肝病治療用藥用植物溶劑提取物的製作方法

2023-09-23 07:48:30 1

專利名稱：肝病治療用藥用植物溶劑提取物的製作方法
技術領域：
本發明是關於一種具有抑制B型肝炎病毒DNA複製及B型肝炎病毒表面抗原(HBs)及e抗原(HBe)分泌的肝病治療用的藥用植物提取物；該提取物不僅對野生型(wild·type)B型肝炎病毒具有抑制效果，亦對肝安能抗藥性(lamivudine-resistant)的B型肝炎病毒的病毒DNA複製及病毒表面抗原及e抗原的分泌具抑制效果。此肝病治療用的藥用植物來源為具有特定核糖體基因間序列(ribosomal DNA Internal transcribed Spacer，簡稱ITS序列)的蕁麻科植物，以及該ITS序列可作為該藥物植物的鑑識比對。
背景技術：
全世界有三億五千萬人口為慢性B型肝炎帶原者，在美國約有一百二十五萬的慢性肝炎感染者，在中國大陸約有三千至五千萬人感染B型肝炎，一億二千萬人為慢性B型肝炎帶原者，其中每年約有三十萬人死於B型肝炎，在臺灣則約有三百萬人感染B型肝炎。
據估計在美國每年約有14-32萬人感染B型肝炎，因B型肝炎感染所引起的經濟損失每年至少七億美元。在臺灣的慢性肝病及肝硬化患者超過五千人，為國人第六大死因，再加上引起肝腫瘤等病症，則更為可觀。
目前治療B型肝炎以幹擾素(interferon)及肝安能(lamivudine)為主。幹擾素在1992年為FDA允許使用於治療慢性B型肝炎，但是在使用期間會引起非常大的副作用，且僅約20％的B肝病人對幹擾素有反應，而肝安能在1998年通過FDA的許可用來治療慢性B型肝炎，但也僅有17-33％的病人有反應，而中國人對肝安能的反應更低，最嚴重則為長期使用肝安能會引起B肝病毒的突變，隨使用時間加長，其突變率也隨之增加，在使用第一年約有24％的突變率，至第二年則增加為42％，第三年為52％，至第四年則高至67％。故可知目前為止，仍未有高療效低副作用且不會引起病毒突變的治療B型肝炎藥物。
根據研究發現，B型肝炎帶原者的e抗原呈陽性，患者罹肝癌危險為常人六十倍，推估七十歲時，罹肝癌風險高達九成；因此開發更為有效、同時可以抑制B型肝炎病毒表面抗原及e抗原的產生、不會引起病毒突變，甚至可抑制突變病毒的B型肝炎治療藥物為當務之急。

發明內容
有鑑於此，本發明提供一種具有抑制B型肝炎病毒DNA複製及B型肝炎病毒表面抗原及e抗原分泌的肝病治療用的藥用植物提取物；以及利用核糖體基因間序列(ITS序列)對該藥用植物進行鑑定的方法。
本發明的主要目的是提供一種用於肝病治療的藥用植物提取物，是由將山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻的根或莖部磨碎打粉、以溶劑提取而製成。
本發明的另一目的是提供一種提取方法，以用於製造抑制B型肝炎病毒DNA複製，B型肝炎病毒表面抗原及治療e抗原分泌的肝病用的藥用植物提取物，是由將山苧麻、長葉苧麻、哎人貓、水麻、苧麻、木苧麻的根或莖部磨碎打粉、以溶劑提取而製成。
本發明的又一目的是提供一種用於肝病治療的藥用植物的藥用植物鑑定法，是由與山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻的核糖體基因間序列(Internal transcribed Spacer，簡稱ITS序列)進行比對，其ITS序列相似度至少為70％，以單離出具有對抑制B型肝炎病毒DNA複製，B型肝炎病毒表面抗原及治療e抗原分泌的肝病有較佳藥效的植物藥材。
為實現上述目的，本發明提供的用於肝病治療的蕁麻科植物根或莖部的溶劑提取物，提取自一苧麻科植物，且該苧麻科植物其與山苧麻(Boehmeria frutescsns)，長葉苧麻(Boehmeria zollingeriana)、咬人貓(Urlicathunbergiana)、水麻(Pilea spp)、苧麻(Boehmeria nivea)及木苧麻(Boehmeriadensiflora)的核糖體基因間序列(Internal transcribed Spacer)相似度大於70％以上。
其中該山苧麻的核糖體基因間序列如序列識別號1、2及3所示。
其中該長葉苧麻的核糖體基因間序列如序列識別號4、5及6所示。
其中該咬人貓的核糖體基因間序列如序列識別號7、8及9所示。
其中該水麻的核糖體基因間序列如序列識別號10、11及12所示。
其中該苧麻的核糖體基因間序列如序列識別號13、14及15所示。
其中該木苧麻的核糖體基因間序列如序列識別號16、17及18所示。
其中山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻之一的核糖體基因間序列可用於肝病治療的藥用植物提取物的藥用植物鑑定。
其中植物提取物是經抽取待測蕁麻科植物DNA、連鎖聚合酶反應增幅放大、核糖體基因間序列片段定序、分析比對山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻的核糖體基因間序列、建立蕁麻科植物核糖體基因間序列資料庫的步驟鑑定。
該溶劑提取物的提取方法包括下列步驟(a)將該等蕁麻科植物根或莖部根或莖部磨碎打粉，得到一粉狀物；(b)以一高極性溶劑或其溶劑混合物處理步驟(a)中所得粉狀物，得到提取液；經蒸發乾固萃取物；以及(c)再以低極性溶劑及水溶劑混合物處理該步驟(b)中所得的水溶液層，經蒸發乾固萃取物。
其中該高極性溶劑為甲醇、乙醇或其混合物。
其中該低極性溶劑選自一群組包括乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、環己烷、正己烷、正丁醇乙醚、苯，及上述的混合物。
其中該低極性溶劑為乙酸乙酯。
其中肝病治療為B型肝炎治療。
並可用於抗甘安能藥物的B型肝炎治療。
其中肝病治療的蕁麻科植物根或莖部的溶劑提取物配合其他肝病治療藥物使用。
本發明提供的蕁麻科植物藥材鑑定方法，包括以下步驟(a)提供一已知的蕁麻科植物藥材的核糖體基因間序列(ITS)資料庫；(b)提供一蕁麻科植物藥材的根部或莖部，抽取其DNA；(c)設計一引子對(Primer)如下，5』-CACACCGCCCGTCCTACCGA-3』
5』-ACTCGCCGTTACTAGGGGAA-3』並針對該步驟(b)中所抽取的DNA進行聚合酶連鎖反應，得到一第一ITS序列；(d)將步驟(c)中所得到的該第一ITS序列進行定序(sequencing)；以及(e)將該第一ITS序列與該資料庫中的ITS序列資料進行相似度比對，當相似度大於70％以上時，即為該步驟(b)中的蕁麻科植物藥材。
其中該步驟(b)抽取DNA方法是先以CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide)、PVPP(polyvinyl polypyrrolidone)及不同鹽濃度處理，再經過沉澱離心、Chloroform萃取及酒精沉澱而得。
其中該步驟(b)中的蕁麻科植物藥材選自一群組包括山苧麻(Boehmeria frutescsns)，長葉苧麻(Boehmeria zollingeriana)、咬人貓(Urlicathunbergiana)、水麻(Pilea spp)、苧麻(Boehmeria nivea)及木苧麻(Boehmeriadensiflora)。
在一具體實施例中，本發明將肝病治療的藥用植物提取物作為活體外抑制病毒的應用(1)抑制野生型(wild-type)B型肝炎病毒DNA複製及其病毒表面抗原(HBs)及e抗原(HBe)的分泌；(2)抑制抗肝安能藥性(lamivudine-resistant)的B型肝炎病毒DNA複製及其病毒表面抗原及e抗原的分泌。
另一具體實施例中，本發明以山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻的ITS序列作為植物提取物的藥用植物鑑定法的應用。


圖1為蕁麻科植物提取物抑制動物細胞中B型肝炎病毒s抗原及e抗原的效果。
圖2為肝病治療植物提取物抑制動物細胞中野生型與抗肝安能突變種B型肝炎病毒s抗原及e抗原的效果。
圖3為肝病治療植物提取物抑制動物細胞中野生型與抗肝安能突變種B型肝炎病毒DNA複製的效果。
圖4為蕁麻科植物核糖體ITS序列比對結果。
具體實施例方式
本發明的說明中，山苧麻是指蕁麻科苧麻屬植物(Boehmeriafrutescens)；長葉苧麻是指蕁麻科苧麻屬植物(Boehmeria zollingeriana)；咬人貓是指蕁麻科苧麻屬植物(Urlica thunbergiana)、水麻是指蕁麻科苧麻屬植物(Pilea spp)、苧麻是指蕁麻科苧麻屬植物(Boehmeria nivea)及木苧麻是指蕁麻科苧麻屬植物(Boehmeria densiflora)。
本發明包括一種用於肝病治療的藥用植物提取物，由將山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻的根或莖部磨碎打粉，以溶劑提取而製成。
而前述藥用植物提取物的磨碎打粉，是將山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻的根或莖部以搗碎、研磨，切碎等物理方式處理而使其成為單小顆粒，較佳是磨碎成粉末狀，以利後續溶劑提取。
上述藥材處理步驟為在此技術中的人士所熟知，無須特別教示，並且也涵蓋於本發明的範疇內。
前述溶劑提取，是以溶劑萃取法提取藥用植物的有效成份，先以高極性溶劑，如水、甲醇、乙醇、或其溶劑混合物，但不限於此，作為溶劑進行萃取的萃取物；所得的萃取物或以萃取物再以低極性溶劑萃取，本發明定義其介電常數為10以下，如乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、環己烷、正己烷、正丁醇乙醚、苯或其混合物，但不限於此，進行萃取。
在本發明的實施例中，先以高極性溶劑如乙醇回流加熱、再以低極性溶劑如乙酸乙酯或以不同水與乙醇混合比例溶液進行萃取藥用植物的有效成份。
在上述藥用植物藥材磨碎打粉後，萃取步驟亦可視需要以甲醇或乙醇或其混合物而進行前萃取步驟。如上所述，雖然甲醇及乙醇是屬於親水性、高極性的溶劑(介電常數約為26至31)，但由於除了蛋白質、油脂及蠟之外，中草藥植物細胞中的其他成份在甲醇或乙醇中均有一定程度的溶解度，因此，使用甲醇或乙醇，或其混合物進行萃取可有助於後續本發明以低極性溶劑的萃取。
本發明的另一型態是提供一種用護肝病治療的藥用植物提取物的提取方法，是由將山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻的根或其莖部磨碎打粉、先以高極性溶劑處理、再以低極性溶劑處理的提取而製成。視需要，高極性溶劑處理步驟可以甲醇或乙醇或其混合物而進行前萃取步驟，此可有助於後續本發明以低極性溶劑的萃取。
然而，為了使萃取物中有效成份的純度提高，可視需要於本發明的萃取步驟後，進行各種的純化步驟。將萃取物進行純化的方法無須特別教示，且為一般此技術中的人士所熟知，可使用的方法包括，例如，層析法、結晶法、過濾法、沉澱法等，應視所欲達到的目的而決定。
本發明另一種用於肝病治療的藥用植物提取物，是由將山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻的根或莖部磨碎打粉、以溶劑提取製成具有抑制野生型(wild-type)B型肝炎病毒及抗肝安能(lamivudine-resistant)B型肝炎病毒的提取物。
前述藥用植物提取物抑制野生型B型肝炎病毒及抗肝安能B型肝炎病毒效果，由抑制B型肝炎病毒DNA複製及B型肝炎病毒表面抗原(HBs)及e抗原(HBe)分泌。
在一具體實施例中，本發明將肝病治療的藥用植物提取物作為活體外抑制病毒的應用(1)抑制野生型B型肝炎病毒DNA複製及其病毒表面抗原及e抗原的分泌；(2)抑制抗肝安能B型肝炎病壽DNA複製及其病毒表面抗原及e抗原的分泌。
本發明肝病治療的藥用植物提取物可配合其他物質而使用，例如，其他對抗病毒的藥物或其混合物或營養成份等，以達到增強抗病毒效果的協同活性。
本發明可單獨地或與醫藥上可接受的載體或賦形劑結合，以單一劑量或多劑量的形式而投藥。醫學上可接受的載體或稀釋劑以及任何其他已知的佐劑及賦形劑，可根據傳統的技術而調配，例如，參見Remington’sPharmaceutical Sciences，第19版，Gennaro編輯，Mack出版公司，Easton，PA(1995)。
本發明的再一型態是提供一種用於肝病治療的藥用植物提取物的藥用植物鑑定法，由與山苧麻、長葉苧麻、咬人貓，水麻、苧麻、木苧麻的核糖體基因間序列(Internal transcribed Spacer，簡稱ITS序列)進行比對，其ITS序列相似度至少為70％。
前述用於肝病治療的藥用植物提取物的藥用植物鑑定法，由與具有抑制B型肝炎病毒活性提取物的山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻的ITS序列進行ITS序列比對，其ITS序列的相似度至少為70％。
前述用於肝病治療的藥用植物提取物的藥用植物鑑定法，包括下列步驟抽取待測蕁麻科植物的總DNA，然後以連鎖聚合酶反應(PolymeraseChain Reaction，簡稱PCR)增幅故大該所抽取總DNA中的ITS片段；接著針對此ITS片段進行定序，獲得蕁麻科植物核糖體的ITS序列；經由分析比對山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻的ITS序列後可建立具有肝病治療用蕁麻科植物核糖體的ITS序列資料庫。
前述用於肝病治療的藥用植物提取物的藥用植物鑑定法，由與山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻的ITS序列比對，其中山苧麻的ITS1、5.8S及ITS2的序列識別號分別為1、2、3所示的核苷酸序列，長葉苧麻的ITS1、5.8S及ITS2的序列識別號分別為4、5、6所示的核苷酸序列，咬人貓的ITS1、5.8S及ITS2的序列識別號分別為7、8，9所示的核苷酸序列，水麻的ITS1、5.8S及ITS2的序列識別號分別為10、11、12所示的核苷酸序列；苧麻的ITS1、5.8S及ITS2的序列識別號分別為13、14、15所示的核苷酸序列，木苧麻的ITS1、5.8S及ITS2的序列識別號分別為16、17、18所示的核苷酸序列。
前述用於肝病治療的採用植物提取物的藥用植物鑑定法，由與山苧麻、長葉苧麻、哎人貓、水麻的ITS序列比對，其比對的ITS相似度至少為70％。
在一具體實施例中，本發明以山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻的ITS序列作為植物提取物的藥用植物鑑定法的應用。
本發明將由以下實施例進一步詳細說明，但該等實施例僅用於舉例說明，而非用於限制本發明的申請專利範圍。
實施例1藥用植物提取物的提取藥用植物提取物的提取方法如下(1)選取山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻的蕁麻科植物。
(2)分別將步驟(1)蕁麻料植物藥材的根或莖部位經過清洗，刮去外皮而後切細片，研磨成粉。
(3)分別取步驟(2)中的粉末600g，以95％酒精3000ml進行回流加熱10小時，濾取已純粹取液，減壓濃縮除去乙醇，加入乙酯乙酯及蒸鎦水各1000ml，攪拌30分鐘後，靜置1小時。
(4)將步驟(3)的水層產物，以500ml的乙酸乙酯分相萃取，將水層凍乾燥濃縮，即為提取物。
實施例2藥用植物提取物的細胞試驗藥用植物提取物的細胞試驗如下(1)選用含有B型肝炎病毒的細胞株HepG2.2.15，以DMEM培養基進行培養。
(2)將實施例1的提取物500μg/ml加入步驟(1)細胞株中培養五天。
(3)分別於第一、三、五天，將步驟(2)的細胞培養液收集，進行離心(2000xg 2分鐘)。
(4)將步驟(3)離心的上清液部份進行B型肝炎病毒表面抗原及e抗原抑制的測試；離心下層細胞部份則進行細胞毒性或B型肝炎病毒DNA含量測試。細胞經緩衝液清洗兩次後，加入50μl事先配好再DMEM培養液中的MTT放入37℃培養液中反應30分鐘至2小時，再加入150μlDMSO使反應呈色，以光譜儀590nm讀取吸光值，與未加入藥物的細胞吸光值比較，作為藥物對細胞毒性的依據。細胞經緩衝液清洗兩次後。加入含Triton-100的緩衝液，置於冰上反應15分鐘，括取收集反應後的溶液細胞至離心管，置予冰上再反應15分鐘後，以1300xg離心1分鐘，收集上層液與沉澱物；上層液以自動核酸萃取儀抽取細胞質中B型肝炎病毒DNA。
細胞試驗結果如下說明圖1為蕁麻科植物提取物抑制動物細胞中B型肝炎病毒s抗原與e抗原的效果。蕁麻科植物提取物(500μg/ml)加入細胞HepG2.2.15中，分別於第g一、三，五天收集細胞培養液，以酵素免疫反應法(ELISA)分別分析B型肝炎病毒s抗原與e抗原的含量，以未加入藥物的細胞液中的病毒s抗原與e抗原比較，檢測出不同蕁麻科植物提取物對細胞中B型肝炎病毒s抗原與e抗原有不同程度的抑制效果。
圖2是肝病治療植物提取物抑制動物細胞中野生型與抗肝安能突變種B型肝炎病毒s抗原與e抗原的效果。將含有野生型與抗肝安能突變型B型肝炎症毒DNA質體轉植至肝細胞HepG2中，加入植物提取物(500μg/ml)或肝安能(200μg/ml)於不同轉植肝細胞，經培養兩天後，收取細胞培養液，以酵素免疫反應法(ELISA)分別分析B型肝炎病毒s抗原與e抗原的含量，發現所加入的植物提取物可同時抑制野生型與抗肝安能突變型B型肝炎病毒s抗原與e抗原；而肝安能僅能抑制野生型B型肝炎病毒s抗原與e抗原。
圖3是肝病治療植物提取物抑制動物細胞中野生型與抗肝安能突變種B型肝炎病毒DNA複製的效果。將含有野生型與抗肝安能突變型B型肝炎病毒DNA質體分別轉植至HepG2與HuH7肝細胞中，加入植物提取物(500μg/ml)或肝安能(200μg/ml)於不同轉植肝細胞，經培養四天後，收取細胞培，經分離萃取病毒DNA後，以瓊膠電泳將DNA分開後，轉滯到特殊膜(HybondN)，經以由Dig標記病毒DNA雜交，壓片後，獲得不同細胞轉植株中不同藥物對B肝病毒DNA複製不同的抑制作用。C為未加藥物的控制組；L為處理肝安能的實驗組，其僅對野生型B肝病毒DNA複製有抑制作用；B為處理植物提取物的測試組，顯示其對野生型與抗肝安能突變型B型肝炎病毒DNA複製均有抑制作用。
實施例3藥用植物的蕁麻科植物ITS序列鑑定(1)蕁麻科植物藥材的根和莖經過清洗，刮去外皮以減少微生物汙染，而後切細片，以液態氮凍脆後研磨成粉；(2)DNA抽取方法主要採用CTAB、PVPP及不同鹽濃度處理，經過沉澱、離心、Chloroform萃取及酒精沉澱而得；(3)設計PCR增幅放大ITS序列的引子對(primer)如下5』-CACACCGCCCGTCGCTCCTACCGA-3』5』-ACTCGCCGTTACTAGGGGAA-3』以Tm＝60℃進行聚合酶鏈反應；(4)複製出的DNA片段經自動序列分析儀(ABI 3100)分析出序列後以DNAMAN⑧軟體進行序列相似度比對；其中該步驟(2)的萃取步驟如下(2-1)萃取緩衝液100mM Tris.HCl20mM EDTA1M NaCl1％CTAB(cctyltrimcthylammonium bromide)1％PVPP(Polyvinyl Polypyrrolidone，在使用前加入)(2-2)3-100mg樣本+0.5ml萃取緩衝液；(2-3)在70℃反應30分鐘；(2-4)以chloroform∶IAA＝24∶1萃取，以10,000g離心5分鐘；(2-5)取上清液，加入二倍體積的沉澱緩衝液；50mM Tris.HCl10mM EDTA40mM NaCl1％CTAB倒轉2分鐘；(2-6)以13000g離心15分鐘；(2-7)以350μl的1.2M NaCl將步驟(2-6)的沉澱物溶解；(2-8)以Rnase A在37℃反應30分鐘；(2-9)以chloroform∶IAA＝24∶1萃取，以10,000g離心5分鐘；(2-10)加入0.6倍體積的isopropanol，在20℃靜置15分鐘；(2-11)在4℃下以13000g離心20分鐘；(2-12)以1ml 70％的EtOH清洗沉澱物；以及(2-13)將沉澱物溶解在TE緩衝液中(每20mg的起始物使用10-25μl的緩衝液)。
藥用植物的蕁麻科植物ITS序列鑑定結果如下說明圖4是蕁麻科植物核糖體ITS序列比對結果。
上述實施例僅是為了方便說明而舉例而已，本發明所主張的權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
SEQUENCE LISTING110Industrial Technology Research Institute120肝病治療用藥用植物溶劑提取物130WW16018170PatentIn version 3.22101211219212DNA213Boehmeria frutescens4001tcgtaacctg ccatgcagaa caacccgcga acatgtttat taatctcttg gcgcgtttgt 60ggcccttcgg ggagacaaac tcgccttgtg ttgggggccc ccgactttaa aacaaatcgg 120gcgcggtatg cgccaaggaa acaataaaag atcgagccgc aacctcgagg caaggacctt 180ggcgtgttgc ggtcggtcgc taaaatgaaa tgtcgtaac 2192102211155212DNA213Boehmeria frutescens4002cgactctcgg caacggatat ctcggctctc gcatcgatga agaacgtagc gaaatgcgat 60acttggtgtg aattgcagaa tcccgtgaac catcgagtct ttgaacgcaa gttgcgcccg 120aagccgttag gccgagggca cgtctgcctg ggctc 1552103211238212DNA213Boehmeria frutescens4003acgcaccgtc gccccctccc caaaccagtc tttttgacgg gattgggtgg ggcggatatt 60ggcctcccgt gcgaatgcgt gcggctggcc caaaatcgag tccccggctt tgtttgccgc 120
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213Boehmeria densiflora40017gactctcggc aacggatatc tcggctctcg catcgatgaa gaacgtagcg aaatgcgata 60cttggtgtga attgcagaat cccgtgaacc atcgagtctt tgaacgcaag ttgcgcccga 120agcctttcgg ccgagggcac gtctgcctgg gcgtc 15521018211235212DNA213Boehmeria densiflora40018acgcatcgtc gcccccactc ctcccaggtt cttctgggcc gttggtgtgg ggcggataat 60ggcctcccgt acgcttgcgg tgcggatggc cgaaaattga gtccccggct tcgtttgccg 120cgacattcgg tggtcgtcga ttactcggtg tcccgtcgtg cgcgcggccg gagggctcgc 180tggaatgacc cacgcggccc gttgctggac ccccagtgat gcgcgccctt ctaag23權利要求
1.一種用於肝病治療的蕁麻科植物根或莖部的溶劑提取物，提取自一苧麻科植物，且該苧麻科植物其與山苧麻(Boehmeria frutescsns)，長葉苧麻(Boehmeria zollingeriana)、咬人貓(Urlica thunbergiana)、水麻(Pileaspp)、苧麻(Boehmeria nivea)及木苧麻(Boehmeria densiflora)的核糖體基因間序列(Internal transcribed Spacer)相似度大於70％以上。
2.如權利要求1所述的溶劑提取物，其特徵在於，其中該山苧麻的核糖體基因間序列如序列識別號1、2及3所示。
3.如權利要求1所述的溶劑提取物，其特徵在於，其中該長葉苧麻的核糖體基因間序列如序列識別號4、5及6所示。
4.如權利要求1所述的溶劑提取物，其特徵在於，其中該咬人貓的核糖體基因間序列如序列識別號7、8及9所示。
5.如權利要求1所述的溶劑提取物，其特徵在於，其中該水麻的核糖體基因間序列如序列識別號10、11及12所示。
6.如權利要求1所述的溶劑提取物，其特徵在於，其中該苧麻的核糖體基因間序列如序列識別號13、14及15所示。
7.如權利要求1所述的溶劑提取物，其特徵在於，其中該木苧麻的核糖體基因間序列如序列識別號16、17及18所示。
8.如權利要求1所述的溶劑提取物，其特徵在於，其中山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻之一的核糖體基因間序列可用於肝病治療的藥用植物提取物的藥用植物鑑定。
9.如權利要求8所述的溶劑提取物，其特徵在於，其中植物提取物是經抽取待測蕁麻科植物DNA、連鎖聚合酶反應增幅放大、核糖體基因間序列片段定序、分析比對山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻的核糖體基因間序列、建立蕁麻科植物核糖體基因間序列資料庫的步驟鑑定。
10.如權利要求1所述的溶劑提取物，其中該溶劑提取物的提取方法包括下列步驟(a)將該等蕁麻科植物根或莖部根或莖部磨碎打粉，得到一粉狀物；(b)以一高極性溶劑或其溶劑混合物處理步驟(a)中所得粉狀物，得到提取液；經蒸發乾固萃取物；以及(c)再以低極性溶劑及水溶劑混合物處理該步驟(b)中所得的水溶液層，經蒸發乾固萃取物。
11.如權利要求10所述的溶劑提取物，其特徵在於，其中該高極性溶劑為甲醇、乙醇或其混合物。
12.如權利要求10所述的溶劑提取物，其特徵在於，其中該低極性溶劑選自一群組包括乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、環己烷、正己烷、正丁醇乙醚、苯，及上述的混合物。
13.如權利要求12所述的溶劑提取物，其特徵在於，其中該低極性溶劑為乙酸乙酯。
14.如權利要求1所述的溶劑提取物，其特徵在於，其中肝病治療為B型肝炎治療。
15.如權利要求1所述的溶劑提取物，其特徵在於，並可用於抗甘安能藥物的B型肝炎治療。
16.如權利要求1所述的溶劑提取物，其特徵在於，其中肝病治療的蕁麻科植物根或莖部的溶劑提取物配合其他肝病治療藥物使用。
17，一種用於B型肝炎治療的藥用植物提取物，包括抗甘安能藥物B型肝炎的治療，該藥用植物提取物將山苧麻、長葉苧麻、咬人錨、水麻的根或莖部磨碎打粉、再以溶劑提取而製成。
18.如權利要求17所述的藥用植物提取物，其特徵在於，其中溶劑提取物的提取方法包括下列步驟將山苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻、苧麻、木苧麻的根或莖部磨碎打粉，以高極性溶劑處理，再以低極性溶劑處理提取而製成。
19.如權利要求18所述的藥用植物提取物，其特徵在於，高極性溶劑處理步驟可以甲醇或乙醇或其混合物進行。
20.如權利要求18所述的藥用植物提取物，其特徵在於，低極性溶劑處理步驟可以乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、環己烷、正己烷、正丁醇乙醚、苯或其混合物進行。
21.如權利要求18所述的藥用植物提取物，其特徵在於，其中低極性溶劑處理步驟以乙酸乙酯進行。
22.如權利要求18所述的藥用植物提取物，其特徵在於，其中B型肝炎治療藥用植物提取物可進一步配合其他肝病治療藥物使用。
23.一種蕁麻科植物藥材鑑定方法，包括以下步驟(a)提供一已知的蕁麻科植物藥材的核糖體基因間序列(ITS)資料庫；(b)提供一蕁麻科植物藥材的根部或莖部，抽取其DNA；(c)設計一引子對(Primer)如下，5』-CACACCGCCCGTCCTACCGA-3』5』-ACTCGCCGTTACTAGGGGAA-3』並針對該步驟(b)中所抽取的DNA進行聚合酶連鎖反應，得到一第一ITS序列；(d)將步驟(c)中所得到的該第一ITS序列進行定序(sequencing)；以及(e)將該第一ITS序列與該資料庫中的ITS序列資料進行相似度比對，當相似度大於70％以上時，即為該步驟(b)中的蕁麻科植物藥材。
24.如權利要求23所述的蕁麻科植物藥材鑑定方法，其特徵在於，其中該步驟(b)抽取DNA方法是先以CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide)、PVPP(polyvinyl polypyrrolidone)及不同鹽濃度處理，再經過沉澱離心、Chloroform萃取及酒精沉澱而得。
25.如權利要求23所述的蕁麻科植物藥材鑑定方法，其特徵在於，其中該步驟(b)中的蕁麻科植物藥材選自一群組包括山苧麻(Boehmeriafrutescsns)，長葉苧麻(Boehmeria zollingeriana)、咬人貓(Urlicathunbergiana)、水麻(Pilea spp)、苧麻(Boehmeria nivea)及木苧麻(Boehmeriadensiflora)。
全文摘要
本發明為一種用於肝病治療的蕁麻科植物根或莖部的溶劑提取物，所使用的蕁麻科植物其核糖體基因間序列(ribosomal DNA Internal transcribed Spacer)與山苧麻、苧麻、長葉苧麻、咬人貓、水麻的核糖體基因間序列相似度大於70％以上另，本發明的肝病治療用藥用植物的提取物對(1)野生型B型肝炎病毒具有抑制效果；(2)對抗肝安能藥性B型肝炎病毒具抑制效果。
文檔編號A61P1/00GK1634964SQ200310123409
公開日2005年7月6日 申請日期2003年12月26日 優先權日2003年12月26日
發明者李連滋, 張秀鳳, 李承榆, 邱淑嬌, 童天送 申請人:財團法人工業技術研究院