阿爾茨海默病動物模型的製備方法
2023-10-16 21:53:44 1
專利名稱：阿爾茨海默病動物模型的製備方法
技術領域：
本發明涉及阿爾茨海默病動物模型建立技術領域，具體涉及用於分析阿爾茨海默病病理及阿爾茨海默病藥物篩選的動物模型的製備方法。
背景技術：
阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease,AD)是一種常見的中樞神經系統退行性疾病，表現為進行性的記憶和認知功能的下降，行為異常和社交障礙。隨著社會人口的老齡化，AD的發病率呈不斷上升趨勢，已成為危及老年人生命的第四大病因(僅次於心臟病、腫瘤和中風)，成為當前老年醫學所面臨的最為嚴峻的問題之一。有資料顯示，預計到2050 年，我國65歲及以上老人約佔總人口的35%，80歲及以上老人約為22%，而AD患者預期可達到2500萬，將成為影響家庭和社會發展的一個重要制約因素。AD特徵性病理學改變為腦神經細胞外出現β -澱粉樣蛋白(β -amyloid，Ai3)聚集形成的老年斑，腦神經細胞內tau蛋白異常聚集形成的神經原纖維纏結，腦皮質細胞有不同程度的減少以及星形膠質細胞的增生及肥大，並且腦內有大量的Αβ的沉積。Αβ是由一個比較大的前體蛋白即澱粉樣蛋白前體(amyloid β -precursor protein, APP)水解得到的，目前認為，Αβ是各種原因誘發AD的共同通路，是AD形成和發展的關鍵因素。AD病因有遺傳因素、免疫功能改變、炎症作用、鋁中毒、雌激素水平、細胞骨架改變和神經遞質改變等內在原因，外部因素包括年齡因素、血管性因素、膽固醇、病毒感染、職業、教育水平、吸菸、頭部外傷、用腦減少等，其中有些外部因素作為AD患者的危險因素，爭議較多有待於進一步研究。總之，AD的發病機制十分複雜，可能與多種因素有關，概括地說是內在原因和外在因素相互作用的結果。目前還沒有針對AD治療的特效藥。AD研究進展緩慢的一個主要原因在於沒有一個合適的動物模型來再現各種病理特徵及評價各種治療方法的有效性。目前建立AD模型的方法很多，但由於AD的發病機制和病變過程複雜，但尚無能夠全力再現、模擬AD病理、生化、行為等方面全部特徵的動物模型。所以，良好的AD動物模型的出現，將會對AD的研究和藥物開發有著跨時代的意義。
發明內容
技術問題本發明的目的是提供一種構建阿爾茨海默病動物模型的製備方法，該方法模擬人類阿爾茨海默病的發病過程，所製備的動物模型出現腦內APP表達上升，Αβ生成增多的典型症狀，能適合於阿爾茨海默病病理研究和進行藥物篩選。技術方案阿爾茨海默病動物模型的製備方法，製備步驟為設計以動物腦abcg4 為靶基因的siRNA，其特異的siRNA的靶序列為GTGAGAAGCAAGAGGTGAA，用PBS溶解；選健康動物，用腦定位儀以240 μ g/kg體重的劑量(指每公斤體重siRNA的有效劑量)向動物側腦室內一次性注射siRNA，4 後得到動物模型。所述PBS 配方為 NaCl 137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HPO4 4. 3mmol/L, KH2PO4
31. 4mmol/L ρΗ7· 2 7· 4。本發明方法的特點為SiRNA幹涉腦中abcg4基因的表達，進而引發腦中APP表達增強，Αβ生成增多，從而製備得到阿爾茨海默病動物模型。本發明公開的建立阿爾茨海默病動物模型的方法，具有製作方便，成本相對便宜，重複性好的優點，模型成功可靠。所得的動物模型可用於分析阿爾茨海默病發病機理及進行治療該病藥物篩選。上述方法所得到的動物模型的驗證方法包括觀察動物行為變化；半定量RT-PCR 測定abcg4和APP基因表達變化，免疫印跡(Western Blot)測定APP和Αβ蛋白變化。RT-PCR的試驗方法為分別取模型組和正常組腦lOOmg，抽提總RNA。每個樣品總 RNAl μ g進行反轉錄為cDNA，再以反轉錄所得cDNA體積的1/10為模板，用abcg4、APP基因特異引物擴增，觀察abcg4基因的幹涉效果及對APP基因表達的影響。試驗結果表明，模型組動物行為遲緩，出現痴呆表象，RT-PCR、Western blot試驗中顯示APP基因表達、APP蛋白和Αβ蛋白水平明顯高於正常組，從而驗證了本發明在小鼠中成功建立了阿爾茨海默病動物模型。有益效果本發明方法製備動物模型時間短，對試驗動物損傷不大。本發明採用腦定位儀，將 abcg4-siRNA準確注射到動物側腦室內，注射量少，致死率低，增加阿爾茨海默病的出現概率。本發明方法從AD病理過程中的APP上遊操作，所製備的動物模型具有與人類阿爾茨海默病發病相似的過程，具有典型的阿爾茨海默病症狀，因而是研究阿爾茨海默病發病機理及進行藥物篩選的理想模型，具有良好的應用前景。
圖1為特異的abcg4-siRNA注射對鼠腦abcg4基因表達的抑制及對APP表達的增強；從附圖中可以看到對於注射PBS的空白對照組，以及注射siRNA的36小時、48小時組， 作為內參基因的GAPDH的表達在各組中很接近，但Abcg4作為siRNA幹涉的靶基因，其表達在注射含siRNA的兩個處理組中均(比對照)受到了顯著抑制；而作為澱粉樣蛋白前體的 APP的表達在兩個處理組中比對照明顯增強。該研究揭示了基因Abcg4與阿爾茨海默氏病可能存在較大的相關性，可為今後新的防治阿爾茨海默氏病的藥物設計提供思路。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。所測得的昆明小鼠腦的abcg4基因的序列為ATGGCGGAGAAGGCATTGGAGGCCGTGGGC TGTGGACTGGGCCCTGGGGCTGTGGCCATGGCTGTGACACTGGAGGACGGGGCAGAGCCCCCTGTGCTGACCACGCA CCTAAAGAAGGTGGAGAACCATATCACAGAAGCACAGCGCTTCTCTCACCTGCCCAAGCGCTCTGCTGTGGACATCG AGTTCGTGGAACTGTCCTATTCCGTGCGGGAGGGGCCCTGCTGGCGCAAACGGGGTTACAAGACCCTCCTCAAGTGC CTGTCTGGTAAGTTCTGTCGCCGAGAGCTGATTGGCATCATGGGCCCCTCTGGGGCTGGCAAGTCCACATTCATGAA CATCTTGGCAGGGTACAGGGAGTCGGGGATGAAGGGGCAGATCCTGGTTAACGGGAGGCCGCGCGAGCTGAGGACCTTCCGCAAGATGTCCTGCTACATCATGCAGGATGACATGCTACTGCCTCACCTCACAGTCCTGGAGGCCATGATGGTC TCTGCCAACCTGAAGCTGAGTGAGAAGCAAGAGGTGAAGAAGGAACTGGTGACAGAGATCCTGACAGCCCTGGGACT GATGTCCTGCTCTCACACGAGGACAGCTCTGCTCTCTGGAGGGCAGAGGAAGCGCCTGGCCATTGCTCTGGAACTGG TCAACAACCCGCCTGTCATGTTCTTTGATGAGCCTACCAGCGGTCTAGACAGCGCTTCTTGTTTCCAAGTGGTGTCC CTCATGAAGTCCCTGGCCCATGGGGGCCGCACCGTCATCTGCACCATCCACCAGCCCAGTGCCAAGCTCTTTGAGAT GTTTGACAAGCTCTACATCCTGAGCCAGGGGCAATGCATCTTCAAGGGCGTGGTTACCAACCTGATTCCCTATCTGA AGGGGCTTGGCTTGCACTGTCCCACCTACCACAACCCCGCTGACTTCATCATTGAGGTGGCCTCTGGAGAGTATGGA GACCTGAACCCCACGCTGTTCAGGGCTGTGCAGAATGGCCTTTGCACCATGGCCGAGAAGAAGAGCAGCCCTGGGAA GAATGAGCTCCCTGCCCACTGCCCCACTTGCCCTCCGGAGCTGGATCCTATTGAAAGCCACACATTTGCCACCAGCA CCCTAACCCAGTTCTGCATCCTCTTCAGGAGGACTTTCTTGTCCATCCTCAGGGACACGGTCCTGACCCACCTGCGG TTCATGTCACATGTGTTGATCGGCGTCCTCATTGGCCTCCTCTACCTGCACATTGGCGATGATGCCAGCAAAGTCTT CAACAACACCGGCTTCCTCTTCTTTTCCATGCTCTTCCTCATGTTTGCAGCCCTCATGCCGACCGTGCTCACCTTTC CCTTAGAGATGGCGGTCTTCATGAGGGAGCACTTGAACTACTGGTATACTCTCAAAGCCTATTACTTGGCCAAGACC ATGGCTGATGTGCCCTTCCAGGTGGTATGCCCAGTGGTGTACTGCAGCATCGTGTACTGGATGACAGGCCAGCCAGC CGAGACCAGCCGCTTCCTGCTCTTCTCAGCCTTGGCCATAGCCACCGCCTTAGTTGCCCAGTCTTTGGGACTCTTGA TTGGCGCTGCCTCTACCTCCTTGCAGGTGGCCACTTTTGTGGGCCCAGTGACTGCCATCCCTGTCCTCTTGTTCTCC GGCTTCTTCGTCAGTTTCAAGACCATCCCCACTTACTTGCAATGGAGCTCCTACCTCTCCTATGTTAGGTATGGCTT TGAGGGTCCGATCCTGACCATCTATGGTATGGAGCGAGGACACCTGACCTGCTTAGATGAACAGTGCCCATTCCGGG ACCCACAAATCATTTTGCGTGAGCTGGATGTAGAGGAGGCCAAACTCTACATGGACTTCCTGGTCCTGGGCATTTTC TTCCTTGCCCTGCGGCTGCTGGCATACCTTGTGCTCCGGTACCGGGTCAAGTCTGAGAGATAG我們針對上述測序所得序列設計siRNA。實施例11、試驗材料11、實驗動物清潔級昆明小白鼠，雌性，25_30g，從江蘇大學動物實驗中心購得。 動物隨機分為模型組和正常組，其中模型組30隻，正常對照組10隻。實驗動物採用分籠飼養，每籠5隻。12、基礎飼料大小鼠飼料(江蘇大學提供)1. 3、試劑與儀器abcg4-siRNA 根據NCBI上登錄的小鼠abcg4基因序列(NM-138955. 3)設計引物，克隆出abcg4基因並測序，根據測序結果，由廣州銳博生物公司合成siRNA (經試驗，合成的昆明小鼠abcg4-siRNA的特異靶序列為GTGAGAAGCAAGAGGTGAA) ；PB S緩衝液(NaCl 137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HPO4 4. 3mmol/L, KH2PO4 1. 4mmol/L ρΗ7· 2 7· 4) ；Total RNA提取試劑，RT-PCR試劑盒均購自TaKaRa ；APP抗體，A β多克隆抗體購自南京金斯瑞生物公司；核酸、蛋白電泳儀均購自BIO-RAD2、試驗方法2. 1、小鼠處理模型組小鼠，以240μ g/kg體重siRNA的有效劑量側腦室注射 abcg4-siRNA(溶於PBS)。側腦室注射方法小鼠用10%水合氯醛(350mg/kg，IP)腹腔注射麻醉，俯臥位，固定於腦立體定位儀，取右側側腦室進行穿刺，穿刺位置以前因為圓點， 向後2. 2mm,向右旁開1. 5mm，深1. 3mm。牙科鑽顱骨鑽孔，用細穿刺針進行穿刺，至回吸有腦脊液吸出，注射後留針5min，拔出穿刺針。所有動物在操作後Mh，麻醉甦醒，能夠自由活動和進食者，進入下一步試驗。2. 2、RT-PCR 注射後48小時，模型組和正常對照組各取5隻，頸椎脫臼致死，取腦組織lOOmg，參照TaKaRa公司的"Total RNA提取試劑說明書，分別加入Total RNA提取試劑在組織研磨器中充分勻漿，轉至1. 5mL的Eppendorf管中，室溫靜置5min，加入200 μ L 氯仿，劇烈震蕩1 後室溫靜置5min分層，4°C 12000g離心15min，取上層水相於一新的 Eppendorf管中，加入400 μ L異丙醇，混勻後靜置10min，4°C 12000g離lOmin，棄上清，沉澱用ImL的75%乙醇洗滌後室溫乾燥，適量DEPC水溶解用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的提取質量，並用紫外分光光度計測定總RNA濃度和純度根據樣品在260nm波長處的吸光度值確定RNA樣品的濃度，以便在反轉錄的過程中進行定量。cDNA第一條鏈合成，用TaKaRa 公司的M-MLV反轉錄酶將總RNA反轉錄為cDNA具體過程如下取每個樣品總RNA 1 μ g， oligo(dT)lyL，加入DEPC水至6ul，PCR儀上70°C反應lOmin，迅速置於冰上冷卻，加入 5X 反應緩衝液 5 μ L，dNTP(10mmol/L) 1. 25ul, RNA 酶抑制劑 25u, M-MLV 反轉錄酶(200U/ μ L) 1 μ L，用DEPC水補至總體積為20 μ L(以上操作均在冰上進行)稍離心後置於水浴鍋上反應，42°C保溫60min，7(TC滅活15min，將所得cDNA產物置於_20°C保存每個樣品都以反轉錄所得cDNA體積的1/10為模板，用小鼠abcg4基因特異引物擴增(擴增基因部分片段，503bp)，比較不同組織中abcg4基因的表達量PCR擴增abcg4基因特異引物序列如下abcg4-F，5，-CCCCACGCTGTTCAGGGCTG-3『 ；abcg4_R，5，-TGCTGCAGTACACCACTGGGC-3，； APP-F, 5，-TGGACGGTTCGGGCTCTGGA-3，；APP-R, 5，-ACTTGTCGATGCCGCAGGGC-3，。同時以小鼠 GAPDH 基因作為內參照，引物序列如下GAPDH-F，5，-AAATGGGGTGAGGCCGGTGC-3，；GAPDH-R, 5，-TCTCCAGGCGGCACGTCAGA-3，以上 PCR 擴增條件為 94 "C 4min，94 "C 30S，58 "C 30S, 72°C 60S, 30個循環，72°C IOmin擴增產物經1. 0%瓊脂糖凝膠電泳並拍照。3、試驗結果3. 1、模型組小鼠行為上較正常對照組動作遲緩。3. 2、核酸凝膠電泳結果，模型組小鼠abcg4基因明顯被幹涉，APP基因表達增強， 而正常對照組abcg4與APP基因表達保持穩定。
權利要求
1.阿爾茨海默病動物模型的製備方法，其特徵在於製備步驟為a.設計以動物腦abcg4為靶基因的siRNA，其靶序列為GTGAGAAGCAAGAGGTGAA，用PB S溶解；b.選健康動物，用腦定位儀以240μ g/kg體重的劑量向動物側腦室內一次性注射 siRNA, 48h後得到動物模型。
2.根據權利要求1所述的阿爾茨海默病動物模型的製備方法，其特徵在於所述PBS配方為 NaCl 137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HPO4 4. 3mmol/L, KH2PO4 1. 4mmol/L ρΗ7· 2 7. 4。
全文摘要
阿爾茨海默病動物模型的製備方法，製備步驟為設計以動物腦abcg4為靶基因的siRNA，(經試驗)其特異的能干涉abcg4表達的siRNA的靶序列為GTGAGAAGCAAGAGGTGAA，用PBS溶解；選健康動物，用腦定位儀以240μg/kg體重的劑量向動物側腦室內一次性注射siRNA，48h後得到動物模型。本發明方法製備動物模型時間短，對試驗動物損傷不大。
文檔編號A01K67/027GK102191274SQ20111008539
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月7日 優先權日2011年4月7日
發明者吳金美, 慄鳳鵬, 王雪芳 申請人:江蘇科技大學