一株沙雷氏菌（Serratia）菌株及其粗毒素的高效除草活性的製作方法

2023-10-17 01:08:24 2

一株沙雷氏菌（Serratia）菌株及其粗毒素的高效除草活性的製作方法
【專利摘要】本發明公開一種沙雷氏菌（Serratia）菌株（編號Ha1），及其粗毒素的高效除草活性，屬於微生物應用於農業植物保護領域。此菌株的粗毒素對馬唐、反枝莧、稗草、狗尾草、虎尾草等雜草均有一定的抑制效果，尤其是對雜草馬唐的抑制效果最佳，IC50為1.158mg·mL-1，具有安全環保，對農作物無害等優點。
【專利說明】-株沙雷氏菌ai/a)菌株及其粗毒素的高效除草活 性

【技術領域】
[0001] 本發明公布一株沙雷氏菌(ferraiia)菌株(編號Hal)及其次生代謝產物用於防 控農業雜草的方法，屬於微生物應用於農業植物保護領域。

【背景技術】
[0002] 雜草是危害農田的主要有害生物之一，每年由於草害引起的農作物的產量、品質 的損失達10%左右，而化學除草是目前常用的雜草防治方法，但其長期使用，雜草的抗藥 性、水體土壤汙染、殘留不易降解等弊端日益突出。開發研製無汙染、安全、新型環境友好的 除草劑已成為當務之急。生物除草劑具有對目標雜草以外的植物影響小、環境負效應小、安 全性高的特點而備受人們的青睞，尤其是微生物除草劑以其開發周期短、成本低而越來越 顯示出獨特的優勢。次生代謝產物除草劑具有結構新穎、相對於活體製劑更易保存、多靶標 作用位點、環境中易於降解、廣譜等優點。
[0003] 近年來從自然界篩選具有除草活性的植物病原細菌，成為微生物除草劑開發研 究的熱點。已發現的具有除草效果的細菌主要包括：假單胞菌屬歐文 氏菌屬(AnWa )，黃桿菌屬(/^/a raAac ieria? )，朽1樣酸桿菌屬（CY iroAac ier )，無色杆 菌屬辦ac ier )，腸桿菌屬(/? ieroAac ier )，產喊桿菌屬)等。其 中假單胞菌屬有Zidack等發現丁香假單胞菌菜豆致病變種sjriflgae /7K pAaseo/ico/a )能使心葉片黃枯，局部壞死；Kenedy等報導突光假單胞菌(/^ 菌株可抑制旱雀麥C5ro皿)的生長；美國Banowetz等發現五株 突光假單胞菌0°. /%/〇Τ--5·----/75·)能夠產生一種抑制早熟禾種子萌發物質。
[0004] 近幾年海洋微生物已成為國內外新型藥物研究的新方向。海洋微生物資源極其豐 富，因其又處於高壓、高鹽、寡營養、缺氧、少光、低溫等特點的海洋環境中，其代謝途徑明顯 與陸生微生物不同，可能產生大量的結構新穎、活性很強的新型農用化合物。目前從海洋細 菌中發現除草活性物質的研究報導較少，也未見沙雷氏菌(ferraiia)次級代謝產物用做除 草劑的相關文獻報導。
[0005] 本發明公開一種沙雷氏菌(ferraiia)菌株(編號Hal)，及其粗毒素的高效除草 活性，屬於微生物應用於農業植物保護領域。此菌株的粗毒素對馬唐、反枝莧、稗草、 狗尾草、虎尾草等雜草均有一定的抑制效果，尤其是對雜草馬唐的抑制效果最佳，IC 5(1為 1158mg · ΙΛ具有安全，環保，對農作物無害等優點。


【發明內容】

[0006] -株沙雷氏菌菌株 編號Hal，（保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2013年 03月20日，保藏編號：CGMCC No. 7340,地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)。此菌株 由河北秦皇島市渤海海水中分離得到，經生理生化實驗和16S rDNA序列比對鑑定為沙雷氏 菌(5ferraiia)。此菌株形態為菌體直杆狀，端圓，直徑0.5?0·8μηι，長0.9?2.0 μπι，無 鞭毛，革蘭氏染色為陽性，吲哚陽性，接觸酶反應強陽性，發酵D-葡萄糖和其他糖類產酸， 產氣。硝酸鹽還原陽性，適宜生長溫度35- 37°C，可產生水溶性色素，糖酵解實驗為氧化發 酵型，過氧化氫實驗為陽性。首次發現此菌株產生的粗毒素對馬唐、反枝莧、稗草、狗尾草、 虎尾草等雜草均有一定的抑制效果，相同濃度粗毒素施用於玉米、小麥、大豆、高粱植株均 未見明顯藥害。Hal菌株粗毒素具體除草效果見【具體實施方式】。
[0007] 沙雷氏菌Hal菌株粗毒素的製備方法 (1)種子液製備，LB培養基配方：酵母浸粉一5g，蛋白腖一10g，NaCl -10g，蒸饋水 1000mL，調pH至7. (Γ7. 5 ;固體LB培養基在上述配方基礎上添加瓊脂一 10g/L。
[0008] 將按上述配方配製好的培養基倒入250mL三角瓶，每瓶100mL，121 °C高壓 滅菌20min，冷卻後在超淨臺內，無菌操作條件下，將保存在-80 °C甘油中的沙雷氏菌 (ferraiia)(編號Hal)劃線接種於平板培養基上，36h後取一環菌體接種於LB液體培養基 裡，轉速150 rpm的搖床中37°C振蕩培養24h，即為種子液； (2 )發酵罐發酵，發酵罐培養液配方：酵母浸粉一 5g，蛋白腖一 10g，NaCl - 10g，蒸餾水 1000mL，調pH至7. (Γ7. 5 ;50L發酵罐按70%裝上述培養基，裝料後在120°C，0. 12MPa下滅 菌30分鐘。冷卻至30°C左右後按3%的接種量接種製備好的種子液；培養溫度35°C，通氣 量 1:1 (v/v · min)，發酵 96h 完畢； (3)將發酵液用等體積的乙酸乙酯萃取24h，萃取3次，期間不斷震蕩使其充分萃取，之 後分液得到乙酸乙酯相，減壓濃縮至幹，得到的棕黃色晶膏狀物質即為粗毒素。
【權利要求】
1. 一株沙雷氏菌（Serratia)菌株，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心，保藏日期2013年03月20日，保藏編號：CGMCC No. 7340,地址：北京市朝陽區北辰 西路1號院3號。
2. 權利要求1所述沙雷氏菌（Serratia)菌株(編號Hal)，其特徵在於：此菌株的粗毒 素對馬唐、反枝莧、稗草、狗尾草、虎尾草等雜草均有一定的抑制效果。
3. 權利要求1所述的沙雷氏菌（Serratia)菌株(編號Hal)粗毒素的製備方法：（1)種 子液製備，LB培養基配方：酵母浸粉5g，蛋白腖一10g, NaCl一10g，蒸饋水lOOOmL，調pH至
7. (Γ7. 5 ;固體LB培養基在上述配方基礎上添加瓊脂一 10g/L ;將按上述配方配製好的培養 基倒入250mL三角瓶，每瓶100mL，121 °C高壓滅菌20min，冷卻後在超淨臺內，無菌操作條件 下，將保存在_80°C甘油中的沙雷氏菌（Serratia) (Hal菌株）劃線接種於平板培養基上， 36h後取一環菌體接種於LB液體培養基裡，轉速150 rpm的搖床中37°C振蕩培養24h，即為 種子液；（2)發酵罐發酵，發酵罐培養液配方：酵母浸粉一5g，蛋白腖一 10g，NaCl - 10g，蒸 餾水1000mL，調pH至7. (Γ7. 5 ;50L發酵罐按70%裝上述培養基，裝料後在120°C，0. 12MPa 下滅菌30分鐘；冷卻至30°C左右後按3%的接種量接種製備好的種子液；培養溫度35°C， 通氣量1:1 (v/v · min)，發酵96h完畢；（3)將發酵液用等體積的乙酸乙酯萃取24h，萃取3 次，期間不斷震蕩使其充分萃取，之後分液得到乙酸乙酯相，減壓濃縮至幹，得到的棕黃色 晶膏狀物質即為粗毒素。
【文檔編號】C12P1/04GK104152364SQ201310174375
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月13日 優先權日:2013年5月13日
【發明者】楊娟, 張利輝, 安鑫龍, 董金皋 申請人:河北農業大學