絲狀真菌中dna表達文庫的高通量篩選的製作方法

2023-10-17 22:17:39 2

專利名稱：絲狀真菌中dna表達文庫的高通量篩選的製作方法
絲狀真菌中DNA表達文庫的高通量篩選發明概述本發明提供了一種在絲狀真菌宿主中表達和後繼篩選DNA文庫，尤其是合成文庫、基因組文庫和cDNA文庫的方法。該系統採用轉化或轉染的絲狀真菌，這些真菌在深層培養中通過諸如有效的孢子形成等途徑產生可轉移的複製單元。這些真菌優選表現這樣一種形態，即很少或不形成糾纏的菌絲體。其中更為優選的菌株還能表達可分離量的外源蛋白，用於評測。本發明的突變的真菌菌株由於產生可轉移的複製單元、可高水平的表達外源基因、以及非常低的培養粘度，因此它們非常適合高通量的篩選技術。
背景技術：
天然微生物種群表現廣泛的生化和代謝多樣性。由於許多微生物的分離和培養非常困難，這些微生物中大量有潛在價值的蛋白質和多肽不能被發現。事實上，據估計目前全世界只有不到的微生物被分離和培養。發明新的方法從未被認知乃至已被分離的微生物中分離蛋白質、多肽和代謝物仍然是一個迫切的需求。(術語「蛋白質」在後面的文章中應被理解為包括蛋白質和多肽。)鑑定和分離編碼這些蛋白質的基因，從而能修飾和/或生產這些蛋白質也是人們所需要的。Short在美國專利5938672、6001574、6030779和6057103(它們的內容通過參考合併到本發明中)中闡述了解決這一問題的一個途徑。在該方法中，他們直接從環境樣品(如土樣)中製備了基因組DNA文庫，而沒有試圖從中分離或培養任何可能存在的生物。該文庫在大腸桿菌中被表達，並從獲得資源甚至純粹興趣的角度篩選表達的蛋白。Short暗示， 但沒有明確論述或肯定在該方法中使用了真菌宿主細胞。上述方法有許多重大缺陷，其中之一就是大腸桿菌不能有效地表達有內含子的基因。土壤中大約90%的物種是真核生物(主要是真菌)，因此其中大部分生物的基因組 DNA中有內含子。雖然已經發現的真菌有大約10萬種，但是估計大約有100萬種真菌仍未被發現(B. Kendrick，《第五界》，Mycologue出版社，1999)，真菌基因組編碼蛋白質和代謝物的潛在多樣性遠比已知的真菌高，但是由於內含子的存在，使得絕大部分真菌特有蛋白和代謝物不能在細菌表達系統中有效表達。不僅許多種酶類(例如分泌形真菌木質素過氧化物酶和錳依賴型過氧化物酶)是真菌特有的，而且有許多真菌蛋白，包括酶類(例如木質素過氧化物酶和黑麴黴蔗糖酶)是糖基化的；但是如果這些蛋白在大腸桿菌中表達就不能被糖基化。由於真菌基因組的數量大，長度和複雜度非常高，許多蛋白是真菌特有的，並且許多真菌蛋白都要進行糖基化，所有這些都表明，如果將給定的環境微生物樣品的基因組DNA 在細菌中進行表達，能被細菌識別並正確表達的微生物蛋白和代謝物的豐度不超過10%。部分由於愛滋病的蔓延和接受器官移植的人數量的增加，越來越多的人受到免疫損害或免疫抑制，導致真菌感染的數量和種類穩步增長(《傳染病醫學雜誌》16 :380-382， 385-386(1999))。因此正在進行的研製新抗真菌藥的過程中需要分離和鑑定來自致病真菌的蛋白質，而這又需要有篩選來源於真菌基因組的DNA文庫的能力。由於真菌基因組中內含子的存在，使得在目前已知的絕大多數細菌宿主細胞中表達這些文庫變得非常困難。同樣，由于越來越多的細菌感染對抗生素產生抗藥性，也需要對有抗生素活性的真菌代謝物進行高通量篩選。真核生物的基因組太複雜，以至於不能在細菌中完全表達其DNA文庫。如果算上所有的真核生物，細菌只代表所有已知物種的0.3% (E.O.Wilson，「生物多樣性的現狀〃，《生物多樣性》，國家學術出版社，華盛頓特區，1988，第一章)；因而能在細菌中表達的全世界基因多樣性是極其有限的。為了避免內含子的問題，可以構建cDNA文庫在細菌中表達。但是這種方法必須有轉錄產物RNA的存在，而任何當時未被活躍轉錄的基因都不會出現在該文庫中。而許多我們需要的蛋白只在特定條件下才表達(例如致病真菌中的毒性因子)，並且不一定在收穫 mRNA時存在。而且，為了獲得足夠量的RNA構建DNA文庫，需要培養大量的菌體。對於環境樣品中不易培養的生物，或者新的適宜培養條件還未找到的微生物而言，獲得大量的RNA 是困難或不可靠的。相比之下，通過很少量的單個細胞，採用隨機引物或適合某一類基因的引物進行PCR擴增，就能獲得足夠的基因組DNA。最後，在某個生物體中表達量高的基因也會導致其mRNA的超量合成，而在基因文庫中，它的超量合成是以掩蓋一些微量表達的基因為代價的。如果是構建cDNA文庫而不是基因組文庫，為了包括儘可能多的現存mRNA種類， 必須要篩選多得多的克隆，因為後者更能均衡地代表現存的基因種類。顯然，如果可能的話，人們更願意構建基因組DNA文庫。並且，大腸桿菌不能將許多蛋白質分泌出來，這對於用於篩選目的，而篩選依賴於宿主細胞將外源基因產物分泌到胞外的宿主細胞是一個缺陷。對於大腸桿菌和所有細菌宿主細胞來說，另一個缺陷是，許多真核生物蛋白需要多種翻譯後加工以獲得活性，而細菌不能對它們進行翻譯後加工。除了糖基化，亞基切分、二硫鍵形成和蛋白的正確摺疊是生成有活性蛋白所常需的翻譯後加工的範例。為了保證這些翻譯後加工，有時可以利用哺乳動物細胞，但是這些細胞很難培養， 需要昂貴的培養基，並且不總是能高效地轉化外源基因。雖然科學家們努力嘗試用哺乳動物細胞做CDNA文庫篩選的宿主(Schouten et al. , WO 99/64582)，但這種轉化系統顯然不適合蛋白質的高通量篩選。一種在文庫篩選前將轉化的原生質體與哺乳動物細胞融合的方法已被報導(美國專利5，989，814)，但是細菌或酵母細胞中蛋白質文庫的表達發生在細胞融合之前。有人試圖用酶在宿主細胞表達外源蛋白後對蛋白的糖基化方式進行改造(Meynial-salles 和 Combes，J. Biotechnol. ,46 1-14(1996)),但是這種方法必須針對不同的蛋白而改變，並且不適用於從DNA文庫中表達蛋白。在更近一些時候，Maras et al.，Eur. J. Biochem.，249 :701-707(1997)(又見美國專利 5，834，251)報導一株裡氏木黴 (Trichoderma reesei)基因工程菌表達人類乙醯糖苷(GlcNAc)轉移酶I。該酶將所表達的其它外源基因的N-乙醯葡萄糖苷轉化為甘露糖殘基，這是向有天然活性的哺乳動物蛋白邁進的第一步。用酵母作為宿主細胞解決了上述的一些問題，但卻引入了新的問題。酵母傾向於過度糖基化外源蛋白質(Bretthauer 和 Castellino, 1999，Biotechnol. Appl. · Biochem. 30 :193-200)，而由於糖基化方式的改變，常使得表達的哺乳動物蛋白質具有高抗原性(C. Ballou, Molecular Biology of the yeast saccharomyces (酵母的分子生物學)，J. Strathern et al.，eds.，Cold Spring Habor Laboratory Press, NY, 1982, 335-360)。雖然酵母可以應付少數一些內含子，但是它們基本上不能處理從高等物種，比如脊椎動物的複雜基因。即使來自絲狀真菌的基因對於酵母來說也太複雜以至不能有效地轉錄，再加上酵母和絲狀真菌的表達和基因拼接序列不同，使這一問題變得更加複雜(參見例如M. hnis et al.，Science 1985,228:21-26)。儘管有這些缺點，酵母轉化和表達體系還是被廣泛地開發，主要用作cDNA文庫的表達。人們開發酵母表達系統，用來篩選源自哺乳動物的自然分泌蛋白和膜蛋白(Klein，et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93: 7108-7113 ；Treco，美國專利 5，783，385)，異源的真菌蛋白(Dalboge 和 Heldt-Hansen，Mol. Gen. Genet. 243 :253-260 (1994))，和哺乳動物蛋白(Tekamp-Olson 和 Meryweather，美國專利 6，017，731)。術語「酵母」在本文酵母表達系統部分中是指分類上屬於酵母目的生物，例如釀酒酵母和巴斯德畢赤氏酵母。為了明確上述定義，術語「真菌」和「真菌的」應被理解為擔子菌綱、結合菌綱、卵菌綱、壺菌綱和隸屬於真子囊菌綱的子囊菌，而不包括酵母目。絲狀真菌和酵母可以通過它們在無性繁殖時菌絲體的延長和需要空氣進行碳代謝來區別(酵母的無性繁殖是單個細胞的出芽生殖，而且酵母可以進行發酵生長代謝)。真菌宿主細胞能最有效地進行真菌基因產物正確的內含子的拼接、糖基化、摺疊和其它翻譯後加工，這使得絲狀真菌成為最好的進行土壤樣品基因組DNA篩選的宿主菌。同時絲狀真菌也成為生產有商業價值的真菌酶類，如蛋白酶、纖維素酶和澱粉酶的最好宿主菌。人們同時發現，絲狀真菌能夠轉錄、翻譯、加工和分泌其它真核生物基因產物，包括哺乳動物基因。該特性使得絲狀真菌成為生產有生物醫藥價值的蛋白質的合適宿主菌。與酵母相比，絲狀真菌引入的糖基化模式更接近於哺乳動物蛋白的糖基化模式。由於上述原因，科學家投入了巨大的努力來開發用來表達外源性蛋白的真菌宿主系統，並且已經開發出了許多真菌表達系統。欲了解該領域的工作，請參見Maras et al., glycoconjugate J. ,16 :99-107(1999) ；PEBERDY, Acta Microbiol. Immunol. Hung. 46 165-174(1999) ；Kruszewsa,Acta Biochim. Pol. 46 181-195 (1999) ；Archer et al. ,Crit. Rev. Biotechnol. 17 :273-306(1997)； 禾口 Jeenes et al. , Biotech. Genet. Eng. Rev. 9 327-367(1991)。從真菌基因組構建的DNA文庫的高通量表達和鑑定也可以被用來確定許多現在功能未知的哺乳動物基因的功能。例如，一旦發現了一個真菌蛋白質具有一種令人感興趣的功能特性，可以將編碼該蛋白的基因序列與人類基因組序列相比較來尋找同源基因。Yelton等在美國專利第4，816，405號中闡述了改造絲狀子囊菌以使其生產並分泌異源蛋白質。Buxton等在美國專利第4，885，249號，以及Baxton和Radford，Mol. Gen. Genet. 196 :339-344(1994)中通過一個帶有可以整合到宿主細胞中的選擇標記的DNA載體對黑麴黴進行了轉化。McKnight等在美國專利第4，935，349號，以及Boel在美國專利第 5，536，661號闡述了利用可以引導異源基因在根黴和其它絲狀真菌中表達外源基因的啟動子在麴黴中表達真核基因的方法。Royer等在美國專利第5，837，847號中，以及Berka等在 WO 00/56900中，介紹了一種採用天然或突變過的鐮刀菌啟動子的有毒鐮刀菌表達系統。 Conneely等在美國專利第5，955，613號中介紹了所構建的適合在麴黴中表達和生產乳鐵蛋白的質粒。枝孢菌的葡萄糖氧化酶已經在麴黴中被表達(美國專利第5，879，921號)。相似的技術也被應用在鏈孢黴中。Lambowitzr在美國專利第4，486，533號中，介紹了一種可以在絲狀真菌中自動複製的DNA載體及其在鏈孢酶內弓丨入和表達外源基因中的應用。Stuart等在美國專利第5，695，965號中介紹了厚壁鏈孢菌(Neurospora crassa) 原生質球的哺乳動物基因和內源性轉錄調節因子的共轉化，並在美國專利第5，776，730號中描述了一株經改良後減少了胞外蛋白酶的鏈孢菌。美國專利第5，834，191號中公開了用於鏈孢菌轉化的載體。Taraki等在美國專利第5，436，158號中介紹了一種用於I^hizopus 中的轉化系統。Sisniege-Barroso等在WO 99/51736中介紹了用於絲狀真菌的轉化系統， 該系統採用了來自於Aspergillus awamori的穀氨酸脫氫酶啟動子。Dantas-Barbosa等在FERMS Microbiol. Lett. 1998 169 185-190中，介紹了通過醋酸鋰法或電激法轉化灰色腐殖菌(Humicola grisea)的Thermoidea變種，使它獲得了對潮黴素B的抗性。更加成功的一些真菌表達系統是麴黴屬和木黴菌屬，相關例子請參見Berka等在美國專利第5，578,463號中的說明，在Devchand和Gwynne的文章J. Biotechnol. 17 3-9(1991)，以及 Gouka 等的文章 Appl. Microbiol. Biotechnol. 47 :1-11 (1997)中也有論述。菌禾中 Myceliophthora thermophilia, Acremonium alabamense,陸生梭菌(Thielavia terrestris)和 Sporotrichum celluliphilum 轉化株的例子分別在 WO 96/02563，美國專利第5，602, 004,5, 604, 129,5, 695，985號中有報導。這些報導稱麴黴和木黴系統有一定的缺陷，暗示其它的真菌也許更適於大規模蛋白質生產。除子囊菌門外其它門的轉化方法也有文章報導。請參見例子=Mimoz-Rivas 等，Mol. Gen. Genet. 1986 205 103-106 SchizophylIum commune ；van de Rhee 等， Mol. Gen. Genet. 1996 250 :252-258,雙 胃(Agaricus bisporus) ；Arnau 等，Mol. Gen. Genet. 1991 225 :193-198,拳捲毛黴(Mucor circinnelloides) ；Liou 等，Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992 56 1503-1504 光亮根黴(Rhizopus niveus) Judelson 等， Mol. Plant Microbe Interact. 1991 4 :602-607，致病疫霄(Phytophthora infestans)；以 ^de Groot^,Nature Biotechnol. 1998 16 :839-842,) ^ (Agaricus bisporus)。絲狀真菌除了例如原生質體融合等常規轉化方法外，Chakraborty和Kapoor，在 Nucleic. Acids Res. 18 :6737 (1990)中介紹了利用電激法轉化絲狀真菌。De Groot等在 Natyre Biotechnol. 16 :839-842(1998)中採用根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) 介導的幾種絲狀真菌的轉化。科學家也開始利用生物介質將外源DNA轉入真菌；例子有:Christiansen 等，Curr. Genet. 29 100-102 (1995) ；Durand 等，Curr. Genet. 31 158-161(1997)；以及 Barcellos 等，Can. J. Microbiol. 44 :1137-1141(1998)。以磁粒作為 「磁性生物介質」轉化細胞的報導參見美國專利第5，516，670號和5，753，477號，科學家希望這種方法適用於絲狀真菌。顯然人們作了許多努力開發以真菌作為宿主菌的表達系統。然而，普通的真菌宿主都是絲狀真菌，在不加攪拌的培養液中會形成糾纏的菌絲體，而在加以攪拌的生物反應器中培養液粘度又會很大。絲狀真菌的這些特性也會在以之為宿主菌的工業化酶生產中導致問題。例如，高粘稠度和/或在局部形成的密集菌絲體堆積，將會對攪拌、通氣和營養物分散造成困難。一般來說，由於培養液的粘度，用微量移液器將絲狀真菌懸浮培養物吸到微量滴定板中有一定困難。而且，由於典型絲狀真菌培養物的菌絲體互相糾纏，用它來表達 DNA文庫時，大規模地將糾纏的菌絲體分離為單個克隆並不容易，這將使檢測單個基因型這一高通量檢測系統所需的步驟遇到困難。在不進行持續的攪拌時，典型的絲狀真菌傾向於在液體培養基的表面生長並形成一層菌絲體，並在其上產氣生孢子。而在培養基液面以下生長時又不總是產生孢子。這兩個特性都對在微量滴定板中培養絲狀真菌菌落，以及對有效地操作和利用這種培養物進行高通量的篩選製造了巨大的困難。懸浮的孢子和其它的可複製單元適於分離並分散到單個的微量滴定板孔中，但如果允許氣生菌絲體的形成，氣生孢子的產生會導致板孔間的交叉汙染。在微量滴定板孔的培養基中進行攪拌以防止氣生菌絲層的形成是不可行的。除了難以控制的氣生孢子問題，氣生菌絲層會干擾光的轉移，使得許多檢測(尤其是分光光度吸收檢測)較難甚至無法進行。氣生菌絲層還對諸如供氧、試劑和營養的添加以及取樣等產生幹擾。真菌的形態特徵對其培養物的物理特性的影響已經被認知，人們已經找到了有更好特性的自然產生的菌株，Jenssen和Boominathan的美國專利第5，695，985號提供了一個例子。鬆散的菌絲體均一分布，有規律的分枝，都是所描述的有益的形態特徵。khuster和 Royer在國際專利申請W097/26330和美國專利6，184，206中提到了相似的方法，用來分離鑑定形態特徵更適合於工業化生產外源蛋白質的真菌。該方法不是直接篩選野生型菌株， 而是篩選親本真菌細胞的突變株系，轉化突變株，檢測是否有轉化子比親本產生更多的外源蛋白。比親本至少多出10%菌絲體分枝的突變株被特別注意。該方法被應用於木黴屬、 鐮刀黴屬和麴黴屬的篩選，他們還暗示此方法可以應用於其它許多屬。Bock 等在 Biotechnol. Bioeng. 65 :638-648(1999)中檢測了分枝頻率對米麴黴突變株培養物粘度的影響；結果發現分枝越I的突變株培養物粘度越低。而Van Wezel等在 PCT應用WO 00/00613中，介紹了一種減少菌絲分枝和/或增加菌絲體片段的數量的方法， 培養液的粘度也被降低了。該方法將灰色鏈黴菌W^gA基因轉入了微生物中。該方法採用的是放線菌目的絲狀細菌，但宣稱適用於絲狀真菌。在WO 00/56893中，Durm-Co Ienman 等描述了一株構巢麴黴的HbrA2突變株在42°C以上生長時分枝數大大增加，並且觀察到菌絲分枝度與培養物粘度之間呈線性關係。對絲狀真菌表達系統的絕大多數前期研究都是為了分離鑑定適於工業化酶生產的菌株，因而人們的注意力主要集中在培養液粘度、轉化的穩定性、單位體積的外源蛋白產量，以及產量佔生物量的百分比這些方面。已經在真菌中表達了一些DNA文庫，例如Gems 和Clutterbuck在Curr. Genet. 1993 24 :520-5 這篇論文中，用構巢麴黴系統表達了構巢麴黴文庫。Gems等在Mol. Gen. Genet. 1994 242 :467-471這篇論文中，用麴黴系統表達了一個來源於青黴的基因組文庫。但是這兩個例子都沒有透露或暗示對表達的蛋白進行了篩選；而是通過對宿主突變的等位基因的互補作用來證實來自DNA文庫的基因已經獲得了表達。這種互補的方法對每個想要檢測活性的外源蛋白都需要一個特定的突變株做宿主菌， 因而不能對一般的文庫篩選提供一個工具。Berges 等人在 Curr. Genet. 1993 24 :53-59 這篇論文中，闡述了用在 Trichoderma reesei中表達的方法克隆了一個黑麴黴蔗糖酶基因。具體方法是利用一個構建在有選擇標記的粘粒上的黑麴黴基因組文庫，並採用一株不能利用蔗糖的裡氏木黴(T.reesei)作為宿主菌，用同胞選擇的方法克隆了一個黑麴黴蔗糖酶基因。在這裡，同樣需要有特定性狀的宿主菌來檢測特定單個外源蛋白的表達，基因組文庫的篩選沒有被提及甚或不可能。—個適於表達DNA文庫的宿主菌的特點在許多方面與適合於工業化蛋白質生產的宿主菌不同。總的來說，一株適合於高通量篩選的真菌宿主菌應具備許多條件，其中包括-宿主菌必須能進行高效轉化。-宿主菌必須能處理含有內含子的基因，並能進行任何必要的拼接。-宿主菌必須能對表達的蛋白進行翻譯後加工，以使蛋白變為有活性的形式。-當從文庫中篩選一種蛋白質時，宿主菌必須能夠生產足夠多的該蛋白以供分析 Z用ο-宿主菌必須能接受許多種表達調控因子，並能輕鬆利用各種調控因子。-宿主菌培養物中的菌絲體不能相互糾纏而對分離單個克隆產生困難，也不能相互糾纏而升高粘度到不能在小型化的高通量篩選中(如微量取樣)有效轉移和複製的程度。-宿主菌不能在培養基表面形成菌絲層，而應優先在培養基液面以下生長。-在高通量篩選所提供的生長條件下，宿主菌必須能在培養基液面以下有效地形成孢子或其它無性繁殖體。當被篩選物是代謝產物時，如果宿主細胞能將代謝產物分泌到培養基是再好不過了。在培養基中代謝產物可以被很容易地檢測和/或分析。在理想狀態下，宿主菌應該只分泌外源蛋白。當對蛋白質進行分析時，如果宿主菌也能表達足夠用來分離和純化的外源蛋白就非常有利了。如果有具備這種特點的宿主菌，就可以只通過培養宿主細胞，而不用煩瑣費時的分子生物學操作將基因轉入其他生物體，來進一步鑑定所有感興趣的外源蛋白。宿主菌能將蛋白質分泌到胞外是一個好的特性，這樣可以進行更可靠和更多樣的檢測。如果宿主細胞能方便地分離外源DNA也將是非常有利的，這樣進一步的研究以及改造基因本身也可以進行。除了上述的特性，這種轉化系統還應具備一些其它的特點。轉化的效率應該足夠高，以產生有意義的篩選所必須的足夠轉化子數。在理想狀態下，外源蛋白的表達應由一種誘導物誘導，並且該誘導物通過一條途徑作用在一個啟動子上。迄今為止，還沒有任何宿主菌和轉化系統的組合符合全部這些條件，甚至連能符合大部分的也沒有。因此，人們仍然需要能有效表達DNA文庫一尤其是基因組文庫和/或真核基因組文庫的基因產物的真菌宿主和轉化系統。發明簡述本發明採用在深層培養時能產生「可轉移的複製單元」的絲狀真菌。「可轉移的複製單元」是指孢子、無性芽、菌絲片段、原生質體、皮層碎片，或其它符合下面兩個特徵的真菌單元(1)在培養基中能容易地與其它這類單元分離，和( 能夠自身複製成一個單克隆培養物。優選真菌還表現出絲狀形態不明顯和/或生長緊密的優點，並且產生適於高通量 DNA文庫篩選中涉及的物理操作的低粘度培養物。尤其優選的是，即使在不加攪拌的情況下仍然傾向於在培養基內部生長，而不是在培養基表面形成菌絲層的絲狀真菌。本發明利用了在國際專利申請PCT/NL99/00618和PCT/EP99/202516中公開的轉化系統的特點。這些申請描述了一種對諸如Chrysosporium lucknowense, Aspergillus sojae等絲狀真菌宿主非常有效的轉化系統。這些申請還公開已經獲得了保留野生型宿主細胞所有優良性狀，但部分失去其絲狀表型的突變株，這種突變株降低了培養物的粘度。
本發明所採用的優選真菌能夠大量表達並分泌外源蛋白質，與已知絲狀真菌宿主相比蛋白質/生物量之比獲得了提高。本發明提供了一個表現高轉化子產量的轉化系統。 本發明還提供了能有效表達外源cDNA插入體，尤其是基因組DNA插入體的蛋白產物的真菌轉化株庫。本發明的另一方面，轉化的真菌庫可以用來篩選外源蛋白的活性或特性，或者篩選轉化真菌由於外源蛋白的作用而產生的代謝物，也可以用來篩選外源DNA或其轉錄產物 RNA。應該理解本發明還能夠高通量篩選具有上述性狀的非轉化菌株的代謝物。本發明使用的術語「絲狀真菌突變株」僅指在自然界找不到的真菌。導致例如緊密的生長狀態、低粘度、低蛋白酶含量、在液面以下生長等可描述的表性特徵的「突變」可以通過紫外線誘變和化學誘變等經典方法，或者通過如盒式突變等分子生物學手段隨機產生， 還可以通過縝密的基因工程方法來獲得。如果一株天然真菌具有這些必要特性，它將理所當然地可以被應用於本發明的方法中。在本發明的另一方面，轉化的真菌庫可以用來篩選真菌自身的有用性質，例如，一種特定表達的蛋白或代謝物的高水平生產。本發明的這一方面可以通過對目標表達蛋白的定量分析來說明，其中可以檢測到有最優良的蛋白生產、蛋白加工和蛋白分泌特性組合的特殊菌株。在本發明的再一方面，轉化真菌庫可以用來篩選能夠與目標核酸探針雜交的DNA 序列的存在。


圖1是實施例中描述的Wfestern印跡圖。圖2是質粒pUT720的圖譜。圖3是質粒pUT970G的圖譜。圖4是質粒pUT1064的圖譜。圖5是質粒pUT1065的圖譜。圖6是質粒pF6g的圖譜。圖7是質粒pUT1150的圖譜。圖8是質粒pUT1152的圖譜。圖9是質粒pUT1155的圖譜。圖10是質粒pUT1160的圖譜。圖11是質粒pUT1162的圖譜。圖12是pclA蛋白的結構圖。圖13A是黑麴黴(Aspergillus niger)野生型的顯微照相圖。圖13B是黑麴黴pclA突變株的顯微照相照片。圖14A是醬油麴黴(Aspergillus sojae)野生型的顯微照相照片。圖14B是醬油麴黴pclA突變株的顯微照相照片。圖15A-F是pyrE基因的測序結果。帶下劃線的是胺基酸序列；由於一些核酸序列不確定導致胺基酸序列不連續。標出的胺基酸序列是最可能的序列，黑體字代表推測的/ 可能的內含子。本發明的詳細描述
從最廣義的角度來說，本發明涉及在懸浮培養液中能產生可轉移的複製單元的轉化絲狀真菌；涉及這種真菌庫；還涉及從這種庫中篩選諸如與表達的外源蛋白質或相關代謝產物(即由內源性和/或外源性酶產生的小分子量產物)有關的生物化學活性或生物學活性等所需生物學特性的方法。這個低粘度的絲狀真菌庫包括含有核酸序列的真菌，每段核酸序列編碼一個外源蛋白，每段所述核酸序列都可操作地連接於一個表達調控區，並可選擇地連接分泌信號編碼區和/或載體蛋白編碼區。本發明中的轉化菌株優選可以分泌外源蛋白。本發明所使用的表達和篩選方法，和其中使用的真菌菌株，對生產真菌、蛋白質、 代謝物和DNA分子這些在各方面有廣泛用途的物質很有用。本發明的方法對獲得核酸和蛋白質序列信息也很有用，這些信息本身也被看作本方法的有用產品之一。本發明的優選絲狀真菌特徵在於培養基粘度低。典型的工業級絲狀真菌的培養物粘度遠大於200釐泊(cP)，通常是1，OOOcP以上，甚至能達到10，OOOcP ；本發明的真菌在有充足營養及最適或接近最適生長條件下培養48小時或更長時間以後，培養物粘度在200cP 以下，優選IOOcP以下，更優選60cP以下，最優選IOcP以下。本發明的絲狀真菌通常呈現短的、不連續、不相互糾纏的菌絲或小團的形態。這些小團是從一個單克隆產生的有輕微或無相互糾纏的菌絲集合體，與從多個相互纏繞的克隆產生的菌絲團是不一樣的，後者要大得多。例如，Chrysoporium Iucknowense突變株UV18-25 (培養粘度< IOcP)和形態相似的 Tricoderma Iongbanchiatum突變株X-525 (培養粘度< 60cP)，特徵在於有短的、明顯的、 不相互糾纏的菌絲，長度在100-200微米之間；低粘度基因工程突變株Aspergillus sojae pclA的形態特徵是有多分枝和短菌絲的緊密形態(參見圖14)。而W097/2630中提到的低培養粘度真菌在形態上「分枝更多」，本發明中的真菌與非突變菌株相比菌絲分枝與之相當甚或更少。看起來菌絲的長度在控制培養物粘度上起關鍵作用。特別優選的真菌菌株有高的外源分泌蛋白/生物量之比。這個比率大於1 1，較有大於2 1，更優選6 1或更高，最優選8 1或更高。這樣高的比率在高通量篩選環境中是有利的，因為它會使外源蛋白的濃度更高，允許更靈敏和/或更快速的篩選檢測。這在檢測的體積減小時尤其有利，例如從96孔微量滴定板到384孔板，再到1536孔板時。本發明的方法適用於所有這些型號的微量滴定板，也適用於絕大多數其它採用液體樣品的、 HTS樣式的滴定板。我們期望用本發明所講的突變方法，可以將所有絲狀真菌轉變為適合於在本發明中應用的突變株。優選的絲狀真菌的屬有金孢屬(Chrysosporium)，梭孢殼屬 (Thielavia)，鏈孢酶屬(Neurospora)，金色擔子菌屬(Aureobasidium)，線黑粉菌屬 (Filobasidium), Piromyces, Crylococcus, Acrimonium, Tolypocladium, Scrytalidium, 裂褶菌屬Gchizophyllium)，側孢黴屬(Sporotrichum)，青黴屬(Penicillium)，赤黴菌屬 (Gibberella)，毀絲黴屬(Myceliophthora)，毛黴屬(Mucor)，麴黴屬(Aspergillus)，鐮刀黴屬(Fusarium)，腐質黴屬(Humicola)，和木黴屬(Trichoderma)，和它們的無性型及遠距離刺激變形型。其中優選金孢屬，木黴屬，麴黴屬和鐮刀黴屬。更優選金孢屬。真菌的種屬可以根據與Barnett和Hunter所著的《不完善的真菌屬的圖解》第三版，1972，BUrgesS出版公司一一書中描繪的形態的一致性來定義。對金孢屬真菌的分類提供詳細原始資料的有 Van Oorschot,C. Α. N. (1980) 「對金孢屬及其相關屬的修訂」，Mudies in Mycology No. 20Cenntraal Bureau voor Schimmelcultures(CBS), Barrn, The Netherlands,^ 1_36 頁。 根據這些資料，金孢屬屬於絲孢菌目的叢梗孢科(Moniliaceae).另一個提供真菌命名的方便資源是布達佩斯條約的保藏，尤其是那些提供在線資料庫的(以下這些網址釆用HTTP傳輸協議)。美國的ATCC在www, atcc. org提供信息， CBS (NE)在 www. cbs. knaw. nl 提供信息，俄羅斯的 VKM 在 www, bdt. org, br. bdt. msdn. vkm/ general提供信息。另一個資料來源是NT. ars-grin. gov/fungaldatabases.所有這些機構都能提供區分真菌種的特徵的教程。在www. ncbi. nlm. nih. gov/htbon-post/taxonomy/ wgetorg ？ mode = Undef&id = 4890網站可以找到Ascomycota的另一種分類。根據這另夕卜一禾中分類，金孢屬隸屬於Ascomycota門、Onygenales目、Onygenaceae禾鬥。金孢屬的範圍包括但不局限於這些菌株C.botryoides，C. carmichaelli， C. crassitunicatum, C. Europe, C. evolceannui, C. farinicola, C. fastdium, C. filiforme, c. georgiae，C. globiferum，C. globiferum var articulatum，C. globiferum var niveum，C. hirundo, C. hispanicum, C. holmii, C. indicum，C. inops，C. keratinophilum， C.kreiseii，C. kuzurovianum, C. lignorum，C. lobatum，C. lucknowense，C. Iucknowense Grag 27K，C.medium, C. medium var spissescens，C. mephiticum, C.merdarium, C. merdarium var roseum，C. minor, C.pannicola, C. parvum, C. parvium varcrescens， C. ρilosum, C. pseudomerdarium, C. periformis, C. queenslandium, C. sigleri, C. sulfureum，C. synchronum，C. tropicum，C. undulantum，C. vailenarense, C. vsepertilium，C. zonatum.C. Lucknowense是金孢屬的一個人們特別感興趣的種，因為在自然條件下它的纖維素酶蛋白的產量比較高(國際專利申請WO 98/15633，PCT/NL99/00618，和美國專利 5，511，381 和 6，015，707)。國際保藏號為 ATCC 44006，CBS 251. 72，CBS 143. 77，CBS 272. 77，和VKM F-3500D的菌種都是Chrysosporium lucknowense菌株的例子。金孢屬的定義範圍還包括從金孢屬同一祖先衍生來的菌株，包括自發突變或誘變的突變株。本發明的方法，在一個具體方面，利用了一株通過輻射和化學誘變獲得的金孢屬突變株，該菌株在懸浮培養時傾向於產生可轉移的複製單元，其形態特徵是短的、不連續的、不相互糾纏的菌絲(緊密生長)，還有一個表型特徵是在懸浮培養時在液面以下生長，發酵培養基的粘度較低。在另一個方面，本發明採用了形態相似的木黴屬突變株。在另一個方面，採用了形態相似的醬油麴黴或黑根黴突變株。例如，將VKM F_3500D(C1菌株)用紫外線照射，獲得菌株UV13-6。隨後，該菌株用N-甲基-N』 -硝基-N-亞硝基鳥嘌呤進一步誘變，產生菌株NG7C-19。後者接著被紫外線誘變，獲得菌株UV18-2(VKM F-361D)。在突變過程中，該菌株在液體培養基或平板以及顯微鏡下的形態特徵發生了一些變化。在每一次連續的突變後，在平板上培養的突變株的金孢屬典型絨毛狀和氈狀的形態特徵就會減少一些。野生型在某些培養基中生長時會產生棕色色素，而突變株的這種特徵則不明顯。在液體培養基中生長時，突變株UV18-25的粘度明顯低於野生型菌株Cl和突變株UV13-6和NG7C-19。雖然所有菌株都大致保持著金孢屬的顯微鏡下特徵，但所有菌株每經過一代突變菌絲就變細一些，而UV18-25可以明顯觀察到菌絲呈片段狀。這種菌絲片段可能是造成UV18-25的培養物粘度降低的原因之一。每進行一代突變，菌株產生氣生孢子的能力就減弱一些。這些結果表明一個菌株可以總體上屬於金孢屬，而在形態上表現出與傳統分類(形態上)定義有一些差異。特別是金孢屬的無性型，我們發現它特別適合本發明所述的篩選應用。無性型的代謝使其特別適合高效表達。有性型也應該適合，因為無性型和有性型的基因組成是一樣的。無性型和有性型的區別在於一個是無性狀態，另一個是有性狀態；這兩種狀態在特定培養條件下表現出不同的形態。另一個代表基因工程突變菌株的例子是醬油麴黴(Aspergillus sojae) 0這些突變株中的一株的編碼一個特定內切蛋白酶的基因被阻斷了。這一突變導致了菌絲變短，分枝增加，菌絲生長緊湊，在培養基液面以下形成菌絲小片。並且，在本應用中提到的 Aspergillus sojae在特定的液體培養基內生長可以被誘導表現出高效的生孢子能力，這使得它特別適合用於高通量篩選系統。在這個例子中，誘導產生可轉移的複製單元的條件僅僅是由一種含0. 6克/毫升EDTA的合成培養基組成。誘導條件會隨著不同的宿主而改變，但很明顯的是如果一個宿主菌適合，這個條件應該早就為人所知了。人們喜歡用不產毒素和非致病的真菌菌株，現有技術已知道很多這種菌，因為這會降低操作者的危險性，並能簡化總體的篩選過程。在優選的實施方式中真菌還將是蛋白酶缺陷型，這樣可以最大程度地降低外源蛋白的降解，和/或易於抑制蛋白酶的產生。將蛋白酶缺失的菌株用作表達宿主菌是眾所周知的，例如PCT申請WO 96/29391.蛋白酶缺失的菌株可以通過篩選突變株來產生，或者蛋白酶基因可以被」敲除」，或者可以用本文中的方法使其失活，例如Christensen和Hynes在美國專利6，025, 185號中所描述的(areA基因功能喪失的 Aspergillus sojae).人們發現可以處理金孢屬突變株使其蛋白酶表達量下降，這就使它們更適合於生產蛋白類產品，尤其是當蛋白類產品對蛋白酶活性敏感時。因此本發明也可以使用一株金孢屬突變株，該突變株比諸如C. Iucknowense菌株Cl (VKM F-3500D)等非突變金孢屬菌株產生的蛋白酶少。這些突變株的特別之處是其蛋白酶活性(除了所有的有選擇的用來切割分泌的融合蛋白的蛋白酶)小於Cl菌株產生的活性的一半，更好的情況下小於30%，最好時小於10%。被降低的蛋白酶的活性可以用已知的方法測定，例如測量脫脂牛奶平板上的抑菌圈或牛血清白蛋白降解。已經發現可以構建蛋白酶表達水平降低的金孢屬突變株，以使它們更適於生產蛋白產物，尤其是當蛋白產物對該蛋白酶活性敏感時。因此，本發明也可以利用比金孢屬非突變株例如C. Iucknowense Cl株(VKMF-3500D)產生更少蛋白酶的金孢屬突變株。尤其是當該突變株的蛋白酶活性(而非裂解融合蛋白的蛋白酶)不及Cl株的一半或少於30%甚至 10%時更好。蛋白酶活性的減少用已知方法測定，如測定脫脂牛奶平板形成的抑菌圈或牛血清白蛋白的降解。為了減少分析時宿主蛋白的幹擾，去除宿主絲狀真菌的其它基因如編碼纖維素酶和其它分泌較多的蛋白的基因的活性，是再好不過了。可以刪除或突變編碼分泌蛋白的基因，或者對非目的蛋白的誘導系統及表達的有關途徑進行改造以降低其表達。本發明(見下面)中載體使用內源性操縱子，是為了滅活同一個誘導子控制下的其它的基因的活性。 蛋白酶分泌較易抑制的真菌的蛋白酶表達往往受環境調節因子如胺基酸濃度的控制，而通過這些環境因子可以減少蛋白酶的生產。轉化載體中優選應用能夠在選擇的宿主中高表達的同源表達調節區。來源於異源宿主如木黴屬或麴黴屬的高表達調節區，眾所周知而且都在使用。舉例但並不限於這些，已知大量表達並因此為本發明的應用提供合適表達調節序列的蛋白質的例子是hydrophobin，蛋白酶、澱粉酶、木聚糖酶、果膠酶、酯酶、β-半乳糖苷酶、纖維素酶 (endo-glucanase, cellobiohydrolase)及多聚半乳糖醛酸酶。表達調節區包含一個可控制的啟動子序列，和要表達的蛋白的核酸序列連接在一起。啟動子和要表達序列的起始密碼子緊密相連，以達到表達的目的。啟動子序列可以是組成型的，但誘導型的更好。使用誘導型啟動子和適當的誘導介質更利於和啟動子相連的序列的表達。我們曾考察過一些來源於同源物種或異源株系的、能夠促使蛋白質表達的表達調節序列。這種表達調節序列適合於真菌的表達調節區，例如子囊菌綱的調節區。合適的子囊菌綱的表達調節區是來自下列屬任意一種的調節區麴黴屬，木黴屬，金孢屬，腐質黴屬，鏈孢黴屬，Tolypocladium，鐮刀黴屬，青黴屬，Talaromyces，或它們的另一種性別型例如Emericela及鐮刀黴屬。來自木黴屬的cellobiohydrolase啟動子；麴黴屬的乙醇脫氫酶A，乙醇脫氫酶R，穀氨酸脫氫酶，RAKA澱粉酶，甘油澱粉酶，甘油醛磷酸脫氫酶啟動子， 鏈孢黴屬的磷酸甘油及旁路的啟動子；Miizomucor miehei的脂酶、冬氨酸蛋白酶啟動子； penicillium canescens的β-半乳糖苷酶的啟動子；而cellobiohydrolase，葡聚糖內切酶，木聚糖酶，甘油醛磷酸脫氫酶和蛋白酶的啟動子是典型代表。和宿主同屬的表達調節序列是最佳選擇，因為它更可能特別地適應宿主。來自表達巨大量蛋白質的金孢屬菌株的天然表達調節序列特別優選。這些菌株的例子已經根據布達佩斯條約保藏於莫斯科的全俄菌種保藏機構(All Russian Collection，VKM)。野生型Cl株保藏號為VKM F_;3500D，保藏日為1996年8月四日， Cl UV13-6突變株保藏號VKM F-3632D,保藏日1998年9月2日，Cl NG7C-19突變株保藏號VKM F-3633D，保藏日為1998年9月2日，Cl UV18-25突變株，保藏號VKM F-3631D，保藏日為1998年9月2日。這些菌株也優選用來作為生產低-粘性突變株的菌源；事實上VKM F-3631D菌株已經表現必需的低粘度表型特徵。經過對1Trichoderma longibrachiatuml8. 2kk的兩輪輻射選擇，已經得到木黴屬的一個編號為X-252低粘度突變株,而X-252低粘度突變株是從iTrichoderma Iongibrachiatum的QM 9414株的突變體 (ATCC 26921)得到。本發明的其它實施方式利用了 Aspergillus sojae和Aspergillus niger表現型近似的突變株。當宿主是金孢屬時，優選應用金孢屬的啟動子序列，以保證啟動子被宿主正確識別。某些異源表達調節序列也和金孢屬本身的表達調節序列一樣在，金孢屬中具有相同的調節效率。這樣以來就使我們可以構建用於轉化，金孢屬的出色載體，並提供在此宿主中進行高效轉化和表達的許多可能性。如，標準的麴黴屬轉化技術可參考Christiansen等在Bi0/Techn0l0gyl998 6 1419-1422 —文的描述，其它有關轉化載體的詳細描述包括美國專利 4，816，405,5, 198，345,5, 503，991,5, 364，770,5, 705，358,5, 728，547,5, 578，463、 EP-B-215. 594(也適用於木黴屬)，它們的內容通過參考併入本文。因為在金孢屬中發現纖維素的表達率非常高，纖維素基因的表達調節區很受歡迎。本發明中載體允許插入編碼酶(尤其對分泌出去的酶)的基因的啟動子序列。 這些酶包括糖降解酶(纖維素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，甘露糖苷酶，果膠酶，澱粉酶，例如葡萄糖澱粉酶，α -澱粉酶，α和β半乳糖苷酶，α和β葡萄糖苷酶，β -葡聚糖酶，幾丁質酶)，蛋白酶(內源蛋白酶，氨基蛋白酶，氨基及羧基多肽酶)，其他水解酶(脂肪酶， 酯酶，肌醇六磷酸酶)，和轉移酶(糖基轉移酶，穀氨醯胺轉移酶，異構酶，轉化酶)。來自 Chrysosporium Iucknowense的幾個酶的例子見表A。表 A 來自 Chrysosporium Iucknowense 的部分酶的特性
樣品胺基酸保留>50%活性的最高PH保留>70%活性的最高PH穩定性 20h, 50 °C pH 7.5/8數量CMC aseRBB CMC ase其它底物CMC aseRBB CMC ase 物保留的最高活性％30 Kd鹼性蛋白酶--12.5--12.0-3OkD Xyl(鹼性)333--10.0--8.58051kDXyl--8.0--7,5-60kDXyl--9.5--9.08530 IcD endo (EG3)24745 kD endo7.08.0-6.57.0-7555 kD endo2478.08.0-7.07.0-5525 kD(21.8 kD)endo (EG5)2257.510.0-6.59.0-8043 kD(39.6 kD')endo (EG6)3958.08.0-7.27.2--45 kD α,β-Gal/p-Gluc--6.8--5.7-48 kD CBH5.27.58.05.06.8--55 kD CBHl5268.09.0-7.48.5-7065 kD PGU--8.0--7.3-90kD蛋白酸--9.0--9.0-IOOkD蛋白雖--9.0--9.0-注通過MALDI測定的分子量；其它均為通過SDS PAGE測定的分子量xyl =木聚糖酶endo =葡聚糖內切酶gal =半乳糖苷酶glue =葡糖苷酶CBN=CellbiohydrolaseP⑶=半乳糖醛酸酶核酸構建體優選包括來自金孢屬、最好是來自Chrysosporium Iucknowense或其衍生物的表達調控區，該調節區可操作地與一個編碼待表達蛋白的核酸序列連接。特別優選的核酸構建體將包括來自表達纖維素酶或木聚糖酶的金孢屬的表達調控區，優選包括來自表達cellobiohydrolase，更優選表達表A描述的 55kDa cellobiohydrolase (CBHl)的金孢屬的表達調控區。再舉些例子，金孢屬的hydrophobin、蛋白酶、澱粉酶、木聚糖酶、酯酶、 果膠酶、β-半乳糖苷酶、纖維素酶(葡聚糖內切酶，cellobiohydrolase)和多聚半乳糖醛酸酶的啟動子序列也在本發明的範圍內。表A中公開的酶的所有啟動子或表達調控區都可以恰當地得以使用。可以很容易地從金孢屬得到這些啟動子或表達調控區的核酸序列。確定啟動子序列的方法多種多樣而且眾所周知。啟動子序列通常緊靠在相關基因開始的起始密碼子ATG的上遊。舉例來說， 可以用去除相關基因上遊的序列、重組DNA技術、及檢驗去除這些序列對基因表達的影響來鑑別啟動子序列。再例如，通過比較相關基因上遊序列的同源啟動子序列，也可以發現啟動子序列。比如，Cl葡聚糖內切酶的啟動子序列就是通過克隆相應基因得來的(見PCT/ NL99/00618)。本發明傾向於使用來自金孢屬55kDacellobiohydrolase (CBHl)、甘油醛磷酸脫氫酶A、30k Da的木聚糖酶(XylF)的啟動子，因為這些酶應用它們的啟動子時表達水平較高。Chrysosporium Iucknowense 尤其是 C. Iucknowense GARG 27K 糖降解酶的啟動子因可在其它真菌宿主中表達很多蛋白，很好使用。本發明核酸序列的具體實施方式
是已知的金孢屬，麴黴屬和木黴屬的核酸序列。 金孢屬的啟動子序列見PCT/NL99/00618的描述。現有技術提供了大量可在麴黴屬中應用的表達調控區，例如美國專利 4，935，349 ；5，198，345 ；5，252，726 ；5，705，358 ；5，965，384 和PCT申請W093/07277。在木黴屬菌株中表達公開在美國專利6，002，725中。這些專利的內容通過參考其全文併入本發明。Hydrophobin基因是一個高表達的真菌基因。有人認為Hydrophobin基因的啟動子序列、優選來自金孢屬的啟動子序列，適合用作本發明適當實施方式中的表達調節序歹Ij0 Trichoderma reesei 禾口 Trichoderma harzianum 白勺 Hydrophobin ―因·歹Ij 己經為3 有技術所公開，並且Aspergillus fumigatus禾口 Aspergillus nidulans的基因序列及相關序列信息被參考併入本發明(Nakari4etala 等，Eur. J. Biochem. 1996,235 :248-255 ； Parta 等，Infect. Immun. 1994 62 :4389-4395 ；Munoz 等，Curr. Genet. 1997,32 :225-230 ； Mringer等，Mol. Microbio. 1995 16 :33-44)。利用這些信息，本領域普通技術人員按照標準方法例如前面提到的技術，不必經過繁重實驗即可得到金孢屬hydrophobin基因的表達調控序列。根據本發明的一個重組金孢屬菌株可以包含一個可操作地與編碼外源蛋白的序列相連的hydrophobin調控區。表達調控序列也可以另外包含一個增強子或沉默子。它們也是現有技術已知的， 它們一般遠離啟動子。表達調控序列還包括具有激活物結合位點和阻抑物結合位點的啟動子。在某些情況下，這些部位也可以得以修飾以去除這種類型的調控。例如，存在CreA位點的絲狀真菌啟動子的已有報導。可以使creA位點突變，以確保由於存在的creA被去除而導致葡萄糖的抑制。利用這樣的啟動子可以產生在葡萄糖存在下啟動子控制的核酸序列編碼的蛋白庫。這種技術的例子見WO 94/13820及WO 97/09438。這些啟動子在有後無其 creA位點的情況下均能使用。creA位點突變的突變體可用作本發明重組株的表達調控序列，而它所調控的核酸序列庫可以在葡萄糖存在下得以表達。這類啟動子如WO 97/09438 中所描述的類似方式確保去抑制。CreA位點的鑑別知識是現有技術已知的。另外，可以在抑制系統以外具有突變的宿主菌株中應用CreA結合位點未突變的啟動子，從而該菌株儘管存在CreA結合位點，仍能夠在葡萄糖存在下產生蛋白庫。終止序列也屬於表達調控序列，它們可操作地連接在要表達的序列的3』端。可能有許多已知的真菌終止子在本發明的宿主菌中起作用。如A. nidulans trpC的終止子， A. niger的α -葡糖苷酶終止子、A. niger的葡糖澱粉酶終止子、Mucor miehei的羧基蛋白酶終止子(參見 US 5578463)，以及 Trichoderma reesei 的 cellobiohydrolase 終止子。金孢屬的終止子序列，例如EG6終止子，當然在金孢屬中發揮很好的得作用。用於本發明的合適轉化載體可以任選具有可操作地與信號序列的編碼序列連接的待表達外源核酸序列。而信號序列為一段胺基酸序列，當和待表達蛋白的胺基酸序列可操作地連在一起時，能夠使該蛋白從宿主生物體中分泌出去。這樣的一種信號序列可以是與異源蛋白有關的或是宿主本身的。編碼信號肽的核酸序列必須定位在讀碼框中，以使信號肽和異源蛋白一同翻譯。本發明信號肽的位置(包括單一的、分泌外源蛋白)最好處於分子進化該分子所處位置。一個載體上只連接一個信號序列來進行文庫的表達，不是最好選擇，因為這將減少表達目的蛋白的可能。隨機剪斷DNA而建立的基因組文庫，然後再克隆到一個載體中， 庫中基因正好和信號序列連接在一個閱讀框架的可能性較小。而且，即便是連接到一起， 選擇的信號序列可能不會對所有基因起作用。鑑於此，最好不要應用信號序列來篩選基因組庫，而要通過檢測細胞內外源蛋白的存在來篩選基因組庫。細胞內蛋白的存在和活性分析可以通過用酶將真菌轉化為原生質體、然後再溶解後得以實現。有關操作見kyl等， J. Biotechnol. 59 =221-224(1997)的描述。這種方法已經應用於生長在微量培養板上的金孢屬轉化子的PCR克隆檢測。講解一下能使金孢屬菌株分泌蛋白的信號序列。此類序列以真菌的信號序列為好，但以Ascomycete的信號序列為最好。通常可以從真核細胞得到合適的信號序列，最好從酵母和以下各屬的真菌得到麴黴屬，金孢屬，木黴屬，Pichia，鏈孢黴屬，Rhizomucor, Hansenula,腐質黴屬，毛黴屬，Tolypocladium,鍵刀黴屬，青黴屬，Saccharomyces, Talaromyces,或不同生殖方式的 Emericela、Hypocrea。那些禾口 cellobiohydrolase、葡聚糖內切酶、β -半乳糖苷酶、木聚糖酶、果膠酶、酯酶、蛋白酶、hydrophobin或澱粉酶生來就連在一起的信號肽特別有用。如麴黴屬或腐質黴屬的澱粉酶或葡糖澱粉酶，Aspergillus oryzae TAKA澱粉酶，AspergiIlus niger的α -澱粉酶，毛黴屬的羧基肽酶(US 5578463)， Rhizomucor miehei的脂肪酶或蛋白酶，木黴屬的cellobiohydrolase，來自金孢屬 Penicillium canecens CBHl株的β -半乳糖苷酶，Saccharomyces的α-交配因子的信號序列。另外信號序列也可以是杆狀菌的澱粉酶或枯草桿菌蛋白的信號序列。從同一屬的宿主菌株得到的信號序列尤其適合，因為它最可能會特別適應特定宿主的要求；因此當宿主是Chrysosporium Iucknowense時，信號序列最好是金孢屬的信號序列，金孢屬菌株分泌的蛋白量異常地高，當然來自這些株系的信號序列讓人感興趣。來自絲狀真菌和酵母的信號序列，也許和非真菌的信號序列一樣有用。按照本發明的任意實施方式，轉化的重組真菌宿主可以進一步攜帶一個選擇標記。此選擇標記可用來選擇轉化或轉染細胞。選擇標記通常編碼一種基因產物，進而導致宿主產生不同於非轉化細胞的特定類型的抗性。通常可以是對重金屬的抗性、抗生素或殺生劑抗性。原養型是非抗生素變種的一種有用選擇型標記。自養型標記導致宿主產生營養缺陷，而糾正這些缺陷的基因可以用來作為選擇的標記。經常使用的抗性和自養選擇標記是amdS (己醯胺酶)、hph (潮黴素磷酸轉移酶)、pyrG (乳清酸核苷_5，-磷酸脫羧酶)、 pyr (乳清酸P-核糖轉移酶)、trpC (鄰氨基苯甲酸合成酶)、argB (鳥氨酸氨甲醯基轉移酶)、sC (硫酸腺苷轉移酶)、bar (膦絲菌素乙醯轉移酶)、niaD (硝酸還原酶)jh-ble (博來黴素-腐草黴素抗性)、突變的乙醯乳酸合成酶(磺醯脲抗性)、新黴素磷酸轉移酶(氨基糖苷抗性)。金孢屬菌株最好的選擇標記是乳清酸P-核糖轉移酶。選擇標記單獨在一個載體上或者選擇標記和要表達異源蛋白的核酸序列在同一片段上，都能通過共轉化進行選擇。可以通過使用AMAl複製子序列進一步提高轉化效率，這對Aspergillus niger(Verdoes等，Gene 146 :159-165(1994))是有用。該序列導致許多絲狀真菌的轉化效率增加10-100倍。另外，導入的DNA不整合到真菌的基因組中，而是以多拷貝、自主的形式保留在真菌細胞裡。這對本發明中的高通量篩選方法有利，因為非整合狀態減少不同轉化子在基因表達水平上的差異。此外，因為導入的DNA不重組到宿主DNA中，宿主基因組不會發生非目的突變。藉助於載體如AMAl的自主複製或在真菌端粒序列促進下的自主複製，外源基因得以均一表達。(參見 A. Alesenko 和 L. Ivaniva, Mol. Gen. Genet. 1998 260 159-164.)本發明中使用的術語「異源蛋白」 一詞，是指不能在本發明的宿主菌株中正常表達或分泌的蛋白質或多肽。異源蛋白既可來自原核生物，也可開自真菌、植物、昆蟲、或來自諸如哺乳動物的高等動物。對於藥物篩選目的，則人蛋白是首選，因此一個優選的實施方式是 DNA文庫屬於人源的宿主。因此這樣一些實施方式也被認為是本發明的適當實施例。用本發明的絲狀真菌表達人的基因，即來源於人基因組文庫的基因，有許多理由期望得到有效表達。現在知道人的基因平均大小為3000-5000bp，人的內含子平均為 75-150bp (總範圍分布在40至> 50000)，絲狀真菌的內含子為40_7^ρ，但它們能處理鹼基數高達500bp的內含子。人每個基因平均有3-5個內含子(M. Deutsch,M. Long,Nucl. Acids Res. 199927 :3219-32 ；見表B)。已知人的信號序列在真菌中也能正常工作。基於上述理由，很可能大量人基因可用本發明的方法高水平表達和分泌。表B
權利要求
1.一種產生由一組DNA載體庫編碼的多種具有所需活性或特性的蛋白質的方法，其中載體庫包括多種不同的載體，每種不同的載體都包含一種不同的編碼蛋白質的核酸序列， 所述核酸序列可操作地連接於一種表達調控區和任選連接一種分泌信號編碼序列，所述方法包括以下步驟(a)提供一種具有懸浮生長表型特徵的絲狀真菌株，並且具有在懸浮條件下產生可轉移性複製單元的特徵，所述單元是單克隆的，並容易分散；(b)使用上述DNA載體庫穩定轉化上述絲狀真菌株，使每個單一菌株都至少含有至少一種編碼外源蛋白的核酸序列；(c)將轉化的絲狀真菌突變株在有利於形成可轉移性複製單元的懸浮培養條件下培養，所述單元是單克隆的，並容易分散；(d)將多種懸浮的可轉移性複製單元相互分離；和(e)將分離的可轉移複製單元移到第二培養物；和(f)在有利於外源蛋白編碼核酸序列表達外源蛋白的條件下，將在所述第二培養物中的單個可轉移性複製單元培養成單克隆培養物或單克隆。
2.一種在由DNA載體庫編碼的多種蛋白質中篩選具有所需活性或特性蛋白質的方法， 包括以下步驟(a)按照權利要求1的方法在單克隆絲狀真菌培養物或單克隆絲狀真菌克隆中表達多種蛋白質；和(b)篩選單個克隆培養物或克隆菌落的所需活性或特性。
3.一種得到編碼具有所需活性或特性的蛋白質的DNA分子的方法，包括以下步驟(a)按照權利要求1的方法，在單克隆絲狀真菌培養物或單克隆絲狀真菌克隆中表達多種蛋白；(b)在單個克隆培養物或克隆菌落中篩選具有所需特性或活性的蛋白；和(c)從表現出所需特性或活性的克隆培養物或克隆菌落中分離DNA。
4.一種得到編碼具有所需特性或活性蛋白的DNA分子的核苷酸序列的方法，包括以下步驟(a)按照權利要求3的方法從表現出所需特性或活性的克隆培養物或克隆菌落中分離 DNA ；和(b)將上述DNA測序。
5.一種得到具有所需特性或活性蛋白的胺基酸序列的方法，包括以下步驟(a)按照權利要求4的方法，得到編碼具有所需特性或活性蛋白的DNA序列；和(b)將上述DNA序列轉化成胺基酸序列。
6.一種從多種單克隆絲狀真菌培養物或單克隆絲狀真菌克隆中篩選具有所需活性或特性的代謝物的方法，包括以下步驟(a)按照權利要求1的方法，在單克隆絲狀真菌培養物或單克隆絲狀真菌克隆中表達多種蛋白；和(b)在每個單一克隆培養物或克隆菌落中篩選所需特性或活性。
7.一種優化所需蛋白活性或特性的方法，包含如下步驟(a)提供一種包含編碼蛋白質突變型的DNA序列的載體庫；(b)提供一種表型特徵為可懸浮生長和在懸浮條件下產生可轉移複製單元的絲狀真菌株，所述單元是單克隆的，並容易分散；(c)使用上述DNA載體庫穩定轉化上述絲狀真菌株，使每個單一菌株都至少含有一種編碼外源蛋白的核酸序列；(d)在有利於形成可轉移複製單元的條件下培養轉化的絲狀真菌株，所述單元是單克隆的，並容易分散；(e)將多種懸浮的可轉移性複製單元相互分離；(f)在有利於由外源蛋白編碼核酸序列編碼的外源蛋白表達的條件下，將單一可轉移複製單元培養成單克隆培養物或克隆菌落；(g)在各生物體、克隆培養物或克隆菌落中篩選具有所需特性或活性的表達蛋白；(h)分離一個或多個表達具有所需活性或特性蛋白的單一生物體、克隆培養物或克隆菌落；(i)從編碼表現所需活性或特性蛋白的分離的單一生物體、克隆培養物或克隆菌落中分離DNA，並對其進行突變；(j)提供包含⑴步驟中得到的突變DNA序列的載體庫；和(k)重複步驟(b)到(g)直到所需活性或特性達到滿意的水平或不再提高。
8.權利要求7的方法，在步驟(h)和(i)間進一步包含如下步驟培養一個或多個在步驟(h)中分離到的單一生物體，克隆培養物或克隆菌落；分離表現出所需特性或活性的表達蛋白；對所分離蛋白的所需活性進行評價。
9.權利要求2的方法，其中篩選步驟為高通量篩選。
10.權利要求3的方法，其中篩選步驟為高通量篩選。
11.權利要求4的方法，其中篩選步驟為高通量篩選。
12.權利要求5的方法，其中篩選步驟為高通量篩選。
13.權利要求6的方法，其中篩選步驟為高通量篩選。
14.權利要求7的方法，其中篩選步驟為高通量篩選。
15.權利要求8的方法，其中篩選步驟為高通量篩選。
16.權利要求1-15中任一權利要求的方法，其中真菌表型特徵為在優化或近優化條件，有充分營養物的懸浮培養時，發酵終止時培養物粘度小於200cP。
17.權利要求1-15中任一權利要求的方法，其中絲狀真菌表型特徵為在優化或近優化條件，有充分營養物的懸浮培養時，發酵終止時培養物粘度小於lOOcP。
18.權利要求1-15中任一權利要求的方法，其中絲狀真菌表型特徵為在優化或近優化條件，有充分營養物的懸浮培養時，發酵終止時培養物粘度小於60cP。
19.權利要求1-15中任一權利要求的方法，其中絲狀真菌表型特徵為在優化或近優化條件，有充分營養物的懸浮培養時，發酵終止時培養物粘度小於10cP。
20.權利要求1-15中任一權利要求的方法，其中載體包含一種真菌信號序列。
21.權利要求20的方法，其中真菌信號序列是編碼下列蛋白的真菌基因的信號序列 纖維素酶，β -半乳糖苷酶，木聚糖酶，果膠酶，酯酶，蛋白酶，澱粉酶，多聚半乳糖醛酸酶和 hydrophobin0
22.權利要求1-15中任一權利要求的方法，其中載體包含一種編碼選擇性標記的核苷酸序列。
23.權利要求1-15中任一權利要求的方法，其中載體包含一種可操作地與編碼蛋白的核酸序列連接的表達調控區。
24.權利要求23的方法，其中表達調控區包含一種可誘導的啟動子。
25.權利要求1-15中任一權利要求的方法，其中真菌為Euascomycetes類。
26.權利要求25的方法，其中真菌屬於Onygenales目。
27.權利要求25的方法，其中真菌屬於散囊菌目。
28.權利要求1-15中任一權利要求的方法，其中絲狀真菌屬於子囊菌類，限定條件是它們不屬於酵母目。
29.權利要求1-15中任一權利要求的方法，其中絲狀真菌屬於選自麴黴屬，木黴屬，金 ？包屬，鏈孢黴屬，Rhizomucor, Hansenula,腐質黴屬，毛黴屬，Tolypocladium,鐮刀黴屬，青霄屬，Talaromyces, Emericella 禾口 Hypocrea 之一的屬。
30.權利要求四的方法，其中絲狀真菌屬於選自麴黴屬，鐮刀黴屬，金孢屬和木黴屬之一的屬。
31.權利要求30的方法，其中真菌是金孢屬菌株UV18-25，保藏號是VKMF-3631D，具有低粘度表型的它的突變體或衍生物。
32.權利要求1-15中任一權利要求的方法，其中表達的蛋白與生物量之比至少是1 Io
33.權利要求32的方法，其中表達的蛋白與生物量之比至少是2 1。
34.權利要求33的方法，其中表達的蛋白與生物量之比至少是6 1。
35.權利要求34的方法，其中表達的蛋白與生物量之比至少是8 1。
36.權利要求1-15中任一權利要求的方法，其中可轉移的複製單元是單一的真菌細胞。
37.權利要求1-15中任一權利要求的方法，其中可轉移的複製單元是孢子。
38.權利要求1-15中任一權利要求的方法，其中可轉移的複製單元是菌絲片段。
39.權利要求1-15中任一權利要求的方法，其中可轉移的複製單元是菌絲體小塊。
40.權利要求1-15中任一權利要求的方法，其中可轉移的複製單元是原生質體。
41.一種獲得具有所需活性或特徵的蛋白質的方法，包括以下步驟(a)按照權利要求2的方法，從一個由DNA載體庫編碼的眾多蛋白中篩選具有所需活性或特徵的蛋白；(b)在有助於表達由編碼外源蛋白質的核酸序列所編碼的外源蛋白的條件下，培養適當規模的表達所需活性或特徵的單克隆培養物或單克隆菌落；和(c)分離表達的蛋白。
42.一種獲得具有所需活性或特徵的蛋白質的方法，包括用權利要求7或權利要求8的方法優化所需活性或特徵，以適當的規模培養最後一步(h)中分離的單一生物體，克隆培養物，或克隆菌落，並從培養物中分離表達的蛋白。
43.一種構建轉化的絲狀真菌庫的方法，包括以下步驟(a)提供一種具有如下表型特徵的絲狀真菌，在培養液中懸浮生長並在懸浮培養時產生可轉移的複製單元，所述單元是單克隆的，並容易分散；和(b)用一種DNA載體庫穩定地轉化所述絲狀真菌，以使多種單一真菌的每一種都至少轉入一個外源蛋白編碼核酸序列；其中DNA載體庫包括大量不同的載體，各不同載體包含一種不同的蛋白質編碼核酸序列，所述核酸序列可操作地連接於一個表達調控區，並任選連接一個分泌信號編碼序列。
44.按照權利要求40的方法製備的轉化的絲狀真菌庫。
45.一種獲得表達所需活性或特徵的蛋白質的轉化絲狀真菌宿主的方法，包括以下步驟(a)用權利要求2的方法篩選大量由DNA載體庫編碼的蛋白質以獲得所需活性或特徵的蛋白；和(b)分離表達所需活性或特徵的單克隆培養物或單克隆菌落。
全文摘要
本發明提供了一種在絲狀真菌中表達外源基因DNA文庫的方法。該真菌可以處理有內含子的真核基因，並且也可以進行諸如糖基化、蛋白質摺疊的翻譯後加工。本發明提供了形態學改變的真菌的用途，其允許高通量篩選和對表達蛋白直接改造。所述轉化的真菌可以用於生產大量的蛋白質，用來進行蛋白質的分離、測定和應用測試，也許還適合於蛋白質的商業化生產。
文檔編號C12P21/02GK102174551SQ20101062188
公開日2011年9月7日 申請日期2001年4月13日 優先權日2000年4月13日
發明者彼得·揚·蓬特, 科妮莉亞·范塞爾, 科爾內留斯·范登洪德 申請人:戴亞蒂克國際(美國)公司