用於預防或治療惡性腫瘤的HER－2/neu蛋白胞內區的製作方法
2023-10-17 22:39:39
專利名稱：用於預防或治療惡性腫瘤的HER－2/neu蛋白胞內區的製作方法
技術領域：
本發明主要針對用於誘導或增強對HER-2/neu蛋白免疫反應的多肽及編碼該多肽的核酸分子，包括其在與HER-2/neu癌基因相關的惡性腫瘤治療中的應用。
發明的背景儘管在經濟和人力資源方面做了大量的投資，癌症仍是一個主要的死亡原因。例如，癌症是35到74歲婦女的主要死亡原因。乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤並且發病率在繼續上升。有1/9的婦女將被診斷患有此病。治療乳腺癌的標準方法以聯合應用外科手術、放療和化療為主。這些方法在某些惡性腫瘤的治療上取得了巨大的成功。然而，這些方法並不能成功地治療所有的惡性腫瘤，當試圖治療超過某個階段的乳腺癌時，通常是不能治癒的。用於預防和治療的其它方法是必需的。
惡性腫瘤的一個共同特點是不受控制的細胞生長。癌細胞經過了由正常細胞向能自主生長的惡性細胞的轉化。體細胞基因的擴增和過度表達被認為是導致正常細胞向惡性細胞轉化的一個共同的首要事件。在細胞分裂時，由癌基因編碼的惡性表型特徵被傳遞給已轉化的子代細胞。
正在進行的涉及瘤基因的研究工作已經發現了至少40個在惡性細胞中起作用及引起或與轉化相關的癌基因。癌基因基於其推定的功能或其基因產物(如由癌基因表達的蛋白)的定位而被分成不同的類。
癌基因被認為對正常細胞生理學的某些方面是至關重要的。在這點上，HER-2/neu癌基因是酪氨酸蛋白激酶癌基因家族的一個成員，並與表皮生長因子受體有著高度的同源性。HER-2/neu可能在細胞的生長和/或分化中起作用。HER-2/neu可能通過由增加或下調一種必要的正常基因產物的表達而導致的數量上的機理誘導了惡性腫瘤。
HER-2/neu(p185)是HER-2/neu癌基因的蛋白產物。在包括乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、肺癌及前列腺癌在內的許多癌症中HER-2/neu基因被擴增並有HER-2/neu蛋白的過度表達。HER-2/neu與惡性轉化相關。在50％-60％的管狀原發性肉瘤、20％-40％的乳腺癌及相當部分出現在卵巢、前列腺、結腸及肺的腺癌都發現了HER-2/neu。HER-2/neu不僅與惡性表型緊密相關，而且與腫瘤的浸潤也緊密相關，在1/4的浸潤性乳腺癌中發現了這一點。在乳腺癌和卵巢癌中，HER-2/neu的過度表達與預後較差相關。HER-2/neu是一個相對分子量為185kd，長度是大約1255個胺基酸(aa)的跨膜蛋白。它含有一個與表皮生長因子(EGFR)有40％同源性的大約645胺基酸的細胞膜外結合區(ECD)、一個高度疏水的穿膜錨定區(TMD)以及一個與EGFR有80％同源性的約有580個胺基酸的羧基端胞質區(CD)。
由於目前在治療與HER-2/neu相關腫瘤中的困難，因而本領域需要改進的化合物和組合物。本發明滿足了這種需要並進一步提供了其它相關的優點。
發明小結簡言之，本發明提供了用於免疫溫血動物抗與HER-2/neu相關的惡性腫瘤或用於生產進行免疫的藥物的多肽、核酸分子(指導該多肽的表達)以及病毒載體(指導該多肽的表達)。根據本發明的多肽或核酸分子可存在於一種包括藥物學上可用的載體或稀釋劑的組合物中。可將這樣一種多肽、核酸分子、病毒載體或藥物組合物用於一次性免疫(如當疑有惡性腫瘤時)或周期性免疫(如發生惡性腫瘤或惡性腫瘤復發的危險增加的個體)。用於免疫的藥物可能在治療已存在的腫瘤或防止腫瘤的發生或復發中發揮作用。
在一個實施方案中，本發明提供了一種由一段選自於(a)序列號1的2026位到3765位核苷酸；和(b)在中度嚴格的條件下，能同互補於序列號1的2026位到3765位核苷酸的序列雜交的DNA序列的DNA序列編碼的多肽，這段DNA序列編碼一種能刺激產生對HER-2/neu蛋白免疫反應的多肽。在一優選的實施方案中，一種多肽具有序列號2中從676號賴氨酸到1255號纈氨酸的胺基酸序列或其產生至少一種等價的免疫反應的變體。所提供的組合物包括本發明的一種多肽並聯合一種藥學上可用的載體或稀釋劑。
在另一實施方案中，本發明的多肽或組合物被用於免疫一種溫血動物以對抗與HER-2/neu癌基因相關的惡性腫瘤。在另一實施方案中，這種多肽或組成物被用於生產一種用來免疫溫血動物以對抗與HER-2/neu癌基因相關惡性腫瘤的藥物。
在另一實施方案中，一種指導本發明的多肽表達的核酸分子被用於通過用核酸分子轉染溫血動物的細胞進行免疫。在另一實施方案中，這種核酸分子被用於生產一種用來免疫溫血動物以對抗與HER-2/neu癌基因相關惡性腫瘤的藥物。
在另一實施方案中，一種指導本發明的多肽表達的病毒載體被用於通過用載體感染溫血動物的細胞進行免疫。在另一實施方案中，這種病毒載體被用於生產一種用來免疫溫血動物以對抗與HER-2/neu癌基因相關惡性腫瘤的藥物。
參考下面的詳細描述和附圖，本發明的這些和其它方面將變得清楚。
圖的簡要描述
圖1顯示幼稚T細胞通過樹突狀細胞由HER-2/neu多肽的致敏結果。骨髓來源的DC是由CD34+幹細胞通過GM-CSF和IL-6刺激產生。由HER-2/neu刺激的DC在和T細胞培養7天後誘導自體CD4+/CD45RA+T淋巴細胞的蛋白質特異性增殖。將在含有GM-CSF和IL-6的無血清培養基中培養一周的骨髓來源的CD34+幹細胞用作APC。將APC以各種濃度接種於圓底96孔板中(Corning，Corning，NY，USA)並和20-25ug/ml重組HER-2/neu多肽孵育16-18小時。利於免疫親和柱(CellPro，Inc.，Bothell，WA，USA)通過陽性篩選從自體外周血單核細胞中分離CD4+T淋巴細胞。對抗原刺激的APC進行照射(10Gy)，並以每孔105加入CD4+T淋巴細胞。通過對在第7天加入(3H)胸苷(1μCi/孔)的16-18小時的攝取量來評價T細胞的增殖反應。在無血清和無細胞因子的培養基中5孔平行進行增殖檢測。符號代表-●-DC+HER-2/neu多肽+CD4+/CD45RA+T細胞；-○-DC+CD4+/CD45RA+T細胞；及-□-DC+HER-2/neu多肽。
圖2顯示CD4+細胞對HER-2/neu多肽的反應。利用對圖1所描述的引發檢測來測試正常供者的CD4+T細胞對重組人HER-2/neu多肽的反應。符號代表-■-SC+CD4及…◆…SC+CD4+HER-2/neu多肽。「SC」為幹細胞。
圖3顯示用大鼠HER-2/neu多肽免疫的大鼠產生大鼠neu特異性抗體。用25ug在MPL或vacell佐劑中的重組大鼠HER-2/neu多肽免疫大鼠。每隔20天進行一次，共給予三次免疫。最後一次免疫後20天評價大鼠對大鼠neu的抗體反應。用大鼠HER-2/neu多肽和vaccel佐劑免疫的動物顯示高滴度大鼠neu特異反性。以用人HER-2/neu多肽(外源蛋白)免疫的動物作為對照。在獨立的試驗中，用100ug和300ug純化的全長大鼠neu免疫的大鼠未產生可檢測到的neu特異性抗體(數據未示)。數據代表3個動物的均值和標準差。符號代表-■-大鼠HER-2/neu多肽/MPL；…●…大鼠HER-2/neu多肽/vacell；…□…單獨MPL；…○…單獨vacell；及… …對照。「MPL」和「vaccel」為佐劑(Ribi，Bozcman，MT，USA)。「Neu」為HER-2/neu蛋白。
圖4顯示乳腺癌患者對HER-2/neu多肽有預存在的免疫性。通過氘化胸苷的摻入在平行的24孔中評價患者PBMC。反應孔計高於對照孔的均值和3倍標準差(372cpm)。這種HER-2/neu陽性II期乳腺癌患者對重組人HER-2/neu多肽有顯著的反應。符號「p」代表HER-2/neu蛋白的肽，「tt」代表破傷風毒素，而「hHNP」代表重組人HER-2/neu多肽。
本發明的詳細描述在闡明本發明前，闡明此後所用的某些術語的定義可能對其理解有幫助。
HER-2/neu多肽-此中所用的該術語指具有序列號2中從676位賴氨酸到1255位纈氨酸的胺基酸序列的HER-2/neu蛋白(此蛋白也被稱為p185或c-erbB2)的一部分，並且可天然獲得、合成產生、基因工程生產，或如一個或多個胺基酸被其它胺基酸或非胺基酸取代而並不嚴重影響對HER-2/neu蛋白免疫反應的引發或增強的功能等價變體(例如，變體通過輔助T細胞或細胞毒性T細胞刺激一種反應)。
T細胞的增殖-此中所用的該術語包括T細胞的擴增和導致擴增的對T細胞刺激，即引起有絲分裂的啟始事件和有絲分裂本身。下面對檢測T細胞增殖的方法進行討論。
如上面提到的，本發明針對用於引發或增強對HER-2/neu癌基因表達蛋白產物、包括對溫血動物中與擴增的HER-2/neu基因相關的惡性腫瘤的免疫性的化合物和組合物。擴增的HER-2/neu基因與惡性腫瘤的聯繫並不需要基因的蛋白表達產物存在於腫瘤上。例如，蛋白表達產物的過度表達可能涉及一種腫瘤的發生，但隨後蛋白的表達可能消失。本發明的一個用途是引發或增強局部的免疫反應來將HER-2/neu陽性的腫瘤轉變為HER-2/neu陰性。
更具體地，本發明的公開一方面表明基於HER-2/neu基因蛋白表達產物的一特定部分的多肽(HER-2/neu多肽)可被胸腺依賴淋巴細胞(此後為「T細胞」)識別，因而局部的免疫T細胞反應可被預防性利用或用來治療這種蛋白正被或已經被過度表達的惡性腫瘤。另一方面，本發明的公開也表明指導這種肽表達的核酸分子可被單獨或在一病毒載體中用以進行免疫。
大體上認為CD4+T細胞群在被一特定抗原刺激時通過釋放淋巴因子而發揮輔助細胞/誘導細胞的功能；然而，CD4+細胞的一個亞群可作為細胞毒性T細胞(CTL)。類似地，認為CD8+T細胞通過直接裂解抗原性靶子發揮作用；然而，在多種情況下它們可以分泌淋巴因子來提供輔助細胞或DTH功能。儘管有潛在重疊的功能，CD4和CD8的表型標誌與識別結合於I類或II類MHC抗原的肽有關。在II類或I類MHC情況下遞呈對抗原的識別使得CD4+和CD8+T細胞對不同抗原或在不同情況下遞呈的相同抗原發生反應。免疫原性肽與II類MHC抗原的結合最常發生於被抗原提呈細胞攝取的抗原。因此，CD4+T細胞通常識別在腫瘤細胞外的抗原。相反，在正常情況下，肽對I類MHC的結合只發生於存在於胞漿中的和由靶細胞自己合成的蛋白，而不包括在外環境中的蛋白。對此的一個例外是外源肽與以高濃度存在於細胞外的一種精確的I類結合區的結合。因此，CD4+和CD8+T細胞具有廣泛不同的功能並趨於識別不同的抗原作為一種對抗原的正常停留位點的反映。
如在本發明中公開的，由HER-2/neu癌基因表達的蛋白產物的一個多肽部分被T細胞識別。循環HER-2/neu多肽降解為肽片段。來自多肽的肽片段結合於主要組織相容性複合體(MHC)抗原。通過展示在細胞表面結合於MHC抗原的肽和宿主T細胞對肽與自身MHC抗原的結合體的識別，HER-2/neu多肽(包括表達於惡性細胞表面的)對T細胞具有免疫原性。T細胞受體的精確特異性使得單個T細胞能夠區別僅有一個胺基酸殘基不同的肽。
在對來自多肽的一個肽片段的免疫反應過程中，表達一種以高親和力結合於肽-MHC複合體的T細胞受體的T細胞結合於肽-MHC複合體，由此被活化並被誘導增殖。在與肽的首次相遇中，少量的免疫T細胞將分泌淋巴因子、增殖並分化成為效應細胞和記憶T細胞。初次免疫反應發生在體內但難以在體外檢測。由記憶T細胞隨後再次遇到同一抗原將導致一種更快更強烈的免疫反應。再次應答將發生在體內或體外。體外應答通過衡量增殖的程度、細胞因子產生的程度或再次暴露於抗原的T細胞群的裂解細胞活性的產生而易於計量。T細胞群對一特異抗原反應而大量增殖被認為指示著對抗原的首次暴露或致敏。
本發明的化合物大體上包括HER-2/neu多肽或指導這種肽表達的DNA分子，其中DNA分子可存在於一病毒載體之中。如上面提到的，本發明的多肽包括序列號2中從676位胺基酸到1255位胺基酸的多肽的變體，它們保持有刺激免疫反應的能力。這些變體包括原始多肽的各種結構形式。由於存在可離子化的氨基和羧基基團，例如，一種HER-2/neu多肽可能是以一種酸性或鹼生鹽的形式或者可能以中性的形式存在。單個胺基酸殘基也可被氧化或還原修飾。
在本發明範圍中的變體還包括原始的HER-2/neu多肽的一級胺基酸結構通過與其它肽、多肽或者如糖基、脂質、磷酸、乙醯基等化學成分形成共價的或凝集的偶聯物而被修飾的多肽。可通過例如在胺基酸側鏈或者在N-末端或C-末端上連接特定功能的基團來製備共價衍生物。
本發明還包括糖基化和未糖基化的HER-2/neu多肽。根據表達系統，在酵母或哺乳動物表達系統中表達的多肽在分子量和糖基化模式上可能與原始的分子類似或稍有不同。例如，在細菌如大腸桿菌中編碼多肽的DNA的表達典型地產生非糖基化的分子。真核蛋白的N-糖基化位點以胺基酸三聯體Asn-A1-Z為特徵，其中A1為除Pro外的任何胺基酸，而Z為Ser或Thr。可通過本領域普通技術人員所了解的技術如寡核苷酸合成和連接或位點特異性突變技術製備具有失活的N-糖基化位點的HER-2/neu多肽的變體，它們也屬於本發明的範圍。另外，N-連接糖基化位點可被加到HER-2/neu多肽中。
本發明的多肽還包括序列號2多肽的變體(即具有序列號2中676號胺基酸到1255號胺基酸的胺基酸序列的多肽的變體)，它具有因一個或多個缺失、插入、置換或其它修飾而具有與該序列不同的胺基酸序列。在一個實施方案中，這種變體與天然HER-2/neu多肽具有高度的同源性並保持刺激免疫反應的能力。這裡所用的「高度的同源性」指可由在中度嚴格的條件下能夠與同此中編碼序列號2的特定多肽部分的天然DNA序列(即序列號1中的2026到3765位核苷酸)互補的核苷酸序列雜交的DNA序列編碼的胺基酸序列。合適的中度嚴格的條件包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)組成的溶液中預衝洗；在50℃-65℃、5×SSC條件下雜交過夜；隨後分別用2×、0.5×和0.2×SSC(含有0.1％SDS)在65℃衝洗兩次每次20分鐘。這種雜交的DNA序列也屬於本發明的範圍。任何這種修飾對HER-2/neu多肽引起免疫反應的能力的影響可很容易地測定(例如，用如此中所描述的方法通過分析突變的HER-2/neu多肽誘導T細胞反應的能力)。
一般，可通過多種方法達到胺基酸置換以提供本發明的其它變體。例如，首先，可保守地進行胺基酸置換；即一個置換胺基酸取代具有相似性質的胺基酸以便肽化學領域的技術人員能夠預期多肽的二級結構和親水性不被嚴重地改變。大體上，下組的胺基酸代表保守改變(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。一個非保守改變的例子是將一組中的一個胺基酸用另一組中的胺基酸取代。
製備胺基酸置換以產生本發明的變體的另一方法是在有潛能結合II類MHC分子(對於CD4+T細胞反應)或I類MHC分子(對於CD8+T細胞反應)的T細胞基元中鑑定和取代胺基酸。可通過計算機分析來鑑定帶有理論上有潛能結合於II類MHC分子基元的肽片段(HER-2/neu肽的)。例如，可用一種包括幾種設計用來區別T細胞識別的潛在位點的計算機參數蛋白質序列分析軟體包，T Sites(Feller和de la Cruz，《自然》(Nature)349720-721，1991)。利用兩個搜索參數(1)由Margalit等描述的AMPHI參數(Feller和de la Cruz，《自然》349720-721；Margalit等《免疫學雜誌》(J.Immunol.)1382213-2229，1987)根據α-螺旋周期性和雙親性鑑別表位基元；(2)Rothbard和Taylor參數根據電荷和極性模型鑑別表位基元(Rothbard和Taylor，《歐洲分子生物學組織雜誌》(EMBO)793-100，1988)。具有兩種基元的片段最適於結合II類MHC分子。CD8+T細胞識別結合於I類MHC分子的肽。Falk等已經證明結合於特異的MHC分子的肽具有可辨的序列基元(Falk等，《自然》351290-296，1991)。通過Edman降解從一種培養細胞系的HLA-A2.1分子剝離的肽已經確定了用於在HLA-A2.1的溝中結合的一種肽基元(表2，摘自Falk等，supra)。該方法將典型的或普通的HLA-A2.1結合肽鑑定為帶有在位點2(L)和9(V)上的主要錨定殘基的9個胺基酸。通常的強結合殘基被鑑定在位點2(M)、4(E、K)、6(V)和8(K)。所鑑定的基元代表許多結合肽的平均。
HLA-A2.1限制性基元
續表
按這裡定義的所衍生的肽基元並不特別嚴格。一些HLA-A2.1結合肽不合有這兩種主要錨定殘基而且在主要錨定殘基兩側的胺基酸在允許或不允許結合方面發揮主導作用。並非每個帶有這裡所描述的結合基元的肽都會結合，而一些沒有這種基元的肽也會結合。值得注意的是，這裡的HLA-A2.1基元在位於2號和9號殘基上的主要錨定胺基酸之間置有6個胺基酸。
在HER-2/neu多肽中的肽基元鑑定後，可製備保守的或非保守的胺基酸置換。後一類型的置換意在產生一種改進的更有效和/或可更廣泛交叉反應(MHC多態性)的多肽。更有效多肽的一個例子是一種象天然多肽一樣以更高的親和力結合於相同的MHC分子，而不影響T細胞對天然多肽的特異性識別的多肽。可更廣泛交叉反應的多肽的一個例子是一種比天然多肽誘導更廣泛交叉反應免疫應答(即結合更大範圍的MHC分子)的多肽。類似地，定位在肽基元之間和具有間隔區功能(即不與一種MHC分子或T細胞受體相互作用)的一個或多個胺基酸可被保守地或非保守地置換。對本領域普通技術人員來說顯然可通過多種檢測包括此中所描述的用於檢測刺激T細胞識別的能力的那些方法來對含有一個或多個胺基酸置換的多肽測試其有利或不利的免疫學相互作用。
在本發明範圍內的變體也可以含有或者替代地含有對多肽預期的免疫學特性具有最小影響的其它修飾，包括胺基酸的缺失或加入。那些本領域普通技術人員會認識到可使用HER-2/neu多肽的截短形式或非天然伸展形式，只要其預期的免疫學特性至少粗略地與全長的天然HER-2/neu多肽相當。半胱氨酸可被刪除或用其它胺基酸取代以阻止在復性時不正確分子內二硫橋連的形成。引起突變的其它方法包括對鄰近的二元胺基酸殘基的修飾以提高在有KEX2蛋白酶活性存在的酵母系統中的表達。
一般可利用一個編碼HER-2/neu蛋白的基因組或cDNA克隆來獲得HER-2/neu多肽。在序列號1中列出編碼全長HER-2/neu的基因組序列，並且在序列號2中列出推導的胺基酸序列。這些克隆可通過篩選一合適的表達文庫以尋找表達HER-2/neu蛋白的克隆而被分離出來。文庫的製備和篩選大體上可利用被本領域的普通技術人員了解的方法進行，如在Sambrook等《分子克隆實驗室指南》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，冷泉港實驗室，冷泉港，N.Y.，1989中所描述的方法，這裡併入本文作為參考。簡言之，可將一噬菌體表達文庫鋪板並轉移至濾膜上。然後用一種檢測劑孵育濾膜。在本發明的情況中，「檢測劑」是任何能夠結合於HER-2/neu蛋白的化合物，然後可以通過那些本領域普通技術人員所了解的許多方法中的任何方法將其檢測出來。典型的檢測劑含有一種偶聯有一個報導基團的「結合劑」，如蛋白A、蛋白G、IgG或一種凝集素。優選的報導基團包括酶、底物、輔助因子、抑制劑、染料、放射性核素、發光基團、螢光基團和生物素。報導基團更優選為可通過與如四甲基聯苯胺或2，2′-連氮-雙-3-乙基苯並噻唑啉磺酸的一種底物孵育而進行檢測的辣根過氧化物酶。利用那些本領域的普通技術人員所了解的技術將含有表達HER-2/neu蛋白的基因組或cDNA序列的菌斑分離和純化。例如，在Sambrook等《分子克隆實驗室指南》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，冷泉港實驗室，冷泉港，N.Y.，1989中可以找到合適的方法。
大體上可通過在上面所描述的一個或多個方面對序列進行修飾並對所得多肽檢測刺激免疫反應如T細胞反應的能力來鑑定保持有刺激免疫反應能力的多肽的變體。例如，大體上可通過用修飾的多肽接觸T細胞並檢測其反應來進行這些檢測。例如也可通過篩選帶有一編碼多肽或其變體的DNA序列的cDNA或基因組文庫分離多肽的天然變體。
可用標準的重組技術或通過被修飾多肽的自動合成引入上面所描述的序列修飾。例如，可通過合成帶有一突變序列的由能夠連接到天然序列片段上的限制性位點作為側翼序列的寡核苷酸在特異的位點引入突變。在連接後，所得的重建序列編碼一種帶有預期的胺基酸插入、置換或缺失的類似物。
另外，定向寡核苷酸位點特異性突變方法可被用於提供一根據所要求的置換、缺失或插入而改變特定密碼子的基因。上面提出的進行改變的典型方法由Walder等，《基因》(Gene)42133，1986；Bauer等，《基因》3773，1985；Craik，《生物技術》(BioTechniques)1985年一月，12-19；Smith等，《遺傳工程原理和方法》(GeneticEngineeringPrinciples and Methods)，Plenum出版社，1981；和U.S.專利4,518,584和4,737,462號公開。
當然，在構建的用於這種HER-2/neu多肽表達的核苷酸序列中的突變必須保留編碼序列的閱讀框，並且優選不產生能夠雜交以形成二級mRNA結構的互補區，如環或髮夾，這些可能不利地影響mRNA的翻譯。雖然可以預先確定一個突變位點，但不必預先確定突變本身的性質。例如，為了尋找在一給定位點的突變體的最佳特點，可在靶密碼子上進行隨機突變並對所表達的HER-2/neu多肽突變體篩選預期的活性。
並非在編碼HER-2/neu多肽的核苷酸序列中的所有突變在終產物中都將被表達。例如，可製備核苷酸置換來提高表達，首要地在被轉錄的mRNA中來避免二級結構環(例如見歐洲專利申請75,444A)，或來提供更易被所選宿主翻譯的密碼子，如已知大腸桿菌優先密碼子用於大腸桿菌表達。
本發明的多肽不論天然的和修飾的都優選通過重組DNA方法製備。這些方法包括在一重組表達載體中插入一個編碼HER-2/neu多肽的DNA序列，和在一種重組微生物、哺乳動物或昆蟲細胞表達系統中在促進表達的條件下表達該DNA序列。編碼本發明所提供多肽的DNA序列可由cDNA片段和短的寡核苷酸接頭或由一系列寡核苷酸組裝以提供一個能夠被插入一個重組表達載體並在一個重組的轉錄單位中表達的合成基因。
重組表達載體含有一個被可操作地連接到源自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因的適宜轉錄或翻譯調節元件上的編碼HER-2/neu多肽的DNA序列。這種調節元件包括一個轉錄啟動子、一個可有可無的的控制轉錄的操縱子序列、一個編碼適宜的mRNA核糖體結合位點的序列以及控制轉錄和翻譯終止的序列。另外應加入一個複製起點和一個便於識別轉化體的可篩選標誌。
當DNA區彼此功能上相關時它們被可操作地連接。例如，如果一種信號肽(分泌性前導序列)的DNA被表達為一種參與多肽分泌的前體，則將其可操作地連於一種多肽的DNA；如果一個啟動子控制序列的轉錄，則將其可操作地連於一編碼序列；或如果一個核糖體結合位點被定位以便允許翻譯，則將其可操作地連於一編碼序列。大體上，可操作地連接意味著毗鄰和在分泌性前導序列情況下意味著在閱讀框中。編碼要在一微生物中表達的HER-2/neu多肽的DNA序列將優選不含有能夠提前終止DNA轉錄為mRNA的內含子。
用於細菌的表達載體可含有一個可篩選標誌和由含有所熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳學元件的商品化質粒衍生來的細菌複製起點。例如，這些商業的載體包括pKK223-3(Pharmacia FineChemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。將這些pBR322「骨架」部分與一種合適的啟動子和所要表達的結構序列連接起來。利用pBR322(一種源自大腸桿菌的質粒(Bolivar等，《基因》295，1977))的衍生物典型地轉化大腸桿菌。pBR322含有氨苄青黴素和四環素抗性的基因，因此提供了用於鑑別被轉化細胞的簡便工具。
在重組微生物表達載體中通常所用的啟動子包括β-內醯胺酶(青黴素酶)和乳糖啟動子系統(Chang等，《自然》275615，1978；和Goeddel等，《自然》281544，1979)、色氨酸(trp)啟動子系統(Goeddel等，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)84057，1980；和歐洲專利申請36,776)和tac啟動子(Maniatis，《分子克隆實驗室指南》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，冷泉港實驗室，冷泉港，412頁，1982)。一種特別有用的細菌表達系統利用噬菌體λPL啟動子和cI857ts熱不穩定阻遏物。從美國典型培養物保藏中心(ATCC)獲得的連有λPL啟動子衍生物的質粒載體包括存在於大腸桿菌JMB9(ATCC 37092)中的質粒pHUB2和存在於大腸桿菌RR1(ATCC 53082)中的質粒pPLc28。
在酵母載體中合適的啟動子序列包括金屬硫蛋白的、3-磷酸甘油酸激酶的(Hitzeman等，《生物和化學雜誌》(J.Biol.Chem.)2552073，1980)或其它糖酵解的酶(Hess等，《高級酶註冊雜誌》(J.Adv.Enzyme Reg.)7149，1968；和Holland等，《生物化學》(Biochem)174900，1978)如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構酶、磷酸葡糖異構酶和葡糖激酶的啟動子。用在酵母表達中的適宜的載體和啟動子在R.Hitzeman等的歐洲專利申請73,657中有進一步描述。
可以利用來自pBR322的用於在大腸桿菌中篩選和複製的DNA序列(Ampr基因和複製起點)和包括一個葡萄糖可抑制ADH2啟動子和α-因子分泌前導序列的酵母DNA序列來組裝優選的酵母載體。ADH2啟動子已經由Russell等(《生物學和化學雜誌》2582674，1982)和Beier等(《自然》300724，1982)描述。可將指導異源性蛋白分泌的酵母α-因子前導序列插到啟動子和所要表達的結構基因之間(例如見Kurjan等，《細胞》(Cell)30933，1982；和Bitter等，《美國國家科學院進展》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)815330，1984)。前導序列可被修飾使之在靠近其3′末端處含有一個或多個有用的限制性酶切位點以利於前導序列與外源基因的融合。用於轉化脊椎動物細胞的表達載體中的轉錄和翻譯控制序列可由病毒來源的提供。例如，常用的啟動子和增強子源自多瘤病毒、腺病毒2、猴病毒40(SV40)和人巨細胞病毒。源自SV40病毒基因組的DNA序列，如SV40起點、早期和晚期啟動子、增強子、剪接和聚腺苷酸化位點可被用於提供表達一種外源DNA序列所需的其它遺傳學元件。早期和晚期啟動子因為都易於以一個還含有SV40病毒複製起點的片段從病毒獲得而特別有用(Fiers等，《自然》273113，1978)。只要包括從Hind III位點向位於病毒複製起點的Bgl II位點延伸的大約250bp的序列，則較小或較大的SV40片段也可使用。此外，只要這些控制序列與所選的宿主細胞相容，則可利用病毒基因組的啟動子、控制和/或信號序列。可按照Okayama和Berg，《分子細胞生物學》(Mol.Cell.Biol.)3280，1983所公布的構建典型的載體。
可基本按照Cosman等所描述的(《分子免疫學》(Mol.mmunol.)23935，1986)構建一種用於在C127小鼠乳腺上皮細胞中哺乳動物受體cDNA穩定高水平表達的有效系統。用於表達LbeIF4A蛋白DNA的一種優選的真核載體為pDC406(McMahan等，《歐洲分子生物學組織雜誌》(EMBOJ.)102821，1991)，而且包括源自SV40、人免疫缺陷病毒(HIV)和Epstein-Barr病毒(EBV)的調節序列。其它優選的載體包括pDC409和pDC410，它們都源自pDC406。pDC410是通過用編碼SV40大T抗原的序列置換EBV複製起點而從pDC406衍生來。pDC409與pDC406的不同之處在於缺失了一個位於多克隆位點外的Bgl II限制性酶切位點，使得在多克隆位點內的Bgl II位點成為單一位點。
一種允許含有EBV複製起點的表達載體，如pDC406和pDC409，游離型複製的有用的細胞係為CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478)。CV-1/EBNA細胞系是通過用一編碼Epstein-Barr病毒核抗原-I(EBNA-1)的基因轉染CV-1細胞系而獲得，並且組成性地表達由人CMV立即早期增強子/啟動子驅動的EBNA-1轉化的宿主細胞是已經用通過重組DNA技術構建的含有編碼一種本發明的HER-2/neu多肽的表達載體轉化或轉染的細胞。轉化的宿主細胞可以表達預期的HER-2/neu多肽，但為了克隆或擴增HER-2/neu DNA的目的而轉化的宿主細胞不需要表達HER-2/neu多肽。根據所選的DNA，表達的多肽優選被分泌到培養上清中，而且也可沉積在細胞膜上。
用於表達重組蛋白的合適的宿主細胞包括在適宜啟動子控制下的原核細胞、酵母或高等真核細胞。原核細胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌或芽胞桿菌。高等真核細胞包括按照下面的描述建立的昆蟲或哺乳動物起源的細胞系。利用由DNA結構得來的RNA也可用無細胞翻譯系統來製備HER-2/neu多肽。例如，用於細菌、真菌、酵母和哺乳動物細胞宿主的適宜的克隆和表達載體由Pouwels等，《克隆載體實驗室指南》(Cloning VectorsA Laboratory Manual)，Elsevier，NewYork，1985描述。
原核表達宿主可被用於不需要廣泛蛋白酶解和二硫鍵加工的HER-2/neu多肽的表達。原核表達載體一般包括一個或多個可篩選的表型標誌例如編碼傳遞抗生素抗性或提供自養需要的蛋白的基因和一個被宿主識別以保證在宿主內擴增的複製起點。雖然也可用其它宿主，但用於轉化的合適的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鼠傷寒沙門氏菌以及假單胞桿菌屬、鏈黴菌屬和葡萄球菌屬的各種菌。
重組的HER-2/neu多肽也可在酵母宿主中表達，優選來自酵母菌屬如釀酒酵母。還可以用其它屬的酵母如畢赤酵母或克羅維氏酵母屬。酵母載體一般含有一個來自2μ酵母質粒的複製起點或一個自主複製序列(ARS)、一個啟動子、編碼HER-2/neu多肽的DNA、用於聚腺苷酸化和轉錄終止的序列以及一篩選基因。酵母載體優選包括一個複製起點和允許轉化酵母和大腸桿菌的可篩選標誌，例如大腸桿菌的氨苄青黴素抗性基因和為在色氨酸中不能生長的酵母突變菌株提供了一個篩選標誌的釀酒酵母的trp1基因，以及源自一高度表達酵母基因來誘導下遊的結構基因轉錄的啟動子。在酵母宿主細胞基因組中trp1缺損的存在為在缺少色氨酸時通過生長檢測轉化提供了有效的環境。
本領域的技術人員了解合適的酵母轉化方法。由Hind等(《美國國家科學院進展》751929，1978)描述的一個典型的技術涉及在一由0.67％酵母氮鹼、0.5％酪蛋白胺基酸、2％葡萄糖、10mg/ml腺嘌呤和20mg/ml尿嘧啶組成的選擇性培養基中篩選Trp+轉化體。由含有ADH2啟動子的載體轉化的宿主菌株可以在一由1％酵母提取物、2％腖和1％葡萄糖組成的補加80mg/ml腺嘌呤和80mg/ml尿嘧啶的豐富培養基中生長進行表達。在培養基中的葡萄糖耗盡時，ADH2啟動子受到抑制。通過過濾收穫粗製酵母上清並在進一步純化前保持在4℃。
也可以利用各種哺乳動物或昆蟲細胞(如草地夜蛾或粉紋夜蛾)培養系統來表達重組多肽。例如用於在昆蟲細胞中製備外源性多肽的杆狀病毒系統由Luckow和Summers，《生物技術》(Bio/Technology)647，1988綜述。合適的哺乳動物宿主細胞系的例子包括由Gluzman(《細胞》(Ce11)23175，1981)描述的猴腎細胞COS-7細胞系和能夠表達一種適宜載體的包括如CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478)、L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、COS、NS-1、HeLa和BHK細胞系的其它細胞系。哺乳動物表達載體可含有非轉錄元件如一個複製起點、一個連接到要表達基因上的合適的啟動子和增強子、和其它5′或3′側翼非轉錄序列以及5′或3′非翻譯序列，如必要的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供者和受者位點以及轉錄終止序列。
可通過培養合適的宿主/載體系統以表達本發明的DNA的重組翻譯產物，然後從培養基或細胞提取物中將之純化來製備純化的HER-2/neu多肽。例如，取自將重組的多肽分泌入培養基中的系統的上清首先可以用一種商品化的蛋白質濃縮濾膜如一種Amicon或Millipore Pellicon超濾單位來濃縮。在濃縮步驟後，濃縮物可被注入一種合適的純化基質。例如，一種合適的親和基質可能含有一個對應的結構蛋白(即基於結構，HER-2/neu多肽以一種特異性的相互作用與之結合的蛋白質)或凝集素或結合於一合適載體的抗體分子。另外，可利用一種陰離子交換樹脂，例如具有側基二乙氨乙基(DEAE)基團的基質。基質可以為丙烯醯胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或在蛋白質純化中常用的其它類型。另外，可以利用一個陽離子交換步驟。合適的陽離子交換劑包括各種含有磺丙基或羧甲基基團的不可溶基質。優選磺丙基基團。凝膠過濾層析也提供了一種純化HER-2/neu的方法。
親和層析是一種優選的純化HHER-2/neu多肽的方法。例如，通過利用本領域所熟知的方法，抗HER-2/neu多肽的單克隆抗體在親和層析純化中可能也有用。
最後，利用疏水RP-HPLC介質(如，具有側基甲基或其它脂肪族基團的矽膠)的一次或多次反相高效液相色譜(RP-HPLC)步驟可被用來進一步純化HER-2/neu多肽。一些或所有的前述純化步驟以各種組合也可被用來提供一均質的重組多肽。
在細菌培養中產生的重組HER-2/neu多肽優選從細胞沉澱中通過初次提取來分離，隨後進行一個或多個濃縮、脫鹽、水性離子交換或大小排阻層析步驟。高效液相色譜(HPLC)可以用於最後純化步驟。可以通過任何方便的方法，包括凍溶循環、超聲處理、機械破壞或用細胞裂解劑來破壞在重組LbeIF4A蛋白表達中所用的微生物細胞。
以分泌蛋白形式表達HER-2/neu多肽的酵母的發酵大大地簡化了純化。由大規模發酵所獲的分泌的重組蛋白可通過與Urdal等(《層析雜誌》(J.Chromatog.)296171，1984)公布的那些方法類似的方法來純化。這個參考文獻描述了在一製備性HPLC柱上進行重組人GM-CSF純化的兩個順序的反相HPLC步驟。
在重組培養中合成的HER-2/neu多肽製備物可能含有依所採取的用來從培養中回收HER-2/neu的純化步驟所定的數量和特點的非HER-2/neu的細胞成分，包括蛋白質。這些成分通常是酵母、原核細胞或非人真核細胞來源的。這些製備典型地不含有在HER-2/neu蛋白來源的物種中天然發現它時可能與它正常相連的其它蛋白質。
自動合成為製備本發明的多肽提供了另一種方法。例如，可以利用任何商品化的固相技術如Merrifield固相合成方法，其中胺基酸被順序地加至一延伸的胺基酸鏈(見Merrifield，《美國化學會雜誌》(J.Am.Chem.Soc.)852149-2146，1963)。用於多肽自動合成的設備由供應商如Applied Biosystem，Inc.of Foster City，CA商業性提供，並且大體上可按製造商的指令來操作。
在本發明的一個方面中，可以檢測到用一種HER-2/neu多肽(或指導該多肽表達的DNA分子)來產生對HER-2/neu蛋白(包括表達在與HER-2/neu癌基因相關的惡性腫瘤表面的HER-2/neu蛋白)的免疫反應。這些惡性腫瘤的代表性例子包括乳腺癌、卵巢癌、直腸癌、肺癌和前列腺癌。一旦通過HER-2/neu多肽產生了一種對HER-2/neu蛋白的免疫反應，這種免疫反應變能夠長期存在，並且在免疫後的很長時間仍能檢測到，而不論在檢測時體內是否存在或缺乏該蛋白。一種經與HER-2/neu多肽反應而產生的對HER-2/neu蛋白的免疫反應可以通過測試CD4+或CD8+T細胞的特異性活化的存在或不存在或增強來檢測。更特別的是，將利用常規技術(如通過外周血淋巴細胞的Ficoll/Hypaque密度梯度離心)從一被免疫的個體分離的T細胞與HER-2/neu蛋白孵育。例如，可在體外37℃用HER-2/neu蛋白(典型地是5ug/ml的全蛋白或分級數量的合成HER-2/neu蛋白的細胞)孵育T細胞2-9天(典型地4天)。最好在缺少HER-2/neu蛋白的情況下孵育另一份T細胞樣品作為對照。
可以多種方式檢測CD4+或CD8+T細胞的特異性活化。用於檢測特異性T細胞活化的方法包括T細胞增殖檢測、細胞因子(例如淋巴因子)的產生或溶細胞活性的產生(即特異性針對HER-2/neu蛋白的細胞毒性T細胞的產生)。對於CD4+T細胞，用於檢測特異性T細胞活化的一種優選的方法是檢測T細胞的增殖。對於CD8+T細胞，用於檢測特異性T細胞活化的一種優選的方法是檢測溶細胞活性的產生。
T細胞增殖的檢測可以通過許多已知的技術來完成。例如，可以通過測定DNA合成率檢測T細胞的增殖。已被刺激增殖的細胞表現出增加的DNA合成率。例如測定DNA合成率的一個典型的方法是通過用氚化胸苷(一種摻入新合成DNA的核苷酸前體)脈衝標記培養T細胞。摻入的氚化胸苷的量可用一個液體閃爍分光光度計測定。檢測T細胞增殖的其它方法包括測定白細胞介素-2(IL-2)產生的增長、Ca2+流或染料攝取，如3-(4，5-二甲基噻唑-2-y1)-2，5-二苯基-四唑。另外，可測定淋巴因子(如γ幹擾素)的合成或者可以定量能對完整p185HER-2/neu蛋白發生反應的T細胞的相對數。
通過利用或表達HER-2/neu多肽，識別HER-2/neu蛋白的T細胞能夠在體內增殖。例如，一種用HER-2/neu肽來進行免疫的藥物(即如一種疫苗)可以誘導用於治療性攻擊抗HER-2/neu癌基因相關腫瘤所必需的T細胞在數量上的持續擴增。典型地，通過皮內、皮下或靜脈內途徑給予大約0.01ug/kg到大約100mg/kg體重。一個優選的劑量是大約1ug/kg到1mg/kg，特別優選大約5ug/kg到200ug/kg。對於本領域的技術人員來說顯然給藥的數量和頻率應依患者的反應而定。理想的是反覆地給予HER-2/neu多肽。對於本領域的技術人員來說顯然可以同時或順序地給予一種以上的HER-2/neu多肽。優選的用在進行免疫的藥物中的肽是那些包括序列號2中從大約在676號胺基酸位點上的賴氨酸殘基開始並延伸到大約在1255號胺基酸位點上的纈氨酸殘基的胺基酸序列的肽。本領域的技術人員將認識到，本發明考慮使用一種完整的HER-2/neu多肽和將該多肽分裂而成的多種肽。完整的p185HER-2/neu蛋白和具有其完整細胞外區的胺基酸序列的肽(即一種具有序列號2中從胺基酸位點1到胺基酸位點650的胺基酸序列的，加上或減去大約1到5個位點，並帶有或沒有前面21個胺基酸位點的肽)都未單獨用於免疫。
優選將HER-2/neu多肽(或核酸)配製成用於上述方法中的一種藥物組合物(如疫苗)。藥物組合物大體上含有聯合一種藥學可用的載體、賦形劑或稀釋劑的一種或多種多肽。這些載體在所用的劑量和濃度下應對受者無毒。也考慮與化療藥聯合應用一種EER-2/neu多肽。
除了HER-2/neu多肽外(發揮抗原的功能)，理想的是在疫苗中包括其它成分如抗原傳遞載體和設計用於提高蛋白質免疫原性的免疫刺激物。用於抗原傳遞的載體的例子包括鋁鹽、油包水乳劑、生物可降解油載體、水包油乳劑、生物可降解微囊和脂質體。免疫刺激物(佐劑)的例子包括N-乙醯胞壁醯-L-丙氨酸-D-異穀氨醯胺(MDP)、脂多糖(LPS)、葡聚糖、IL-12、GM-CSF、γ-幹擾素和IL-15。對本領域普通技術人員來說，顯然可合成製備或天然獲得用於疫苗的HER-2/neu多肽。
儘管在本發明的藥物組合物中可以使用本領域的普通技術人員所了解的任何合適的載體，但載體的類型根據給藥的方式和是否需要持續的釋放而變化。對於非腸道給藥，如皮下注射，載體優選包括水、鹽水、酒精、脂肪、蠟或緩衝液。對於口服給藥，可以使用上述的任何載體或一種固體載體，如甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。生物可降解微球(例如聚乳糖半乳糖苷)也可用作本發明藥物組合物的載體。例如，合適的生物可降解微球在美國專利號4,897,268和5,075,109中被公開。HER-2/neu多肽可被包在生物可降解微球中或連接在微球的表面。例如，在一優選的實施方案中，將具有序列號2中從676號胺基酸到l255號胺基酸的胺基酸序列的多肽包在一種生物可降解微球中。在這點上，微球優選大於大約25微米。
藥物組合物(包括疫苗)還可含有稀釋劑如緩衝液、抗氧化劑如抗壞血酸、低分子量(少於大約10個殘基)多肽、蛋白質、胺基酸、碳水化合物包括葡萄糖、蔗糖或糊精、螯合劑如EDTA、穀胱甘肽以及其它穩定劑和賦形劑。中性緩衝鹽水或與非特異的血清白蛋白混合的鹽水是典型適宜的稀釋劑。優選利用適宜的賦形劑溶液(如蔗糖)作為稀釋劑將產物製成一種凍乾物。
作為HER-2/neu多肽提呈的一種替換物，本發明包括能夠傳遞編碼一種HER-2/neu多肽的核酸分子的組合物。這些組合物包括重組病毒載體(例如，逆轉錄病毒(見WO 90/07936，WO 91/02805，WO 93/25234，WO93/25698和WO 94/03622)、腺病毒(見Berkner，《生物技術》(Biotechniques)6616-627，1988；Li等，《人基因治療》(Hum.Gene Ther.)4403-409，1993；Vincent等，《自然遺傳學》(Nat.Genet.)5130-134，1993；和Kolls等，《美國國家科學院進展》91215-219，1994)、痘病毒(見美國專利4,769,330號；美國專利5,017,487號；和WO 89/01973))、裸DNA(見WO 90/11092)、複合到一種聚陽離子分子上的核酸分子(見WO 93/03709)和結合於脂質體的核酸(見Wang等，《美國國家科學院進展》847851，1987)。在某些實施方案中，可將DNA連接至被殺死或滅活的腺病毒(見Curiel等，《人基因治療》3147-154，1992；Cotton等《美國國家科學院進展》896094，1992)。其它合適的組合物包括DNA-配體結合體(見Wu等，《生物學和化學雜誌》26416985-16987，1989)和脂質-DNA結合體(見Felgner等，《美國國家科學院進展》847413-7417，1989)。另外，通過將DNA包被在生物可降解珠表面可提高裸DNA被攝入細胞的效率。
除了直接體內方法，可以利用離體方法，在這個方法中細胞從一個動物體內取出、修飾並植入同一個或另一個動物。顯然，在離體方法中可以利用任何上面提到的組合物來將HER-2/neu核酸分子引入組織細胞。病毒的、物理的和化學的攝取方法是本領域眾所周知的。
相應地，本發明在患者或細胞培養中用於提高或引發一種細胞免疫反應(如，抗原特異性溶細胞T細胞的產生)是有效的。本文所用術語「患者」指任何溫血動物，優選為人。患者可以患有癌症，如乳腺癌，或者可以正常(即，沒有可檢測的疾病或感染)。「細胞培養」是任何T細胞或被分離的成分細胞(包括但不限於巨噬細胞、單核細胞、B細胞和樹突狀細胞)的製備物。這些細胞可通過被本領域普通技術人員所熟知的許多技術中的任何技術來(如Ficoll-hypaque密度梯度離心)分離。細胞可以(但不需要)從患有HER-2/neu相關惡性腫瘤的患者分離，並在處理後可被重新引入患者。
本發明還揭示HER-2/neu多肽除了對T細胞有免疫原性外，似乎刺激B細胞產生能夠識別HER-2/neu多肽的抗體。在包括血清和腹水的多種體液中可發現對HER-2/neu蛋白的特異性抗體(即表現一種大約107升/摩爾或更好的結合親和力)。簡言之，一種體液標本是從一溫血動物如人分離的，意在確定HER-2/neu多肽的特異性抗體是否存在。將體液和HER-2/neu多肽在一些條件下孵育並持續一段足以允許在多肽和針對蛋白的特異性抗體之間形成免疫複合物的時間。例如，可以將一種體液和HER-2/neu多肽在4℃孵育24-48小時。孵育後，檢測反應混合物中免疫複合物的存在。通過多種已知的技術如放射免疫分析(RIA)和酶聯免疫吸附測定(ELISA)進行在HER-2/neu多肽和針對HER-2/neu多肽的特異性抗體之間所形成的一種或多種免疫複合物的檢測。
合適的免疫檢測法包括David等的雙單克隆抗體夾心免疫測定技術(美國專利4,376,110)；單克隆-多克隆抗體夾心測定法(Wide等，Kirkham和Hunter編，《放射免疫分析方法》(RadioimmunoassayMethods)，E.and S.Livingstone，Edinburgh，1970)；Gordon等的「蛋白質印跡」方法(美國專利4,452,901)；標記配體的免疫沉澱(Brown等，《生物學和化學雜誌》2554980-4983，1980)；由例如Raines和Ross所描述的酶聯免疫吸附測定(《生物學和化學雜誌》2575154-5160，1982)；包括使用螢光染料的免疫細胞化學技術(Brooks等，《臨床試驗免疫學》(Clin.Exp.Immunol.)39477，1980)；和活性的中和作用〔Bowen-Pope等，《美國國家科學院進展》812396-2400(1984)〕，所有這些全部併入本文作為參考。除了上面描述的免疫檢測法，許多其它的免疫檢測法也可用，包括那些在美國專利號3,817,827；3,850,752；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；和4,098,876中所描述的方法，所有這些全部併入本文作為參考。
為了測定的目的，HER-2/neu多肽(「抗原」)可以是標記的或非標記的。當為非標記的時，抗原用在凝集檢測法中。另外，非標記的抗原可以和與免疫複合物有反應的標記的分子聯合使用，或者和與針對HER-2/neu多肽的抗體有反應的標記的抗體(二抗)如特異性針對免疫球蛋白的抗體聯合使用。或者，可以直接標記抗原。在所標記的之處，報導基團可以包括放射性同位素、螢光團、酶、發光物或染料顆粒。這些和其它的標記在本領域中是眾所周知的並且被描述，例如在下列的美國專利3,766,162；3,791,932；3,817,837；3,966,345；和4,233,402中。
典型地在一個ELISA檢測中，抗原被吸附於微量滴定孔的表面。然後用一種合適的試劑如牛血清白蛋白(BSA)、熱滅活正常山羊血清(NGS)或BLOTTO(也含有一種防腐劑、鹽和一種消泡劑的脫脂奶粉的緩衝溶液)來阻斷在表面殘留的蛋白質結合位點。然後用一可疑含有特異性抗體的標本對加樣孔進行孵育。標本可以利用純淨的，或者，更常用的是，它通常可被稀釋於一種含有少量(0.1％-5.0％重量)蛋白質如BSA、NGS或BLOTTO的緩衝溶液中。在孵育一段允許發生特異性結合的足夠長的時間後，衝洗加樣孔移走未結合的蛋白質，然後用由一報導基團標記的抗種特異性免疫球蛋白抗體孵育。報導基團可以選自多種酶，包括辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、鹼性磷酸酶和葡萄糖氧化酶。允許孵育足夠長的時間以便產生特異性結合，然後再一次衝洗加樣孔來移走未結合的偶聯物，並加入酶的底物。進行成色反應，並目測或用儀器測定加樣孔中內容物的光密度。
在本發明該方面的一個優選的實施方案中，將一種報導基團結合於HER-2/neu蛋白。檢測免疫複合物的步驟包括基本除去任何未結合的HER-2/neu蛋白，然後檢測報導基團的存在或不存在。
在另一優選的實施方案中，將一種報導基團結合於一種能夠與特異性針對HER-2/neu蛋白的抗體結合的二抗。檢測免疫複合物的步驟包括(a)基本除去任何未結合的抗體，(b)加入二抗，(c)基本除去任何未結合的二抗，然後(d)檢測報導基團的存在或不存在。特異性針對HER-2/neu蛋白的抗體源自人，二抗是抗人抗體的抗體。
在用於檢測免疫複合物的第三個優選的實施方案中，將一種報導基團結合於一種能夠與免疫複合物結合的分子。檢測的步驟包括(a)加入該分子，(b)基本除去任何未結合的分子，然後(c)檢測報導基團的存在或不存在。一個能夠結合於免疫複合物的分子的例子是蛋白A。
對於本領域的技術人員，在本發明中顯然可以使用多種檢測免疫複合物的方法。適於在任何方法中使用的報導基團包括放射性同位素、螢光團、酶、發光物和染料顆粒。
在本發明的一個相關方面，對於在HER-2/neu多肽和體液中特異性針對HER-2/neu多肽的抗體之間所形成的免疫複合物的檢測可以用於對與HER-2/neu癌基因相關的惡性腫瘤監測，包括HER-2/neu多肽的癌症治療的效果。可以通過上面所描述的方法對在治療前和治療開始後從個體所取的體液標本進行免疫複合物的分析。簡言之，將在兩種標本中所檢測的免疫複合物的量進行比較。第二個標本(治療開始後)中在免疫複合物數量上相對於第一個標本(治療前)的巨大變化反映成功的治療。
提供下面的實施例以求說明而不是為了限定。
實施例實施例1重組人HER-2/neu多肽的表達和純化通過PCR方法利用額外地在5′端引入一個BssH II限制性酶切位點和一個腸激酶蛋白酶位點以及在3′端引入一個EcoR I位點的寡核苷酸引物從按照Di Fiore等(King等，《科學》(Science)229974-976，1985；Di Fiore等，《科學》237178-182，1987)製備的質粒中回收人HER-2/neu多肽(如，美國專利4,683,195；4,683,202；4,800,159號)。5′端引物為5′-TCTGGCGCGCTGGATGACGATGACAAGAAACGACGGCAGCAGAAGATC-3′(序列號3)，而3′端引物為5′-TGAATTCTCGAGTCATTACACTGGCACGTCCAGACCCAG-3′(序列號4)。將所獲的1.8kb PCR片段亞克隆到來自Novagen(Madison，WI，USA)的T-載體中，並用重疊測序引物在ABI 373自動DNA測序儀(Applied Biosystem Inc.，Foster City，CA，USA)上測定所篩選的克隆的序列。然後將具有與公布的人HER-2/neu cDNA的DNA序列(序列號1；Coussens等，《科學》2301132，1985；Yamamoto等，《自然》319230，1986)一致的序列的PCR片段經BssH II位點以正確的閱讀框架連接至一個修飾過的大腸桿菌硫氧還蛋白還原酶上。將一個在所表達融合蛋白的Ni-NTA親和純化中所用的6X組氨酸親和標誌物摻入硫氧還蛋白還原酶融合夥伴中。為了在大腸桿菌中表達，將這種trxA-人HER-2/neu多肽融合蛋白的cDNA亞克隆至一個修飾過的pET表達載體中。
雖然硫氧還蛋白還原酶被報導可以使其它在大腸桿菌中表達的異源蛋白穩定和可溶，但它對人HER-2/neu多肽在大腸桿菌中的表達似乎沒有提供任何顯著的好處。雖然有顯著比例的trxA-HER-2/neu多肽融合蛋白是可溶的，但大部分都表達在包涵體中。在大腸桿菌中表達的過程中，融合蛋白也遭到降解。然而，硫氧還蛋白還原酶融合夥伴的存在可以在純化過程中使蛋白穩定。針對硫氧還蛋白還原酶的單克隆抗體的可用性在純化過程中為追蹤提供了一種方便的標誌物。
為純化人HER-2/neu多肽和含有6XHis親和標誌物的硫氧還蛋白還原酶融合夥伴，用蛋白酶抑制劑和溶菌酶重懸大腸桿菌沉澱並用超聲波處理。通過離心分離包涵體，並用脫氧膽酸鹽洗滌3次，最後一次洗滌過夜以除去LPS。為進行Ni純化將洗滌過的包涵體溶於GuHCl。在尿素中用咪唑洗脫Ni柱並以pH8的10mM Tris透析。利用這種方法回收的HER-2/neu多肽是以被降解的蛋白為主要汙染物的80％-95％純的全長蛋白。從500ml發酵液中回收20mg。它含有大於98％的HER-2/neu多肽。這裡所用的技術為本領域的人員所熟知，並在例如J.Sambrook等，《分子克隆實驗室指南》(第二版，冷泉港實驗室出版，1989，冷泉港，美國紐約)中被描述。
實施例2樹突狀細胞可以遞呈人HER-2/neu多肽A.來自骨髓的DC培養物的產生DC培養物由CD34+造血祖細胞(HPC)產生。用細胞分離系統CeprateLC試劑盒(CellPro，Bothell，WA，USA)從正常供者的骨髓中分離CD34+細胞。通過流式細胞術分析確定回收的CD34+細胞的純度為80％到95％。將CD34+細胞培養於補充有L-穀氨醯胺(584ug/l)、青黴素(10IU/ml)、鏈黴素(100ug/ml)、100ng/ml人rGM-CSF和50ng/ml人rIL-6的無血清培養基(X-VIVO 10，Biowhittaker，Inc.，Walkersville，MD，USA)中。在培養0到17天後，收穫細胞並用於表型檢測和T細胞刺激測試。已經報導單獨GM-CSF和與IL-4或TNFα聯合使用誘導DC的體外生長。在用KLH和OVA作為抗原來致敏幼稚T細胞的試驗中，與GM-CSF加IL-4或TNFα相比GM-CSF加IL-6持續產生一種類似的總刺激但卻具有較低的本底因而具有較高的刺激指數。
B.T細胞致敏測試將在含有GM-CSF和IL-6的無血清培養基中培養的骨髓來源的CD34+HPC經0-17天培養後用作APC。DC的致敏能力是通過將它們與自體的幼稚T淋巴細胞在蛋白抗原重組人HER-2/neu多肽(hHNP)(10ug/ml)存在或不存在的條件下培養來檢測的。利用免疫親和柱(CellPro，Inc.，Bothell，WA，USA)通過陽性選擇法從外周血單核細胞中分離CD4+T淋巴細胞。用一種直接偶聯至FITC(Immunotech，Westbrook，ME，USA)的抗CD45RA mAb通過流式細胞術分選法從CD4+T淋巴細胞中篩選CD4+CD45RA+(幼稚)T淋巴細胞。所獲CD4+CD45RA+T細胞的純度為99％。將DC培養物以各種濃度接種於圓底96孔板(Corning，Corning，NY，USA)中並與10ug/ml終濃度的hHNP孵育16-18小時。將抗原刺激的DC照射(10Gy)，並加入自體CD4+CD45RA+T淋巴細胞(5×104/孔)。通過對在第6天加入的(3H)胸苷(1uCi/孔)的16-18小時攝取量來測定T細胞的增殖反應。在無血清和無細胞因子培養液中進行增殖檢測。結果顯示在圖1中。圖2顯示來自一個正常供者的CD4+T細胞對hHNP的反應的測試結果。用取自10個正常個體中的9個的T細胞獲得類似的數據。
實施例3檢測低頻數淋巴細胞前體的測試法3種測試法可用於檢測CD4+反應一種標準的增殖測試法、一種低頻數事件篩選方法和一種有限稀釋測試法(LDA)。傳統的增殖測試法能夠很容易地檢測致敏反應。增殖反應刺激指數提供了一種與抗原反應性T細胞的前體頻數的粗略的相關性。由PBL檢測到的任何特異性增殖反應被認為是一種致敏反應。
為了提供一種對CD4+T細胞反應的更定量化的解釋，使用一種用於檢測低淋巴細胞前體頻數反應而發展的測試系統(下面描述的)。這種測試簡單而且經濟有效。在需要更精確的條件下，通過有限稀釋測試法證實前體的頻數(Bishop和Orosz，《移植》(Transplantation)47671-677，1989)。
比在正常個體中所檢測到的反應更強烈的反應被定義為一種致敏反應，並且它表明存在的免疫力。只有通過LDA條件才可檢測到的低的反應被認為是未致敏的反應。通過LDA而無反應或一種比通過正常群體分析所定義的反應低的反應被認為是耐受/無反應。
大體上，可以通過傳統的增殖測試法來檢測致敏的CD4+T細胞反應，而用同樣的方法則無法檢測未致敏的反應。包括對自身MHC抗原的自身混合淋巴細胞反應(AMLR)加上對加工過的自身血清蛋白和外源加入的血清蛋白的反應在內的複雜的本底胸苷攝取量限制了對少量未致敏T細胞的檢測。
為了引發和檢測未致敏T細胞，利用了一種基於Poisson取樣統計的低頻數反應測試系統(於Pinnacles，Chiron Corporation，11-2，1991)。這種類型的分析特異性地用於低頻事件，其中如果前體頻數低於在一個重複培養中的細胞數，則需要許多重複來檢測一種統計學上顯著的陽性數量。理論上，該測試法可通過設立一個已知的陽性對照(如PHA或破傷風類毒素)和已知的陰性對照(無抗原)並不考慮它們屬於哪個實驗組評價從最低到最高的所有數據點來糾正自身反應。基於等式截斷值＝M+(F+SD)計算截斷值，其中M＝算術均數，F＝3.29，一種來自所選標準化的正態分布表中的參數使在截斷值以上不超過0.1％的正態分布本底的「真陰性」，而SD＝標準差。在這種篩選測試法中，在截斷值以上的加樣孔被認為是可能含有一個對抗原的刺激發生特異性增殖的淋巴細胞的真陽性。雖然用這種方法對淋巴細胞前體頻數進行估計是可能的，但精確的測定需要正規的LDA分析。
實施例4HER-2/neu多肽為基礎的疫苗引起對HER-2/neu蛋白的免疫A.動物在本研究中所用的大鼠為Fischer系344(CDF(F-344)/CrlBR)(Charles River實驗室，Portage MI)。將動物在華盛頓大學的動物實驗室於無特異性病原體條件下飼養，並在3和4個月月齡之間常規進行實驗研究。
B.免疫用在多種佐劑(MPL，Vaccel；Ribi，Bozeman，MT，USA)中的重組大鼠HER-2/neu多肽(rHNP)免疫Fischer大鼠。在皮下給動物注射50ug與佐劑混合的rHNP。20天後將50ug rHNP以同樣的方式給藥，對動物用第二次免疫來加強。20天後測試加強免疫的動物中針對大鼠HER-2/neu蛋白(neu)的抗體的存在。
C.細胞系利用2個細胞系作為neu蛋白的來源。將SKBR3，一種顯著過度表達HER-2/neu的乳腺癌細胞系(美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD)維持在10％胎牛血清(FBS)(Gemini Bioproducts，Inc.，Calabasas，CA)和RPMI的培養物中。DHFR-G8，一種用cneu-p和pSV2-DHFR共轉染的NIH/3T3細胞系(美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD)被用作非轉化大鼠neu蛋白的來源(Bernards等，《美國國家科學院進展》846854-6858，1987)。將該細胞系維持在10％FBS和含有4.5g/L葡萄糖的Dulbecco′s改良的Eagle′s培養基中。DHFR-G8細胞在每3次傳代時用加有0.3μM氨甲蝶呤的相同的培養基傳代來維持neu轉染子。
D.細胞裂解液的製備製備SKBR3和DHFR-G8的裂解液，並將之用作neu蛋白的來源。簡言之，製備一種由tris鹼、氯化鈉和Triton-X(1％)pH7.5組成的裂解緩衝液。加入蛋白酶抑制劑抑蛋白酶(1ug/ml)、苯甲脒(1mM)和PMSF(1mM)。用1ml裂解緩衝液懸浮107細胞。將細胞每10分鐘旋振15秒持續1小時直至被裂解。所有的步驟均在一個4℃房間中於冰上進行。裂解後4℃微離心細胞20分鐘。從細胞碎片中移走上清，並以小份儲存於-70℃備用。通過蛋白質印跡分析確定在裂解液中人和大鼠neu的存在。E.ELISA檢測大鼠neu抗體反應將96孔Immulon 4板(Baxter SP，Redmond，WADynatechLaboratorie)於4℃用在碳酸鹽鹽緩衝液(等摩爾濃度的Na2CO3和NaHCO3，pH9.6)中稀釋的濃度為10ug/ml的大鼠neu特異性單克隆抗體孵育過夜。孵育後，在室溫用PBS-1％BSA(Sigma Chemical，St.Louis，MO，USA)100ul/孔將所有加樣孔封閉3小時，用PBS-0.5％Tween衝洗培養板並在交替的行中加入一種大鼠neu蛋白的來源DHFR-G8，一種用大鼠neu DNA轉染的小鼠細胞系(美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD，USA)，的裂解液。將培養板於4℃孵育過夜。然後用PBS-0.5％Tween衝洗培養板並以下列的稀釋度1∶25到1∶200加入實驗血清。將血清稀釋於PBS-1％BSA-1％FBS-25ug/ml小鼠IgG-0.01％NaN3中然後序列地稀釋於PBS-1％BSA。在每孔加入50ul稀釋的血清並於室溫孵育1小時。將每種實驗血清加入含有和不含有大鼠neu的加樣孔中。將羊抗大鼠IgF(ab′)2辣根過氧化物酶(HRP)在PBS-1％BSA中以1∶5000稀釋度加入加樣孔並於室溫孵育45分鐘(Amersham Co，Arlington Heights，1L，USA)。經最後衝洗後，加入TMB(Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)顯色試劑。在450nm的光密度下讀取成色反應。以大鼠neu包被的加樣孔的OD減去PBS-1％BSA包被的加樣孔的OD計算每種血清稀釋度的OD。也以類似的方式評價來源於單獨用佐劑免疫的動物和用hHNP(外源蛋白)免疫的動物的血清。結果顯示在圖3中。
F.T細胞增殖測試為測試HER-2/neu多肽特異性反應通過機械破碎和線網過濾以及洗滌來收穫新鮮的脾和淋巴結細胞。將2×105脾細胞/孔和1×105淋巴結細胞/孔以每個實驗組重複6次接種於96孔圓底微量滴定板中(Corning，Corning，NY)。培養基由含L-穀氨醯胺的EHAA 120(Biofluids)、青黴素/鏈黴素、2-巰基乙醇和5％FBS組成。將細胞與多肽孵育。4天後，用1μCi的[3H]胸苷將加樣孔脈衝6-8小時並計數。數據由一種被定義為實驗孔的均值除以對照孔(無抗原)的均值的刺激指數(SI)來表示。為測試HER-2/neu蛋白特異性反應培養脾或淋巴結細胞進行3次體外刺激。在測試時，如上所述將1×105培養的脾或淋巴結T細胞接種於96孔微量滴定板中。用1ug/ml免疫親和柱純化的大鼠neu(來自作為大鼠neu來源的DHFR-G8細胞)孵育細胞。4天後，用1uCi的[3H]胸苷將加樣孔脈衝6-8小時並計數。數據由一種被定義為實驗孔的均值除以對照孔(無抗原)的均值的刺激指數來表示。
實施例5在乳腺癌患者中可以檢測到對人HER-2/neu多肽的致敏反應從患有II期HER-2/neu過度表達乳腺癌的患者獲得肝素化的血。通過Ficoll Hypaque密度離心分離外周血單核細胞(PBMC)。將PBMC以2×105/孔的濃度接種於96孔圓底板(Corning，Corning，NY，USA)中。每個實驗組進行24孔的重複。在每個24重複孔中加入由HER-2/neu衍生的肽(帶有在所列的序列中第一個胺基酸號的長度為15-20個胺基酸)組成的抗原25ug/ml、人HER-2/neu多肽(hHNP)1ug/ml、破傷風類毒素1ug/ml和一種來自破傷風的肽p30 25ug/ml。在含有10％人血清的培養基中進行測試。通過在第4天加入的(3H)胸苷(1μCi/孔)的10小時攝取量來測定T細胞的增殖反應。如果cpm大於無抗原孔的均值和3倍標準差，則陽性孔，抗原反應孔，被計數為陽性。結果顯示於圖4中。該II期乳腺癌患者對重組hHNP具有顯著的反應。
從前面的描述中，顯然雖然為了說明此中已經描述了本發明的特定實施方案，但是可以進行各種修飾而不偏離本發明的精神和範圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人華盛頓大學(ii)發明題目用於引發或提高對HER-2/neu蛋白的免疫活性以預防或治療與HER-2/neu癌基因相關的惡性腫瘤的化合物(iii)序列數4(iv)聯繫地址(A)收信人Seed和Berry LLP(B)街6300哥倫比亞中心，第五大街701(C)城市西雅圖(D)州華盛頓(E)國家美國(F)由編98104-7092(V)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體Patent In Release#1.0，版本#1.30(vi)本申請資料(A)申請號(B)申請日期1996年3月28日
(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Sharky，Richard G.
(B)註冊號32,629(C)參考/案卷號920010.448PC(ix)通訊信息(A)電話(206)622-4900(B)傳真(206)682-6031(2)序列號1的資料(i)序列特徵(A)長度3768個鹼基(B)類型核酸(C)成鏈類型單鏈(D)拓撲結構線性(ix)特徵(A)名字/解釋(KEY)CDS(B)位置1..3765(xi)序列描述序列號1
ATG GAG CTG GCG GCC TTG TGC CGC TGG GGG CTC CTC CTC GCC CTC TTG48Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu1 5 10 15CCC CCC GGA GCC GCG AGC ACC CAA GTG TGC ACC GGC ACA GAC ATG AAG96Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys20 25 30CTG CGG CTC CCT GCC AGT CCC GAG ACC CAC CTG GAC ATG CTC CGC CAC144Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His35 40 45CTC TAC CAG GGC TGC CAG GTG GTG CAG GGA AAC CTG GAA CTC ACC TAC192Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr50 55 60CTG CCC ACC AAT GCC AGC CTG TCC TTC CTG CAG GAT ATC CAG GAG GTG240Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val65 70 75 80CAG GGC TAC GTG CTC ATC GCT CAC AAC CAA GTG AGG CAG GTC CCA CTG288Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu85 90 95CAG AGG CTG CGG ATT GTG CGA GGC ACC CAG CTC TTT GAG GAC AAC TAT336Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr100 105 110GCC CTG GCC GTG CTA GAC AAT GGA GAC CCG CTG AAC AAT ACC ACC CCT384Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro115 120 125GTC ACA GGG GCC TCC CCA GGA GGC CTG CGG GAG CTG CAG CTT CGA AGC432Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser130 135 140CTC ACA GAG ATC TTG AAA GGA GGG GTC TTG ATC CAG CGG AAC CCC CAG480Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln145 150 155 160CTC TGC TAC CAG GAC ACG ATT TTG TGG AAG GAC ATC TTC CAC AAG AAC528Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn165 170 175AAC CAG CTG GCT CTC ACA CTG ATA GAC ACC AAC CGC TCT CGG GCC TGC576Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys180 185 190
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TTT GGA CCG GAG GCT GAC CAG TGT GTG GCC TGT GCC CAC TAT AAG GAC 1776Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp580 585 590CCT CCC TTC TGC GTG GCC CGC TGC CCC AGC GGT GTG AAA CCT GAC CTC 1824Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu595 600 605TCC TAC ATG CCC ATC TGG AAG TTT CCA GAT GAG GAG GGC GCA TGC CAG 1872Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln610 615 620CCT TGC CCC ATC AAC TGC ACC CAC TCC TGT GTG GAC CTG GAT GAC AAG 1920Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys625 630 635 640GGC TGC CCC GCC GAG CAG AGA GCC AGC CCT CTG ACG TCC ATC ATC TCT 1968Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser645 650 655GCG GTG GTT GGC ATT CTG CTG GTC GTG GTC TTG GGG GTG GTC TTT GGG 2016Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly660 665 670ATC CTC ATC AAG CGA CGG CAG CAG AAG ATC CGG AAG TAC ACG ATG CGG 2064Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg675 680 685AGA CTG CTG CAG GAA ACG GAG CTG GTG GAG CCG CTG ACA CCT AGC GGA 2112Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly690 695 700GCG ATG CCC AAC CAG GCG CAG ATG CGG ATC CTG AAA GAG ACG GAG CTG 2160Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu705 710 715 720AGG AAG GTG AAG GTG CTT GGA TCT GGC GCT TTT GGC ACA GTC TAC AAG 2208Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys725 730 735GGC ATC TGG ATC CCT GAT GGG GAG AAT GTG AAA ATT CCA GTG GCC ATC 2256Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile740 745 750AAA GTG TTG AGG GAA AAC ACA TCC CCC AAA GCC AAC AAA GAA ATC TTA 2304Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu755 760 765
GAC GAA GCA TAC GTG ATG GCT GGT GTG GGC TCC CCA TAT GTC TCC CGC 2352Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg770 775 780CTT CTG GGC ATC TGC CTG ACA TCC ACG GTG CAG CTG GTG ACA CAG CTT 2400Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu785 790 795 800ATG CCC TAT GGC TGC CTC TTA GAC CAT GTC CGG GAA AAC CGC GGA CGC 2448Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg805 810 815CTG GGC TCC CAG GAC CTG CTG AAC TGG TGT ATG CAG ATT GCC AAG GGG 2496Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly820 825 830ATG AGC TAC CTG GAG GAT GTG CGG CTC GTA CAC AGG GAC TTG GCC GCT 2544Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala835 840 845CGG AAC GTG CTG GTC AAG AGT CCC AAC CAT GTC AAA ATT ACA GAC TTC 2592Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe850 855 860GGG CTG GCT CGG CTG CTG GAC ATT GAC GAG ACA GAG TAC CAT GCA GAT 2640Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp865 870 875 880GGG GGC AAG GTG CCC ATC AAG TGG ATG GCG CTG GAG TCC ATT CTC CGC 2688Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg885 890 895CGG CGG TTC ACC CAC CAG AGT GAT GTG TGG AGT TAT GGT GTG ACT GTG 2736Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val900 905 910TGG GAG CTG ATG ACT TTT GGG GCC AAA CCT TAC GAT GGG ATC CCA GCC 2784Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala915 920 925CGG GAG ATC CCT GAC CTG CTG GAA AAG GGG GAG CGG CTG CCC CAG CCC 2832Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro930 935 940CCC ATC TGC ACC ATT GAT GTC TAC ATG ATC ATG GTC AAA TGT TGG ATG 2880Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met945 950 955 960
ATT GAC TCT GAA TGT CGG CCA AGA TTC CGG GAG TTG GTG TCT GAA TTC 2928Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe965 970 975TCC CGC ATG GCC AGG GAC CCC CAG CGC TTT GTG GTC ATC CAG AAT GAG 2976Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu980 985 990GAC TTG GGC CCA GCC AGT CCC TTG GAC AGC ACC TTC TAC CGC TCA CTG 3024Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu995 10001005CTG GAG GAC GAT GAC ATG GGG GAC CTG GTG GAT GCT GAG GAG TAT CTG 3072Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu101010151020GTA CCC CAG CAG GGC TTC TTC TGT CCA GAC CCT GCC CCG GGC GCT GGG 3120Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly1025103010351040GGC ATG GTC CAC CAC AGG CAC CGC AGC TCA TCT ACC AGG AGT GGC GGT 3168Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly104510501055GGG GAC CTG ACA CTA GGG CTG GAG CCC TCT GAA GAG GAG GCC CCC AGG 3216Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg106010651070TCT CCA CTG GCA CCC TCC GAA GGG GCT GGC TCC GAT GTA TTT GAT GGT 3264Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly107510801085GAC CTG GGA ATG GGG GCA GCC AAG GGG CTG CAA AGC CTC CCCAsp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His109010951100GAC CCC AGC CCT CTA CAG CGG TAC AGT GAG GAC CCC ACA GTA CCC CTG 3360Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu1105111011151120CCC TCT GAG ACT GAT GGC TAC GTT GCC CCC CTG ACC TGC AGC CCC CAG 3408Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln112511301135CCT GAA TAT GTG AAC CAG CCA GAT GTT CGG CCC CAG CCC CCT TCG CCC 3456Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro114011451150
CGA GAG GGC CCT CTG CCT GCT GCC CGA CCT GCT GGT GCC ACT CTG GAA 3504Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu115511601165AGG CCC AAG ACT CTC TCC CCA GGG AAG AAT GGG GTC GTC AAA GAC GTT 3552Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val117011751180TTT GCC TTT GGG GGT GCC GTG GAG AAC CCC GAG TAC TTG ACA CCC CAG 3600Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln1185119011951200GGA GGA GCT GCC CCT CAG CCC CAC CCT CCT CCT GCC TTC AGC CCA GCC 3648Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala120512101215TTC GAC AAC CTC TAT TAC TGG GAC CAG GAC CCA CCA GAG CGG GGG GCT 3696Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala122012251230CCA CCC AGC ACC TTC AAA GGG ACA CCT ACG GCA GAG AAC CCA GAG TAC 3744Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr123512401245CTG GGT CTG GAC GTG CCA GTG TGA 3768Leu Gly Leu Asp Val Pro Val12501255
(2)序列號2的資料(i)序列特徵(A)長度1255個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述序列號2Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu1 5 10 15Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys20 25 30Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His35 40 45Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr50 55 60Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val65 70 75 80Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr100 105 110Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro115 120 125Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser130 135 140Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln145 150 155 160Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn165 170 175Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys180 185 190His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser195 200 205Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys210 215 220Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys225 230 235 240Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu245 250 255His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val260 265 270Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg275 280 285Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu290 295 300Ser Thr Asp Vel Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln305 310 315 320Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu340 345 350Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys355360 365Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe AsP Gly Asp370 375 380Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe385 390 395 400Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro405 410 415Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg420 425 430Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu435 440 445Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly450 455 460Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val465 470 475 480Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr485 490 495Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His500 505 510Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys515 520 525Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys530 535 540Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys545 550 555 560Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys565 570 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp580 585 590Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu595 600 605Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln610 615 620Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys625 630 635 640Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser645 650 655Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly660 665 670Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg675 680 685Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly690 695 700Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu705 710 715 720Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys725 730 735Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile740 745 750Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu755 760 765Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg770 775 780Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu785 790 795800Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg805 810 815
Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly820 825 830Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala835 840 845Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe850 855 860Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp865 870 875 880Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg885 890 895Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val900 905 910Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala915 920 925Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro930 935 940Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met945 950 955 960Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe965 970 975Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu980 985 990Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu995 10001005Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu101010151020Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly1025103010351040Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly104510501055
Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg106010651070Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly107510801085Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His109010951100Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu1105111011151120Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln112511301135Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro114011451150Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu115511601165Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val117011751180Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln1185119011951200Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala120512101215Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala122012251230Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr123512401245Leu Gly Leu Asp Val Pro Val1250 1255
(2)序列號3的資料(i)序列特徵(A)長度48個鹼基(B)類型核酸(C)成鏈類型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述序列號3TCTGGCGCGC TGGATGACGA TGACAAGAAA CGACGGCAGC AGAAGATC48(2)序列號4的資料(i)序列特徵(A)長度39個鹼基(B)類型核酸(C)成鏈類型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述序列號4TGAATTCTCG AGTCATTACA CTGGCACGTC CAGACCCAG 39
權利要求
1.用於產生T細胞應答的組合物，其中包含佐劑以及由選自下組的DNA序列編碼的多肽(a)SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸；和(b)在中等嚴謹條件下與和SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸互補的核苷酸序列可雜交的DNA序列，該DNA序列編碼可產生針對HER-2/neu蛋白的免疫應答的多肽，前提條件是該多肽不是完整HER-2/neu蛋白。
2.權利要求1的組合物，其中所述多肽具有SEQ ID NO2的從第676位胺基酸至第1255位胺基酸的胺基酸序列。
3.權利要求2的組合物，其中所述多肽是截短的。
4.權利要求3的組合物，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
5.權利要求1的組合物，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
6.權利要求1-5中任一項的組合物在製備用於免疫溫血動物以抗與HER-2/neu癌基因相關的惡性腫瘤的藥物中的用途。
7.通過用核酸分子與佐劑聯合轉染溫血動物細胞用於免疫的核酸分子組合物，所述核酸分子指導由選自下組的DNA序列編碼的多肽的表達(a)SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸；和(b)在中等嚴謹條件下與和SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸互補的核苷酸序列可雜交的DNA序列，該DNA序列編碼可產生針對HER-2/neu蛋白的免疫應答的多肽，前提條件是該多肽不是完整HER-2/neu蛋白。
8.核酸分子與佐劑聯合在製備通過轉染溫血動物細胞用於免疫溫血動物以抗與HER-2/neu癌基因相關的惡性腫瘤的藥物中的用途，其中所述核酸分子指導由選自下組的DNA序列編碼的多肽的表達(a)SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸；和(b)在中等嚴謹條件下與和SEQIDNO1的第2026-3765位核苷酸互補的核苷酸序列可雜交的DNA序列，該DNA序列編碼可產生針對HER-2/neu蛋白的免疫應答的多肽，前提條件是該多肽不是完整HER-2/neu蛋白。
9.核酸分子與佐劑聯合在製備用於免疫溫血動物以抗與HER-2/neu癌基因相關的惡性腫瘤的藥物中的用途，其中所述核酸分子指導由選自下組的DNA序列編碼的多肽的表達(a)SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸；和(b)在中等嚴謹條件下與和SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸互補的核苷酸序列可雜交的DNA序列，該DNA序列編碼可產生針對HER-2/neu蛋白的免疫應答的多肽，前提條件是該多肽不是完整HER-2/neu蛋白。
10.通過病毒載體與佐劑聯合感染溫血動物細胞用於免疫的病毒載體，所述病毒載體指導由選自下組的DNA序列編碼的多肽的表達(a)SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸；和(b)在中等嚴謹條件下與和SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸互補的核苷酸序列可雜交的DNA序列，該DNA序列編碼可產生針對HER-2/neu蛋白的免疫應答的多肽，前提條件是該多肽不是完整HER-2/neu蛋白。
11.病毒載體與佐劑聯合在製備通過轉染溫血動物細胞用於免疫溫血動物以抗與HER-2/neu癌基因相關的惡性腫瘤的藥物中的用途，其中所述病毒載體指導由選自下組的DNA序列編碼的多肽的表達(a)SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸；和(b)在中等嚴謹條件下與和SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸互補的核苷酸序列可雜交的DNA序列，該DNA序列編碼可產生針對HER-2/neu蛋白的免疫應答的多肽，前提條件是該多肽不是完整HER-2/neu蛋白。
12.病毒載體與佐劑聯合在製備用於免疫溫血動物以抗與HER-2/neu癌基因相關的惡性腫瘤的藥物中的用途，其中所述病毒載體指導由選自下組的DNA序列編碼的多肽的表達(a)SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸；和(b)在中等嚴謹條件下與和SEQ ID NO1的第2026-3765位核苷酸互補的核苷酸序列可雜交的DNA序列，該DNA序列編碼可產生針對HER-2/neu蛋白的免疫應答的多肽，前提條件是該多肽不是完整HER-2/neu蛋白。
13.權利要求1-5中任一項的組合物在製備可用於激發或增強針對HER-2/neu蛋白的免疫應答的藥物中的用途。
14.權利要求7的核酸分子在製備可用於激發或增強針對HER-2/neu蛋白的免疫應答的藥物中的用途。
15.權利要求7的核酸分子，其中所述多肽具有SEQ ID NO2的從第676位胺基酸-賴氨酸至第1255位胺基酸-纈氨酸的胺基酸序列。
16.權利要求13的核酸分子，其中所述多肽是截短的。
17.權利要求16的核酸分子，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
18.權利要求7的核酸分子，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
19.權利要求8或9的核酸分子的用途，其中所述多肽具有SEQ ID NO2的從第676位胺基酸-賴氨酸至第1255位胺基酸-纈氨酸的胺基酸序列。
20.權利要求19的核酸分子的用途，其中所述多肽是截短的。
21.權利要求20的核酸分子的用途，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
22.權利要求8或9的核酸分子的用途，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
23.權利要求10的病毒載體在製備可用於激發或增強針對HER-2/neu蛋白的免疫應答的藥物中的用途。
24.權利要求10的病毒載體，其中所述多肽具有SEQ ID NO2的從第676位胺基酸-賴氨酸至第1255位胺基酸-纈氨酸的胺基酸序列。
25.權利要求24的病毒載體，其中所述多肽是截短的。
26.權利要求25的病毒載體，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
27.權利要求10的病毒載體，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
28.權利要求11或12的病毒載體的用途，其中所述多肽具有SEQ ID NO2的從第676位胺基酸-賴氨酸至第1255位胺基酸-纈氨酸的胺基酸序列。
29.權利要求28的病毒載體的用途，其中所述多肽是截短的。
30.權利要求29的病毒載體的用途，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
31.權利要求11或12的病毒載體的用途，其中所述多肽與肽或多肽相連接。
全文摘要
本發明公開了用於引發和提高對HER－2/neu蛋白的免疫反應性的化合物和組合物。這些化合物包括多肽和編碼該多肽的核酸分子。這些化合物可被用於預防或治療與HER－2/neu癌基因相關的惡性腫瘤。
文檔編號A61K38/10GK1951398SQ20061009991
公開日2007年4月25日 申請日期1996年3月28日 優先權日1995年3月31日
發明者M·A·切夫, M·L·狄希斯 申請人:華盛頓大學