大量的宿主細胞蛋白以及產品相關雜質，因此，復性後的純化工藝是決定產品質量合格與否的重要步驟，而一個成功的純化工藝要同時兼顧產品純度、收率、工藝周期、生產成本、可操作性等多方面因素。us5849883、cn1167150、cn1206716、cn1814779等均報導採用多步層析方法搭配，用於純化大腸桿菌重組表達的rhg-csf。如us5849883、cn1206716、cn1814779均同時利用弱陽離子(如，cmsepharose)和弱陰離子(如，deaesepharose)交換層析。在生產工藝中，層析步驟多會大大增加工藝驗證、清洗驗證的工作量，同時增加處理樣品的時間，同時，多步驟處理工藝還會影響蛋白的回收率。因此，開發一步層析方法用於純化rhg-csf具有很好的應用前景。而rhg-csf一步層析純化方法所用填料多涉及強陽離子交換層析(如，sp填料)和弱陽離子交換層析(如，cm填料)。cn1718739a報導了採用spsepharosehighperformance(sphp)直接對rhg-csf復性液純化的方法，在ph5.4的條件下，利用nacl濃度洗脫目的蛋白。但是包涵體復性液中除了目的蛋白外，還含有一定量的宿主蛋白、脂類和脫氧核糖核酸(dna)。sphp填料的粒徑很小，為30μm，一般用於精製純化，不適合用於含有較多雜質、情況複雜的復性液。而且粒徑小使得生產上層析柱的壓力很大，流速變慢，增加工藝操作時間。cn1663962a報導的對復性後的rhg-csf採用spsepharosefastflow(spff)純化的方法：在ph4.0(10mmol/l乙酸-乙酸鈉)的條件下上樣，ph7.0(100mmol/l磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉)洗脫目的蛋白。但是spff對樣品離子強度有要求，一般不超過5ms/cm。其中，樣品復性液中含有較高濃度的尿素，使用中空纖維進行濃縮、稀釋、濃縮等一系列操作，以獲得符合spff上樣要求的樣品。因此，該方法操作繁瑣，增加工藝放大的難度。cn104120109a提供了一種弱陽離子交換層析cmsepharosefastflow(cmff)純化rhg-csf的方法，條件與cn1718739a相似，在ph5.4的條件下上樣，利用nacl濃度洗脫目的蛋白。但是該純化方法的上樣、平衡、洗脫流速均為10cm/h。如此低的流速勢必大大增加工藝的操作時間，可能還會影響蛋白樣品的穩定性。針對上述問題，開發一種能適應於rhg-csf復性液複雜成分、汙染物多、復性液離子強度高等特點，並能夠使得工藝流速大、操作時間短的純化工藝尤為重要。以此為目的，本發明提供了以混合模式填料的陽離子層析柱層析純化復性後rhg-csf，該方法對樣品的適用性強、載量大、收率高，並且操作更簡單、高效。技術實現要素：本發明提供了一種重組人粒細胞集落刺激因子的純化方法，包括：將重組人粒細胞集落刺激因子復性液上樣至以混合模式填料的陽離子層析柱進行純化。其中，所述陽離子交換層析柱的填料為混合模式的陽離子層析填料，選自但不限於captommc填料、hcx填料、bestarosediamondmmc填料和unimsp-30s填料中至少一種，優選captommc填料和hcx填料。進一步而言，該重組人粒細胞集落刺激因子的純化方法先採用緩衝液進行雜質洗脫，再進行洗脫收集樣品峰。所述雜質洗脫所用緩衝液中緩衝劑選自乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、tris、甘氨酸、組氨酸中的一種或多種，所述樣品洗脫所用緩衝液中緩衝劑選自乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、tris、甘氨酸、組氨酸中的一種或多種。所述的雜質洗脫緩衝液離子強度為5～20mmol/l，ph為7.2～7.8，在具體實施例中雜質洗脫緩衝液離子強度可為7、9、11、13、15、17、19mmol/l，ph可選為7.2、7.4、7.6、7.8。所述的洗脫緩衝液離子強度為20～100mmol/l，ph為8.0～9.0其中。在具體實施例中洗脫緩衝液離子強度可為40、55、65、80、90mmol/l，ph可選為8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0。進一步地，本發明所述方法還包括混合模式填料的陽離子層析柱在上樣前經緩衝液平衡步驟，所述平衡緩衝液離子強度為5～50mmol/l，ph為3.0～6.5，具體實施例中ph可選為4.0、4.5、5.0、6.0。通常樣品洗脫存在多種方式，本發明所述樣品洗脫主要採用ph洗脫或鹽離子濃度洗脫方式，為了保證樣品洗脫的效果，優選ph洗脫方式，其中所述ph洗脫方式為利用洗脫液的不同ph值對含蛋白質原液進行常規洗脫程序。進一步而言，本發明所述雜質洗脫緩衝液ph與所述洗脫緩衝液ph數值不相同。進一步地，本發明所述方法還包括將收集得到的純化樣品進行緩衝液置換的步驟，所述緩衝液置換可採用透析、超濾、脫鹽柱層析方式中的一種或多種，所述超濾優選自中空纖維超濾或膜包超濾，更優選自膜包超濾。其中所述置換緩衝液為乙酸鈉緩衝液，呈酸性。若置換後的g-csf原液用於製劑生產，ph為2.0～5.0，優選ph＝3.5～4.5，具體ph可選3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4。若g-csf原液用於後續的修飾反應，製備長效g-csf，ph為3.0～8.0，優選ph＝4.0～7.0，在具體實施例中ph＝4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。其中若採用膜包超濾進行緩衝液置換，超濾條件為：①利用超濾系統對複合型陽離子填料純化後樣品進行適當濃縮；②在超濾系統內保持樣品體積恆定，採用置換液進行置換，使流加的置換液速度與透出液速度相同；③跨膜壓力(tmp)不大於50psi，更優選為10-30psi；④共超濾置換樣品體積的3倍以上，考慮到合理的工藝用時，更優選為5倍體積。所述膜包超濾膜孔徑為1kd～20kd，優選3kd、5kd或10kd，更優選為5kd。所述膜包超濾中膜包材料選自聚偏氟乙烯、改良纖維素、聚醚碸或改良聚醚碸中一種或多種。進一步地，本發明所述方法還包含在上樣前對復性液進行ph調節、過濾步驟。所述蛋白復性液進行ph調節後值為2.0～6.0，優選自3.5～4.5，譬如ph＝3.6、3.8、4.0、4.2、4.4，所用ph調節劑包括但不限於乙酸、檸檬酸、磷酸中的一種或多種。所述過濾可採用中空纖維過濾、膜包過濾或死端過濾方式中的一種或多種，優選死端過濾。其中中空纖維超濾使用的中空纖維管內徑包括但不限於0.5mm，0.75mm，1mm和1.75mm，更優選為1mm；如若採用gehealthcare公司的中空纖維柱進行超濾緩衝液置換，剪切速率應控制在16000sec-1以下，更優選為約8000sec-1。若採用所述死端過濾去除沉澱物，濾膜孔徑為0.22μm，所述死端過濾中濾膜材料為聚偏氟乙烯或是聚四氟乙烯。具體而言，本發明提供了一種重組人粒細胞集落刺激因子的純化方法，包括：a)上樣前對重組人粒細胞集落刺激因子復性液進行ph調節，過濾；b)混合模式填料的陽離子層析柱在上樣前經緩衝液平衡；c)上樣至混合模式填料的陽離子層析柱進行層析純化，先採用緩衝液進行雜質洗脫，再進行洗脫收集樣品峰。d)將收集得到的純化樣品進行緩衝液置換；其中，b)和c)中所述緩衝液中緩衝劑選自乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、tris、甘氨酸、組氨酸中的一種或多種，所述平衡緩衝液離子強度為5-50mmol/l，ph3.0～6.5，所述雜質洗脫緩衝液離子強度為5～20mmol/l，ph為7.0～8.0，所述洗脫緩衝液離子強度為20～100mmol/l，ph為8.0～9.0。所述陽離子交換層析柱的填料為混合模式的陽離子層析填料，選自但不限於captommc填料、hcx填料、bestarosediamondmmc填料和unimsp-30s填料中至少一種，優選captommc填料和hcx填料。其中所述a)步驟過濾可採用中空纖維過濾、膜包過濾或死端過濾方式中的一種或多種，優選死端過濾，所述死端過濾中濾膜材料為聚偏氟乙烯或是聚四氟乙烯，其中孔徑為0.22μm。其中所述a)步驟所用ph調節劑包括但不限於乙酸、鹽酸和磷酸、乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽中一種或多種。其中所述置換緩衝液為乙酸鈉緩衝液，呈酸性。若置換後的g-csf原液用於製劑生產，ph為2.0～5.0，優選ph＝3.5～4.5，具體ph可選3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4。若g-csf原液用於後續的修飾反應，製備長效g-csf，ph為3.0～8.0，優選ph＝4.0～7.0，在具體實施例中ph＝4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。本發明還提供一種製備聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子的方法，包括依據上述所述重組人粒細胞集落刺激因子純化方法，以及將所獲得重組人粒細胞集落刺激因子進行聚乙二醇修飾步驟，其所述聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子的結構如式ⅰ所示其中m選自50-2500的整數，優選自400-500的整數，g為met-g-csf。本發明的有益效果是：(1)復性液調節ph至酸性，使得大量大腸桿菌細胞蛋白沉澱，該步驟簡單有效，容易實現雜蛋白與目的蛋白的分離，為後續的層析純化工藝減輕壓力。(2)複合配基的陽離子交換填料高載量、高流速處理大體積樣品、對復性液的複雜緩衝體系適用性強，大大縮短工藝時間，並且工藝放大的可行性好，成功放大至生產規模。(3)本發明涉及的純化方法，僅包含一步層析，工藝步驟少，純化周期短，易於控制，提高了工藝操作的穩定性。(4)本工藝可獲得高純度、高活性的rhg-csf蛋白原液。經檢測，其sds-page純度達到99％以上，rp-hplc純度達到98％以上，比活性不低於8.0×107iu/mg。這些均高於《中華人民共和國藥典2015版》第三部「重組人粒細胞刺激因子注射液」項下原液檢定的要求。術語解釋：附圖說明圖1：rhg-csf原液的sds-page純度檢測圖譜，其中泳道m：分子量標準蛋白mark12，泳道1：rhg-csf原液。具體實施方式下面結合實施例，對本發明的技術方案進一步闡述，應當理解，所描述的實施例僅用於說明本發明而不是限制本發明的範圍。實施例1製備rhg-csf復性液工藝所用菌株為pbv220/g-csf質粒轉化的大腸桿菌dh5α菌株。發酵後，收集菌體，利用高壓勻質機進行細胞破碎，獲得粗包涵體，再對粗包涵體進行洗滌，獲得初步純化的包涵體。取初步純化的包涵體30g，按照固液比1:20(m/v)的比例用變性液(20mmol/ltris-hcl,5mmol/ledta,8mol/lurea,10mmol/ldtt,ph8.2)進行變性溶解，室溫攪拌15～18小時，獲得變性蛋白液600ml。之後，將該蛋白液進行10μm和0.45μm兩級過濾澄清，再利用5kd中空纖維柱進行緩衝液置換，以去除還原劑dtt，置換過程控制跨膜壓(tmp)為10-18psi，置換緩衝液為20mmol/ltris-hcl,5mmol/ledta,8mol/lurea,ph8.2。獲得置換後的變性蛋白液600ml。將置換後變性蛋白液緩慢加入約15l復性緩衝液(20mmol/ltris-hcl,ph8.2)中，使得蛋白終濃度為0.3g/l，同時加入gssg至終濃度為0.5mmol/l，攪拌30min混勻後，2～25℃靜置復性16～18小時。實施例2rhg-csf的captommc純化將復性後的rhg-csf溶液用0.5mol/l鹽酸調節ph至4.0，靜置10分鐘。使用孔徑為0.22μm的濾芯進行過濾。平衡：以平衡緩衝液(20mmol/l檸檬酸/磷酸氫二鈉，ph4.0)平衡層析柱，流速300cm/小時，直到ph穩定在4.0；上樣：將過濾後復性液樣品上樣，流速300cm/小時；再平衡：上樣結束後，用平衡緩衝液(20mmol/l檸檬酸/磷酸氫二鈉，ph4.0)再次平衡層析柱，流速300cm/小時；洗雜：以10mmol/l檸檬酸/磷酸氫二鈉緩衝液(ph7.5)洗脫雜質，流速180cm/小時；洗脫：以50mmol/l檸檬酸/磷酸氫二鈉緩衝液(ph8.0)洗脫目的蛋白，流速300cm/小時，收集目標蛋白峰。實施例3層析填料的篩選製備rhg-csf復性液的過程如實施例1。為獲得適合rhg-csf復性液純化的層析填料，本研究比較了三種帶有弱陽離子配基的填料純化復性液的能力，純化過程參照實施例2，結果如表1所示。cmff獲得的樣品hplc純度低於混合模式的captommc和hcx，且流速慢，收率低。相比而言，captommc和hcx更能滿足rhg-csf的藥典標準，並適合大規模工業化放大。表1：三種填料對rhg-csf復性液的純化效果比較實施例4captommc雜質和樣品洗脫緩衝液ph的篩選本實施例研究了captommc純化rhg-csf復性液雜質洗脫和樣品洗脫緩衝液ph的可選取範圍。製備rhg-csf復性液的過程如實施例1。本實施例實驗設計與結果如表2所示。雜質洗脫緩衝液可選取的ph為7.2-7.8。雜質洗脫ph在7.0和8.0時，出現未能洗脫雜質或目的蛋白在此步洗脫的問題，影響最終洗脫樣品的純度或收率。同樣，樣品洗脫緩衝液可選取的ph為8.0-9.0。ph低於8.0時(實驗例3)，樣品未能洗脫。表2：雜質和樣品洗脫緩衝液ph對rhg-csf復性液純化的影響實施例5rhg-csf緩衝液的超濾置換選用5kd膜包進行緩衝液置換。平衡：以平衡緩衝液(20mmol/l醋酸鈉，ph4.0)平衡膜包；恆體積置換：captommc柱層析洗脫收集液加入膜包系統。向膜包中連續流加置換緩衝液(20mmol/l醋酸鈉，ph4.0)，控制流加速度與透出端流速相同，保持樣品體積恆定，期間控制跨膜壓為18-22psi，整個過程共連續補加5倍置換緩衝液(20mmol/l醋酸鈉，ph4.0)。實施例6樣品檢測：rhg-csf原液用sds-page、rp-hplc方法進行純度分析。1)sds-page聚丙烯醯胺凝膠：4-12％bis-trisgel,lifetechnologies；樣品緩衝液：ldssamplebuffer(4×),lifetechnologi；電泳緩衝液：mopssdsrunningbuffer(20×),lifetechnologies；染色液：gelcodetmbluesafeproteinstain,thermoscientific；脫色液：純化水，自製。重組人粒細胞刺激因子原液上樣後，150v恆壓電泳使溴酚藍遷移至膠底處。採用考馬斯亮藍快速染色法進行染色，純化水脫色，凝膠成像儀進行純度分析，檢測結果如說明書附圖1所示。從分析結果可知，最終獲得的rhg-csf原液的sds-page純度為99.2％。2)rp-hplc色譜柱：shiseidocapcellpakc18sg3005μm150mm×4.6mm；a相：三氟乙酸－水溶液(取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混勻)；b相：三氟乙酸－乙腈溶液(取1.0ml三氟乙酸加入色譜純乙腈至1000ml，充分混勻)；表3：室溫條件下，按下表進行梯度洗脫，檢測波長280nm時間(min)a(％)b(％)01000153070253070261000採用rp-hplc法進行rhg-csf原液純度檢測，分析檢測結果，最終獲得的rhg-csf原液的純度為99.21％。3)sec-hplc色譜柱：親水矽膠分子篩柱(tsk-gelg3000swxl7.8×300mm，5μm,250a)；流動相：50mm碳酸氫銨，ph＝7.0；波長：215nm；柱溫：25℃；流速：0.5ml/min；採用sec-hplc法進行rhg-csf原液純度檢測，分析檢測結果，rhg-csf原液的純度為99.32％。4)活性測定以重組人粒細胞集落刺激因子活性測定國家標準品為活性標準品。取標準品和本發明獲得的rhg-csf原液，在96孔細胞培養板中，用基礎培養基稀釋至1.0ng/ml，再進行2倍梯度稀釋。取培養的nfs-60細胞株，用rpm1640培養液洗滌3遍，在第三遍離心前取細胞懸液用於細胞計數。計數後，用基礎培養液將細胞重懸，配製成2.0×105細胞/ml。在每孔50μl標準品/rhg-csf原液中加入50μl細胞懸液，37℃，5％co2條件下培養40-48小時。然後，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)，37℃，5％co2條件下培養約5小時，每孔再加入100μl裂解液，混勻後利用酶標儀比色，測定波長/參比波長為570nm/630nm。計算獲得rhg-csf原液的比活性。採用nfs-60細胞/mtt比色法測定rhg-csf原液的生物學活性，計算獲得比活性為9.0×107iu/mg。當前第1頁12