一種p型atp酶基因突變的檢測方法

2023-09-23 03:59:05

專利名稱：一種p型atp酶基因突變的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種P型ATP酶基因突變的檢測方法，屬於分子生物學技術領域。
背景技術：
P型ATP酶(ATP7Base，ATP7B)基因定位於13ql4. 3，全長約80kb，含有21個外顯子和20個內含子，其cDNA編碼一種由1411個胺基酸組成的P型銅轉運ATP酶。該酶主要分布在肝、腎和胎盤，而少見於心、腦、肺和肌肉等組織，其主要生物學功能是在高爾基體內接受銅伴侶蛋白傳遞的銅，合成銅藍蛋白，另外可以在高銅環境下重新定位，攜帶所結合的銅促使其從膽汁中排出。 目前，國內外已發現ATP7B基因突變200餘種，這些突變位點幾乎分布於ATP7B基因的各個外顯子，甚至有的還分布在內含子或剪接區內，突變類型包括錯義突變、無義突變、缺失和插入等，ATP7B的突變方式多種多樣，但主要以點突變為主，且多累及ATP酶功能區，而不是金屬離子結合區。並且在不同地域人群中所發現的熱點突變區明顯不同。1995年Thomas等報導了 3例中國香港人ATP7B患者，他們的ATP7B基因上都存在R778L(exon8)純合突變，這是有關中國人該病基因外顯子突變類型的首次報導。1996年臺灣學者Chuang等報導在臺灣ATP7B患者中檢測到了該位點的兩種突變R778L和R778Q，突變率分別為11.4%和9. 1%。上海劉曉青等報導R778L突變頻率為47. 2X，未發現R778Q突變。Ye等對中國東部50例ATP7B患者研究後指出，R778L突變頻率高達60 % 。進一步研究表明，我國ATP7B與白種人的外顯子突變特點有明顯差異，第8號外顯子R778L突變是中國人群的高頻突變點，其突變頻率為11.4% 60%。 Park等檢測了 120例韓國ATP7B患者，R778L突變頻率達39. 2%，同時日本研究結果也表明R778L是高頻突變點。8號外顯子位於ATP7B蛋白的跨膜功能區，該位點的突變可引起蛋白的1級和2級結構改變，導致銅轉運在細胞膜上停滯。12號外顯子的T935M突變也是我國肝豆狀核變性基因突變熱點，在吳志英等對44例肝豆狀核變性患者的研究中指出，18. 1%的患者在12號外顯子上檢測到突變，其中T935M突變佔6. 8%， G943D佔2. 3%，此2種突變國外均未見報導。 現有檢測ATP7B基因突變的方法主要是限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)和單鏈構象多態性(PCR-SSCP) 。 PCR-RFLP是利用多種限制性內切酶對基因擴增產物進行酶切，不同的片斷將產生不同的電泳圖譜，但這種方法只能用於檢測單一位點，且這個位點必須恰好是可以酶切的，存在一定局限性。PCR-SSCP是根據單鏈DNA分子在中性聚丙醯胺凝膠中電泳時由於不同的立體構象造成不同的泳動速率，產生不同的條帶來判斷突變的存在，但此法只能檢測基因變異的存在，而不能確定突變的部位和內容。

發明內容
本發明的目的是提供一種簡單易行、檢出率與可重複性高的P型ATP酶基因突變的檢測方法。 為了實現以上目的，本發明的技術方案是提供一種P型ATP酶基因突變的檢測方
4法，其特徵在於，具體步驟為 步驟1.採集被測者口腔黏膜樣本 用採樣拭刮被測者口腔中左右兩腮各20次，以採集口腔黏膜上皮細胞樣本；
步驟2.基因組DNA的抽提方法 採用矽膠吸附法抽提被測者口腔黏膜上皮細胞樣本的基因組DNA，抽提時間為2-3小時，採用電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，肉眼可見清晰白色條帶即進入下一步檢測； 步驟3.基因分型 將每一個被測者樣本分別放入2個反應孔，2個反應孔分別檢測ATP7B基因8號以及12號外顯子突變情況，採用PCR技術進行擴增、凝膠電泳技術檢測純度、測序技術對這些位點確定基因型
步驟3-1 ，反應體系配置 在每一個反應孔中加入PCR標準反應體系，標準反應體系的引物濃度為10uM，反
應體系總體積為20ul，其中，PCR試劑5ul，正向引物和反向引物各0. 4ul，20ng/iU的步驟
2得到的DNA模板3 ii 1，去離子水11. 2ul ; ATP7B基因第8外顯子正向和反向引物如下 正向弓l物ctcttggtcatccattcctg 反向弓l物catggtgttcagaggaagtgag ATP7B基因第12外顯子正向和反向引物如下 正向弓l物actggtggaagaggctcaga 反向弓l物cctgcagaaggagagtgactg 步驟3-2 ， PCR反應條件 將反應孔在PCR擴增儀上進行反應，反應條件為95t:預熱15分鐘；再進行35個循環的95°C、45秒；60。C、45秒；72。C、60秒；72。C、7分鐘後降溫至4°C ;
步驟3-3，將反應孔在PCR擴增儀反應後的產物進行電泳檢測，肉眼可見清晰白色條帶即進入下一步 a. 1 %瓊脂糖凝膠插小號孔梳子；
b. 2000bpDNA標記物6ul ; c.步驟3-2的PCR產物4ul加入電泳緩衝液lul ;
d.電泳電壓:120v ; e.電泳時間20min拍攝一張電泳圖；30min拍攝一張電泳 步驟3-4，純化 在每一個反應孔中加入反應體系，反應體系總體積為7ul，由去離子水ddH203. 825ul、PCR產物純化試劑SAP 0. 05ul、PCR產物純化試劑EX0N10. 125ul、步驟3-3的PCR產物3ul ;終濃度:PCR產物純化試劑O. 2U SAP 7ul，PCR產物純化試劑2. 5U EX0Nl/7ul ;反應條件為37°C、60min ;8(TC、15min ;所得產物4t:恆溫保存； 步驟3-5，將純化後的每一個反應孔進行測序，引物濃度為luM，ABI 3730測序儀；
步驟3-5-1，從4t:冰箱中取出步驟3-4的PCR純化產物、測序試劑BigDye、四種dNTP、luM測序引物，8號以及12號外顯子測序引物分別為:ctcttggtcatccattcctg ;
5actggtggaagaggctcaga ; 步驟3-5-2，記錄日期、所作反應的PCR純化產物名、所用引物、反應體系、測序試劑用量、PCR反應條件； 步驟3-5-3，取一塊反應板，標上模板名、測序引物名、日期；
步驟3-5-4，每個樣本需做兩個PCR反應，用一個反應孔； 步驟3-5-5，在每一個反應孔中加入反應體系，反應體系為0. 5ul的BigDye、 1. 4ul的dNTP、2ul的測序引物、3ul的PCR純化產物、0. lul的去離子水ddH20 ;體系分裝好後，上離心機，達900轉/分即停; 步驟3-5-6，將反應板放在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為預熱96°C， 10秒；再進行25個循環的96°C、10秒；5(TC、5秒；6(TC、4分鐘；6(TC、4分鐘後降溫至4t:恆溫保存； 步驟3-5-7，擴增結束後，在每孔加入lul 125mM乙二胺四乙酸EDTA ; 步驟3-5-8，再在每孔加入無水乙醇15ul於室溫進行沉澱，不得超過24小時； 步驟3-5-9，將96孔板放入冰凍離心機，3650轉/分，4。C離心30分鐘； 步驟3-5-10，倒去上清液，將96孔板離心，達800轉即停，再在每孔加30ul 70%
乙醇，3650轉/分，4t:離心15分鐘，倒去上清液，將96孔板離心，達800轉即停，將殘餘乙
醇風乾，室溫放置20分鐘； 步驟3-5-11，每孔加入8ul重量比為15 : 1的95%甲醯胺與ddH20混合物；
步驟3-5-12，在ABI 3730測序儀上進行結果讀取，用軟體Chromas查閱測序檢測結果第8以及第12外顯子都2類結果，即正常結果和突變結果；
步驟4，結果分析 1.未檢出突變您的檢測結果中未發現ATP7B基因第8以及第12號外顯子上存在突變； 2.檢出突變您的檢測結果中發現ATP7B基因第8或第12號外顯子上存在突變。
本發明應用的直接測序方法可以對PCR產物直接進行DNA序列分析，明確突變位點，是現有基因突變檢測方法中最直接最準確的方法，且可以實現機械化自動化，使測序工作更加簡便快捷。本發明對ATP7B基因第8以及第12號外顯子上進行檢測，相應位點特異性引物的設計以及用於序列測定的實驗方案、試劑以及報告生成系統，通過同時檢測分析個體的ATP7B基因第8以及第12號外顯子上是否存在突變來提供一種P型ATP酶基因突變的檢測方法。採集樣本的類型為口腔黏膜上皮細胞，採用矽膠吸附法抽提DNA具有所需樣品量少，抽提質量穩定，抽提產物純度高，操作簡便的特點。 利用本發明對超過100例以上中國人群樣本的檢測結果顯示，根據上述方法進行的ATP7B基因第8以及第12號外顯子上基因型檢測檢出率可達99%以上，結果可重複性達到100%。 本發明的優點是簡單易行、可重複性高，適合於早期診斷、產前篩查肝豆狀核變性。


圖1為7個樣本第8外顯子PCR後產物的電泳結果 圖2為7個樣本第12外顯子PCR後產物的電泳結果圖； 圖3為ATP7B基因第8號外顯子實驗無突變結果示意圖； 圖4為ATP7B基因第8號外顯子實驗有突變結果示意圖； 圖5為ATP7B基因第12號外顯子實驗無突變結果示意圖； 圖6為ATP7B基因第12號外顯子實驗有突變結果示意圖； 圖7為實施例被測者定位ATP7B基因第8號外顯子R778L突變結果示意圖。
具體實施例方式
以下結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
實施例 —種P型ATP酶基因突變的檢測方法，具體步驟為
步驟1.採集被測者口腔黏膜樣本；
步驟2.基因組DNA的抽提方法 採用矽膠吸附法抽提步驟1中被測者DNA，抽提時間為2-3小時，採用電泳凝膠成像法對DNA濃度和純度作檢測，肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進入下一步檢測； 步驟3.基因分型 將每一個被測者樣本分別放入2個反應孔，2個反應孔分別檢測ATP7B基因第8以及第12號外顯子突變情況，採用PCR技術進行擴增、凝膠電泳技術檢測純度、測序技術對這些位點進行基因型進行確定
步驟3-1 ，反應體系配置 在每一個反應孔中加入PCR標準反應體系，標準反應體系的引物濃度為10uM，反
應體系總體積為20ul，其中，PCR試劑(天根生化KT202-12)5ul，正向引物和反向引物各
0. 4ul， 20ng/ ii 1的步驟2得到的DNA模板3 y 1，去離子水11. 2ul ; ATP7B基因第8外顯子正向和反向引物 正向弓l物ctcttggtcatccattcctg 反向弓l物catggtgttcagaggaagtgag ATP7B基因第12外顯子正向和反向引物 正向弓l物actggtggaagaggctcaga 反向弓l物cctgcagaaggagagtgactg 步驟3-2， PCR反應條件 將反應孔在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為95"C預熱15分鐘；再進行35個循環的95°C、45秒；60。C、45秒；72。C、60秒；72。C、7分鐘後降溫至4°C ;
步驟3-3，將反應孔在PCR擴增儀反應後的產物進行電泳檢測，有肉眼可見清晰白色條帶即可進入下一步 a. 1 % (重量濃度)瓊脂糖凝膠插小號孔梳子；
b. 2000bpDNA標記物(天根生化MD114-02) 6ul ; c.步驟3-2的PCR產物4ul加入電泳緩衝液(天根生化RT201-01) lul ;
d.電泳電壓:120v ;
e.電泳時間20min拍攝一張電泳圖；30min拍攝一張電泳圖； 7個樣本PCR後產物，25ng/ul的電泳結果圖，第8外顯子目的條帶500bp左右；第
12外顯子目的條帶550bp左右。 如圖1所示，為7個樣本第8外顯子PCR後產物的電泳結果圖；如圖2所示，為7 個樣本第12外顯子PCR後產物的電泳結果圖。
步驟3-4，純化 終濃度PCR產物純化試劑0. 2U SAP+PCR產物純化試劑2. 5U EX0Nl/7ul ;
在每 一 個反應孔中加入反應體系，反應體系總體積為7ul、去離子水 ddH20 3. 825ul、 PCR產物純化試劑SAP (promega M8201) 0. 05ul、 PCR產物純化試劑 EX0N1 (NEBM0293V)0. 125ul、步驟3-3的PCR產物3ul ;反應條件為37。C、60min ;80。C、 15min ;4t:恆溫保存; 步驟3-5，將純化後的每一個反應孔進行測序，引物濃度為luM， ABI 3730測序儀；
步驟3-5-1 ，從4度冰箱中取出步驟3-4的PCR純化產物、測序試劑Bi gDye (PE A卯liedBiosystems 4337574)、四種dNTP、luM測序引物，8號以及12號外顯子測序引物分 別為ctcttggtcatccattcctg ;actggtggaagaggctcaga ; 步驟3-5-2，記錄日期、所作反應的PCR純化產物名、所用引物、反應體系、測序試 劑用量、PCR反應條件； 步驟3-5-3，取一塊反應板，標上模板名、測序引物名、日期；
步驟3-5-4，每個樣本需做兩個PCR反應，用一個反應孔； 步驟3-5-5，在每一個反應孔中加入反應體系，反應體系為0. 5ul的BigDye、 1. 4ul 的dNTP、2ul的測序引物、3ul的PCR純化產物、0. lul的去離子水ddH20 ;體系分裝好後，上 離心機，達900轉/分即停; 步驟3-5-6，將反應板放在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為預熱 96°C 10秒；再進行25個循環的96°C 、 10秒；5(TC 、5秒；6(TC 、4分鐘；6(TC 、4分鐘後降溫至 fC恆溫保存； 步驟3-5-7，擴增結束後，在每孔加入lul 125mM乙二胺四乙酸EDTA ; 步驟3-5-8，再在每孔加入無水乙醇15ul於室溫進行沉澱，不得超過24小時； 步驟3-5-9，將96孔板放入冰凍離心機，3650轉/分，4。C離心30分鐘； 步驟3-5-10，輕輕倒去上清液，將96孔板離心，達800轉即停，再在每孔加30ul
70%乙醇，3650轉/分，4t:離心15分鐘，輕輕倒去上清液，將96孔板離心，達800轉即停，
將殘餘酒精風乾，室溫放置20分鐘； 步驟3-5-1 l，每孔加入8ul重量比為15 : 1的95% (重量濃度)甲醯胺與ddH20 混合物； 步驟3-5-12，在ABI 3730上進行結果讀取，用軟體Chromas查閱測序檢測結果 如圖3所示，為ATP7B基因第8號外顯子實驗無突變結果示意圖；圖4為ATP7B基因第8號 外顯子實驗有突變結果示意圖；圖5為ATP7B基因第12號外顯子實驗無突變結果示意圖； 圖6為ATP7B基因第12號外顯子實驗有突變結果示意圖； 如圖7所示，為實施例被測者ATP7B基因第8外顯子R778L突變結果示意圖。
步驟4.最後得出檢測結果，給出結果分析如下表0101] 您的ATP7B基因檢測結果顯示第8外顯子上存在一
0102] 序列表
0103] 〈110〉上海中優醫藥高科技有限公司
0104] 〈120〉 一種P型ATP酶基因突變的檢測方法
0105] 〈160>3
0106] 〈210>1
0107] 〈211>500
0108] 〈212>DNA
0109] 〈213〉人(Homo sapiens)
0110] 〈220〉
0川] 〈221〉mutation
0112] 〈222〉 (312)
水
R778L變異'〈223〉n = g或t〈400〉1gctttgccatccccagggcccttggccctgtgtcgctcattgaactctcc60tccctacttgctggcagccttcactgtccttgtctttcagctcctcggtgggtggtectt120ctacgttcaggcctacaaatctctgagacacaggtcagcc^C3tgg3Cgtgctcatcgt180cctggccacaagcattgcttagttttattctctggtcatcctggtggttgctgtggctga240g卿gcggagaggagccctgtgacattcttcgacacgccccccatgctctttgtgttcat300tgccctgggccngtggctggaacacttggcgcagcttcag360gagctgctccttcagtaaacaaatctcacttcctctgaacaccatgttta420ttatacacagctccatataattaaggtgct■ctagtcactaatctccaaat500
0124] 0125] 0126] 0127] 0128] 0129] 0130] 0131] 0132] 0133] 0134] 0135] 0136] 0137] 0138] 0139]
20
〈210>2 〈211>20 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉用於ATP7B基因第8號外顯子序列擴增的正向引物' 〈400>2
Ctcttggtca tccattcctg 〈210>3 〈211>22 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉用於ATP7B基因第 〈400>3
Qitggtgttc卿gg朋gtg
8號外顯子序列擴增的反向引物' ag 22
90140]4
0141]〈211>500
0142]〈212>DNA
0143]〈213>人(Homo sapiens)0144]〈220〉
0145]〈221>mutation0146]〈222〉 (180)
0147]〈223>n = a或g
0148]〈400>4
0149]ctggga朋tcagacagtttt
0150]agattatcccaatctttatc
0151]ccatggtcttggtgttttat
0152]tggatattttgtcccattta
0153]aatcggttttatcgattttg
0154]ggctatatggtggttgtgtt
0155]tagattcactgggctttaat
0156]gcc卿gtag
0157]tctcctttacattctactta
0158]〈210>5
0159]〈211>20
0160]〈212>DNA
0161]〈213〉人工序列0162]〈220〉
0163]〈223>用於ATP7B基因第:0164]〈400>5
:0165]3Ctggtgg朋gaggctcaga
:0166]〈210>6
:0167]〈211>21
:0168]〈212>DNA
:0169]〈213〉人工序列:oi 70]〈220〉
:0171]〈223>用於ATP7B基因第:0172]〈400〉6
:0173]cctgcag朋gg卿gtgact
catgcttgtg tttcataggc tcatcatcat gtgttgttca 11aaataatc tattcattac gato肌cagt 500
gattga^tttig gtgttttett acccattcag gtcaactttg gagatacttt tactgacatt attttatttg cactctcctt
taaatgtggt tcttcatagg cagctggctg acgttggtgg cctgtaagtt gatcctgttc cttgcttctc ctgcaggttt
te^tg^gg 60 ttgteatttc 120 accggtttan 180 tetggattgt 240 gaatgccttg 300 tttcatatct 360 ttattgacag 420 ctatt肌aga 480
12號外顯子序列擴增的正向引物.
20
12號外顯子序列擴增的反向引物( g 21
10
權利要求
一種P型ATP酶基因突變的檢測方法，其特徵在於，具體步驟為步驟1.採集被測者口腔黏膜樣本用採樣拭刮被測者口腔中左右兩腮各20次，以採集口腔黏膜上皮細胞樣本；步驟2.基因組DNA的抽提方法採用矽膠吸附法抽提被測者口腔黏膜上皮細胞樣本的基因組DNA，抽提時間為2-3小時，採用電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，肉眼可見清晰白色條帶即進入下一步檢測；步驟3.基因分型將每一個被測者樣本分別放入2個反應孔，2個反應孔分別檢測ATP7B基因8號以及12號外顯子突變情況，採用PCR技術進行擴增、凝膠電泳技術檢測純度、測序技術對這些位點確定基因型步驟3-1，反應體系配置在每一個反應孔中加入PCR標準反應體系，標準反應體系的引物濃度為10uM，反應體系總體積為20ul，其中，PCR試劑5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/μl的步驟2得到的DNA模板3μl，去離子水11.2ul；ATP7B基因第8外顯子正向和反向引物如下正向引物ctcttggtcatccattcctg反向引物catggtgttcagaggaagtgagATP7B基因第12外顯子正向和反向引物如下正向引物actggtggaagaggctcaga反向引物cctgcagaaggagagtgactg步驟3-2，PCR反應條件將反應孔在PCR擴增儀上進行反應，反應條件為95℃預熱15分鐘；再進行35個循環的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分鐘後降溫至4℃；步驟3-3，將反應孔在PCR擴增儀反應後的產物進行電泳檢測，肉眼可見清晰白色條帶即進入下一步a.1％瓊脂糖凝膠插小號孔梳子；b.2000bpDNA標記物6ul；c.步驟3-2的PCR產物4ul加入電泳緩衝液1ul；d.電泳電壓120v；e.電泳時間20min拍攝一張電泳圖；30min拍攝一張電泳圖；步驟3-4，純化在每一個反應孔中加入反應體系，反應體系總體積為7ul，由去離子水ddH2O 3.825ul、PCR產物純化試劑SAP 0.05ul、PCR產物純化試劑EXON10.125ul、步驟3-3的PCR產物3ul；終濃度PCR產物純化試劑0.2U SAP 7ul，PCR產物純化試劑2.5U EXON1/7ul；反應條件為37℃、60min；80℃、15min；所得產物4℃恆溫保存；步驟3-5，將純化後的每一個反應孔進行測序，引物濃度為1uM，ABI 3730測序儀；步驟3-5-1，從4℃冰箱中取出步驟3-4的PCR純化產物、測序試劑BigDye、四種dNTP、1uM測序引物，8號以及12號外顯子測序引物分別為ctcttggtcatccattcctg；actggtggaagaggctcaga；步驟3-5-2，記錄日期、所作反應的PCR純化產物名、所用引物、反應體系、測序試劑用量、PCR反應條件；步驟3-5-3，取一塊反應板，標上模板名、測序引物名、日期；步驟3-5-4，每個樣本需做兩個PCR反應，用一個反應孔；步驟3-5-5，在每一個反應孔中加入反應體系，反應體系為0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的測序引物、3ul的PCR純化產物、0.1ul的去離子水ddH2O；體系分裝好後，上離心機，達900轉/分即停；步驟3-5-6，將反應板放在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為預熱96℃，10秒；再進行25個循環的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分鐘；60℃、4分鐘後降溫至4℃恆溫保存；步驟3-5-7，擴增結束後，在每孔加入1ul 125mM乙二胺四乙酸EDTA；步驟3-5-8，再在每孔加入無水乙醇15ul於室溫進行沉澱，不得超過24小時；步驟3-5-9，將96孔板放入冰凍離心機，3650轉/分，4℃離心30分鐘；步驟3-5-10，倒去上清液，將96孔板離心，達800轉即停，再在每孔加30ul 70％乙醇，3650轉/分，4℃離心15分鐘，倒去上清液，將96孔板離心，達800轉即停，將殘餘乙醇風乾，室溫放置20分鐘；步驟3-5-11，每孔加入8ul重量比為15∶1的95％甲醯胺與ddH2O混合物；步驟3-5-12，在ABI 3730測序儀上進行結果讀取，用軟體Chromas查閱測序檢測結果第8以及第12外顯子都2類結果，即正常結果和突變結果；步驟4，結果分析(1).未檢出突變您的檢測結果中未發現ATP7B基因第8以及第12號外顯子上存在突變；(2).檢出突變您的檢測結果中發現ATP7B基因第8或第12號外顯子上存在突變。
全文摘要
本發明涉及一種P型ATP酶基因突變的檢測方法，屬於分子生物學技術領域。所述的P型ATP酶基因突變的檢測方法，其特徵在於，具體步驟為採集被測者口腔黏膜樣本，抽提基因組DNA，基因分型和結果分析。本發明的優點是簡單易行、可重複性高。
文檔編號C12Q1/68GK101712994SQ20091020141
公開日2010年5月26日 申請日期2009年12月18日 優先權日2009年12月18日
發明者傅詠南, 張奕 申請人:上海中優醫藥高科技有限公司