一種檢測豬瘟病毒ErnsIgM抗體的ELISA試劑盒的製作方法

2023-10-17 20:41:19 2

一種檢測豬瘟病毒Erns IgM抗體的ELISA試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測豬瘟病毒Erns?IgM抗體的ELISA試劑盒，屬於生物技術和動物傳染病診斷研究領域。該ELISA試劑盒包含有：包被抗豬IgM單克隆抗體的酶標板、樣品稀釋液、陽性對照和陰性對照、檢測用抗原（豬瘟病毒Erns蛋白）、濃縮洗滌液、酶結合物、酶顯色底物和終止液。本發明採用捕獲法檢測IgM抗體，夾心法檢測特異的豬瘟病毒Erns?IgM抗體，所製成的試劑盒特異性達100%，靈敏度1:800，可用於對豬瘟病毒感染的診斷及豬瘟疫苗的免疫效果評價。
【專利說明】—種檢測豬瘟病毒Erns IgM抗體的ELISA試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物技術和動物傳染病診斷研究領域，具體涉及一種檢測豬瘟病毒Erns IgM抗體的ELISA試劑盒。
【背景技術】
[0002]豬痕是由豬痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，對養豬業危害嚴重，是世界糧農組織和各國政府嚴密監控和檢疫的主要傳染病
之一 O
[0003]CSFV屬黃病毒科瘟病毒屬成員，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約
12.3kb，僅含有一個大的開放性閱讀框架(ORF)。此ORF翻譯成含3898個胺基酸殘基，分子量約438kDa的多聚蛋白，並進一步在病毒和宿主細胞蛋白酶的作用下加工成結構蛋白和非結構蛋白，其結構蛋白和非結構蛋白在病毒RNA上的編碼順序為Npro、C、Erns (EO)、EUE2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中，除 C、Erns、El 和 E2 為結構蛋白外，其餘均為非結構蛋白。
[0004]豬感染CSFV後主要產生針對結構糖蛋白E0、E2和非結構蛋白NS3的抗體。糖蛋白EO和E2是病毒誘導機體產生中和抗體的兩個主要保護性抗原，同時也是病毒吸附進入敏感細胞的必需蛋白。
[0005]Erns是病毒的一種囊膜糖蛋白，也稱gp44/48,舊稱E0。有9個可能的糖基化位點，去糖基的蛋白骨架分子量約26KDa，由病毒ORF中Glu268_Ala494組成。在感染細胞中Erns在內質網內積累，並可存在於細胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中Erns以97KDa的同源二聚體形式存在於囊膜表面。由於其分子內缺乏疏水的膜錨定區，與病毒囊膜結合力弱，易從囊膜上游離下來。Erns可誘導產生豬瘟的中和抗體，免疫豬可誘導產生對致死量CSFV的保護性免疫。由於編碼Erns的核酸序列在屬內比編碼E2的序列保守程度高，因此Erns可作為防治豬瘟的一種靶蛋白。
[0006]豬瘟病毒的快速檢測對於豬瘟的診斷具有特別重要的意義。目前豬瘟病毒檢測方法主要有應用病毒分離鑑定、免疫組織化學法、反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和Elisa檢測等。其中Elisa檢測法以其快速、方便、敏感等優點，在眾多方法中脫穎而出。但市場中的Elisa試劑盒多為檢測抗E2抗體的試劑盒，而無對Erns IgM抗體的方面的研究。

【發明內容】

[0007]本發明的首要目的在於提供一種檢測豬瘟病毒(CSFV) Erns IgM抗體的ELISA試劑盒。
[0008]本發明的目的還在於提供上述檢測豬瘟病毒Erns IgM抗體的ELISA試劑盒的使用方法。
[0009]為了實現上述目的，本發明採用的以下技術方案:
[0010]一種檢測豬瘟病毒Erns IgM抗體的ELISA試劑盒，包含有:包被抗豬IgM單克隆抗體的酶標板、樣品稀釋液、陽性對照和陰性對照、檢測用抗原、濃縮洗滌液、酶結合物、酶顯色底物和終止液。
[0011]所述的檢測用抗原為重組豬瘟病毒Erns(CSFV-Erns)蛋白，以樣品稀釋液溶解稀釋至5-10 μ g/mL ;優選的，所述的重組豬瘟病毒Erns蛋白通過包含如下步驟的方法製備得到:提取豬瘟病毒的RNA為模板通過反轉錄PCR擴增Erns蛋白目的基因，將目的基因與連接到pET30a載體上再轉入含有PGr07重組質粒表達伴侶蛋白GroEL的BL21 (DE3)進行原核表達、純化得到純化的重組豬瘟病毒Erns蛋白；其中擴增引物為:
[0012]CSFV-Erns 基因上遊引物:5 』 -CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA-3 』，
[0013]CSFV-Erns 基因下遊引物:5 』 -CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3 』。
[0014]所述的包被抗豬IgM單克隆抗體的酶標板，所包被的抗豬IgM單克隆抗體的量優選為0.1-0.5 μ g。所述的抗豬IgM單克隆抗體可商購，或按照包含如下步驟的方法製備:以純化的豬IgM免疫Balb/c小鼠，取免疫成功的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，經克隆與ELISA篩選，最終分別篩選出可識別豬IgM的雜交瘤細胞株，以此雜交瘤細胞株注射至小鼠腹腔生產腹水並用辛酸硫酸銨沉澱法純化腹水得到抗豬IgM單克隆抗體。包被抗豬IgM單克隆抗體的酶標板優選通過包含如下步驟的方法得到:通過將抗豬IgM單克隆抗體用包被緩衝液(0.05mol/L、pH9.6的碳酸鹽緩衝液)稀釋成1_5 μ g/mL，往酶標板上每孔加入100yL，4°C包被過夜;每孔再加入150 μ L封閉液(5_BSA，以0.01mol/L,ρΗ7.2-7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS)配製)，37°C溫育Ih0
[0015]所述的樣品稀釋液優選為含1% BSA、0.1%深海魚明膠、0.02%疊氮化鈉(NaN3)的PBS，其中所述的PBS優選為0.01mol/L, pH值為7.2-7.4的PBS0
[0016]所述的陽性對照為用樣品稀釋液100倍稀釋的含豬瘟病毒Erns IgM抗體的的豬陽性血清，此血清為以豬瘟兔化弱毒苗免疫獲得；所述的陰性對照為用樣品稀釋液100倍稀釋的未感染過豬瘟病毒且未以豬瘟疫苗免疫過的健康豬陰性血清。
[0017]所述的濃縮洗滌液(IOX)優選為含0.5% Tween20的0.lmol/L、ρΗ7.2-7.4的PBS，使用前用去離子水做10倍稀釋。
[0018]所述的酶結合物優選為辣根過氧化物酶標記的抗豬瘟病毒Erns單克隆抗體，其工作濃度為10-20 μ g/mL，優選通過包含如下步驟的方法製備:
[0019]I)製備抗豬瘟病毒Erns單克隆抗體:用純化的重組豬瘟病毒Erns蛋白免疫Balb/c小鼠，三免後，取Elisa效價達到1:10000的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，以HAT培養基選擇性培養後，進行間接Elisa檢測，挑選出陽性孔進行亞克隆；再取亞克隆孔進行間接Elisa檢測，挑選出陽性孔轉入24孔板進行第二次亞克隆；對二亞細胞株進行間接Elisa檢測及免疫螢光篩選出抗豬瘟病毒Erns蛋白的單克隆雜交瘤細胞株；將此雜交瘤細胞株進行凍存，同時打3隻小鼠製備腹水，將製得的小鼠腹水以辛酸硫酸銨沉澱法純化、透析，製得抗豬瘟病毒Erns蛋白單克隆抗體。
[0020]2)將抗豬瘟病毒Erns單克隆抗體進行辣根過氧化物酶標記，其步驟是:稱取5mgHRP溶於0.5mL蒸餾水中，加入新鮮配製的0.06mol/L NaIO4水溶液0.5mL,混勻置冰箱4度反應30分鐘，取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL,於室溫避光反應30分鐘後加入含5mg抗豬痕病毒Erns單克隆抗體的水溶液ImL,混勻並裝透析袋與0.05mol/L、pH9.5碳酸鹽緩衝液緩慢攪拌透析6h或過夜，使之結合；然後吸出加入NaBH4溶液(5mg/mL) 0.2mL,置冰箱4度2h，取出加入等體積飽和硫酸銨；放冰箱4度30min後離心，將所得沉澱物溶於少量0.02mol/L、pH7.4PBS中，並透析過夜；次日再離心除去不溶物，即得HRP標記的抗豬瘟病毒Erns單克隆抗體；用0.02mol/L、pH7.4PBS加至5mL，再以Bradford法測定濃度，然後以酶標抗體稀釋液(可商購)稀釋至10-20 μ g/mL製成酶結合物工作液。
[0021]所述的酶顯色底物優選為TMB顯色液。
[0022]所述的終止液優選為lmol/L的H2SO4溶液。
[0023]上述檢測豬瘟病毒(CSFV)Erns IgM抗體的ELISA試劑盒的使用方法，包括如下步驟:
[0024](I)將待測血清或其它樣品用樣品稀釋液按1:100稀釋，每孔100 μ L加入酶標板中，平行加樣2~6個孔，同時設置陽性對照組、陰性對照組及空白對照組；其中陽性對照組加入100 μ L陽性對照液、陰性對照組加入100 μ L陰性對照液、空白對照組加入100 μ L樣品稀釋液，每組對照平行加樣2~6個孔。
[0025](2)加樣完成後，輕振酶標板混勻孔中樣品，37°C孵育1小時。
[0026](3)棄去孔中溶液，洗滌液清洗3~5次，最後一次在吸水紙上拍幹。
[0027](4)每孔加入100 μ L檢測用抗原(重組豬瘟病毒Erns蛋白，樣品稀釋液溶解，濃度 5-10 μ g/mL)，37°C孵育 I 小時。
[0028](5)重複步驟(3)，每孔加入酶結合物100μ L，37°C孵育I小時。
[0029](6)重複步驟(3)，每孔加入酶顯色底物100 μ L,室溫避光反應10_15分鐘。
[0030](7)每孔加入100 μ L終止液，將酶標板置於酶標儀測定450nm吸光度值(OD45tlnm)。
[0031](8)結果計算與判定:檢測中陽性對照血清的OD值與陰性對照血清的OD值之差必須大於0.4時，檢測被認為有效；Cut off (CO值)=陰性對照光吸收值OD45tolX 2.1倍，樣品值=樣品光吸收值0D45tol/C0值，其中，樣品值> I為陽性；樣品值≤I為陰性。
[0032]與現有技術相比，本發明的試劑盒具有以下優點和效果:
[0033](I)本發明的檢測豬瘟病毒(CSFV)Erns IgM抗體的ELISA試劑盒採用豬IgM單克隆抗體製備酶標板，進而組成雙抗夾心法Elisa檢測豬瘟病毒Erns特異性IgM抗體的試劑盒，顯著提高了檢測的靈敏度和特異性。
[0034](2)本發明通過採用伴侶蛋白表達系統原核表達豬瘟病毒(CSFV)Erns蛋白，成功的使Erns蛋白在上清中表達，並提高了表達量。
[0035](3)本發明採用捕獲法檢測IgM抗體，夾心法檢測特異的(CSFV)Erns IgM抗體，所製成的試劑盒特異性達100%，靈敏度高於1:800，可用於對豬瘟病毒感染的診斷及豬瘟疫苗的免疫效果評價。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1本發明製備的重組豬瘟病毒(CSFV)Erns蛋白小量表達SDS-PAGE圖。
[0037]圖2本發明製備的重組豬瘟病毒(CSFV)Erns蛋白純化後的SDS-PAGE圖。
【具體實施方式】
[0038]下面結合實施例及附圖對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。[0039]實施例1重組豬瘟病毒Erns蛋白的製備
[0040](I)根據NCBI GeneBank中豬瘟病毒石門株全基因組序列(登錄號AF333000.1)，以豬瘟病毒石門株囊膜蛋白Erns全序列及E2主要抗原區B/C區和D/A區的基因序列為模板設計合成引物，
[0041]CSFV-Erns 基因上遊引物為:5』 -CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA-3，,
[0042]CSFV-Erns 基因下遊引物為:5』 -CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3，；
[0043]其中，下劃線部分為引入的酶切位點，上遊引物引入的酶切位點為BamHI，下遊引物引入的酶切位點為XhoI。以從豬瘟病毒石門株中提取的RNA為模板進行反轉錄PCR，獲取Erns蛋白目的基因。
[0044](2)構建重組表達載體:將表達質粒pET30a用限制性內切酶和上述擴增的Erns蛋白目的基因用BamHI和XhoI進行雙酶切，酶切產物經瓊脂糖電泳後，用凝膠回收試劑盒(購自Invitrogen公司)回收DNA片段，用T4DNA連接酶連接回收的DNA片段。
[0045](3)將步驟2)中所得連接產物轉化大腸桿菌DH5CI，根據重組載體的標誌(抗Kan或藍白斑)作篩選，挑取單斑，菌落PCR初步鑑定。
[0046](4)重組表達載體的鑑定:提取質粒，進行雙酶切鑑定，獲得了約為680bp的DNA片段，與預期的CSFV-Erns (681bp)大小一致。將酶切片段與預期相符的CSFV-Erns陽性克隆送至華大基因公司測序，結果插入的位置、方向、大小、讀碼框及核苷酸序列均正確，將該重組表達載體命名為pET30a-Erns。
[0047](5)伴侶蛋白感受態表達宿主菌的製作:為了提高CSFV-Erns在上清表達的機率，將測序正確的重組質粒pET30a-Erns轉化到含有PGr07重組質粒表達伴侶蛋白GroEL的BL21(DE3)感受態細胞中。
[0048](6)小量誘導表達:挑取轉化平板上的單菌落接種到3mL LB培養液(需加入終濃度0.05-0.lg/L的卡那黴素和氯黴素兩種抗生素)中，37°C、180rpm將細菌培養至OD6tltl =
0.2 ;加入0.1-0.5mmol/L伴侶蛋白的誘導劑四環素或L-阿拉伯糖，37°C、180rpm繼續將細菌培養至OD6tltl = 1.0 ;加入終濃度為0.5mM的IPTG，30°C、180rpm誘導過夜。
[0049](7)表達蛋白的鑑定:將誘導過夜的宿主菌收集、破碎，進行SDS-PAGE電泳；電泳結束後，經染色和脫色後發現，誘導表達的pET30a-Erns重組菌在60KD處有明顯的伴侶蛋白GroEL表達，在26KD處有明顯的重組蛋白Erns表達，說明表達成功(圖1)。
[0050](8)重組CSFV-Erns蛋白的大量誘導表達:將含有正確表達載體的大腸桿菌接種於大量培養液中以小量誘導相同條件誘導表達，培養結束後離心收集菌液，超聲波裂解菌液菌液澄清或疏散狀態；11000rpm、4°C離心30min，將上清與沉澱分離，保存於4°C。取上清與沉澱樣品進行SDS-PAGE，發現重組CSFV-Erns在上清表達。
[0051](9)重組CSFV-Erns蛋白的純化:按照N1-NTA瓊脂糖柱(Qiagen，貨號30210)說明書純化，純化的SDS-PAGE電泳重組CSFV-Erns蛋白SDS-PAGE結果見圖2。
[0052]實施例2抗豬瘟病毒Erns蛋白(CSFV-Erns) IgG單克隆抗體的製備
[0053](I)將實施例1純化的重組CSFV-Erns蛋白免疫Balb/c小鼠，三免後，取Elisa效價達到1:10000的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，以HAT培養基37°C、飽和溼度、5% CO2培養融合細胞。
[0054](2)融合後第四天開始觀察集落，待集落生長至孔底約1/6時半量換HT培養基，次日分別以重組CSFV-Erns蛋白包板進行間接Elisa檢測，挑選出陽性孔進行亞克隆。
[0055](3)亞克隆:鏡下觀察陽性孔細胞，選擇細胞形態好的集落以有限稀釋法進行亞克隆。亞克隆板第5天以CSFV陽性血清1:1000包板進行間接Elisa檢測，挑選出陽性孔轉入24孔板進行第二次亞克隆。
[0056](4) 二次亞克隆第5天，取培養上清同步進行免疫螢光(IF)及以下三種Elisa檢測:
[0057]A.以重組CSFV-Erns蛋白包板的間接Elisa檢測。
[0058]B.以CSFV陽性血清1:1000包板的間接Elisa檢測。
[0059]C.先以CSFV-Erns中和抗CSFV-Erns的陽性孔上清，將中和後的上清進行B檢測。
[0060]最終篩選出同時滿足免疫螢光(IF)陽性及A、B檢測陽性和C檢測陰性的抗CSFV-Erns雜交瘤細胞株，此雜交瘤細胞株即為可識別豬瘟病毒Erns蛋白的細胞株。
[0061](5)細胞株凍存及腹水製備:將上述成功建株的雜交瘤細胞株進行凍存，同時打3隻小鼠製備腹水，每隻小鼠腹腔注射細胞量為5 X IO5?I X IO6個/0.5mL。
[0062](6)將製得的小鼠腹水以辛酸硫酸銨沉澱法純化、透析，製得抗豬瘟病毒Erns蛋白(CSFV-Erns) IgG單克隆抗體。
[0063]實施例3檢測豬瘟病毒(CSFV) Erns IgM抗體的ELISA試劑盒的製備
[0064](I)包被抗豬IgM單克隆抗體的酶標板:將抗豬IgM單克隆抗體以包被緩衝液稀釋成I μ g/mL,每孔加100 μ L，4°C包被過夜；以洗滌液洗滌2?3次，拍幹；每孔加150 μ L封閉液，37°C溫育lh，洗滌液洗滌2?3次，拍幹。其中，包被緩衝液為0.05mol/L pH9.6碳酸鹽緩衝液，其配製為:準確稱取1.59g碳酸鈉，2.93g碳酸氫鈉，加蒸餾水至IOOOmL ;封閉液為以0.01mol/L、pH7.2-7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS)溶解的濃度為5%的BSA ;洗滌液為濃縮洗滌液稀釋10倍後製成的工作液。
[0065](2)樣品稀釋液:在0.01mol/L、pH7.2-7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS)中加入I % (m/v)BSA、0.1% (m/v)深海魚明膠、0.02% (m/v)疊氮化鈉(NaN3)配製而成。
[0066](3)陽性對照液:採集以豬瘟兔化弱毒苗免疫獲得的含豬瘟病毒Erns IgM抗體的豬陽性血清，以樣品稀釋液100倍稀釋。陰性對照液:採集未感染過豬瘟病毒且未以豬瘟疫苗免疫過的健康豬血清，以樣品稀釋液100倍稀釋。
[0067](4)檢測用抗原為實施例1純化的重組CSFV-Erns蛋白，以樣品稀釋液溶解稀釋至5-10 μ g/mL。
[0068](5)濃縮洗滌液(IOX):在0.lmol/L、pH7.2-7.4的PBS中加入體積比為0.5%的Tween20,使用前用去離子水做10倍稀釋。
[0069](6)酶結合物為辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗豬瘟病毒Erns單克隆抗體，將實施例2製得的抗豬瘟病毒Erns蛋白IgG單克隆抗體進行辣根過氧化物酶標記，其步驟是:
[0070]I)稱取5mg HRP溶於0.5mL蒸餾水中，加入新鮮配製的0.06mol/L NaIO4水溶液
0.5mL,混勻置冰箱4度反應30分鐘；
[0071]2)取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL,於室溫避光反應30分鐘；
[0072]3)加入含5mg抗豬痕病毒Erns蛋白IgG單克隆抗體的水溶液ImL,混勻並裝透析袋與0.05mol/L, pH9.5碳酸鹽緩衝液緩慢攪拌透析6h或過夜，使之結合；
[0073]4)吸出加入NaBH4溶液(5mg/ml) 0.2mL,置冰箱4度2h，取出加入等體積飽和硫酸銨；放冰箱4度30min後離心，將所得沉澱物溶於少量0.02mol/L、pH7.4PBS中，並透析過夜；
[0074]5)次日再離心除去不溶物，即得HRP標記的抗豬瘟病毒Erns單克隆抗體，用
0.02mol/L、pH7.4PBS加至5mL,再以Bradford法測定濃度,然後以酶標抗體稀釋液(可商購)稀釋至10-20 μ g/mL。
[0075](7)酶顯色底物:為購自Sigma的商用即用型單一溶液TMB顯色液(貨號:T8665)
[0076](8)終止液:取54.3mL濃度為95 %的濃硫酸，加蒸餾水至1000mL,製成濃度為ImolA^AH2SO4 溶液。
[0077]實施例4檢測豬瘟病毒Erns IgM抗體的ELISA試劑盒的使用方法
[0078]利用本發明的檢測豬瘟病毒Erns IgM抗體的ELISA試劑盒在檢測豬瘟病毒中的應用，其步驟是:
[0079](I)從試劑盒中取出酶標板，將待測血清或其它樣品用樣品稀釋液按1:100稀釋，每孔100 μ L加入酶標板中，平行加樣2~6個孔，同時設置陽性對照組、陰性對照組及空白對照組，其中陽性對照組加入100μ L陽性對照液、陰性對照組加入100μ L陰性對照液、空白對照組加入100 μ L樣品稀釋液，每組對照平行加樣2~6個孔。
[0080](2)加樣完成後，輕振酶標板混勻孔中樣品，37°C孵育I小時。 [0081](3)棄去孔中溶液，洗滌液清洗3~5次，最後一次在吸水紙上拍幹。
[0082](4)每孔加入100μ L檢測用抗原，37°C孵育I小時。
[0083](5)重複步驟(3)，每孔加入酶結合物100μ L，37°C孵育I小時。
[0084](6)重複步驟(3)，每孔加入酶顯色底物100 μ L,室溫避光反應10_15分鐘。
[0085](7)每孔加入100 μ L終止液，將酶標板置於酶標儀測定450nm吸光度值(OD45tlnm)。
[0086](8)結果計算與判定:檢測測中陽性對照血清的OD值與陰性對照血清的OD值之差必須大於0.4時，檢測被認為有效；Cut off (CO值)=陰性對照光吸收值OD45tlnmX 2.1倍，樣品值=樣品光吸收值0D45tol/C0值，其中，樣品值> I為陽性；樣品值≤I為陰性。
[0087]實施例5檢測豬瘟病毒Erns IgM抗體的ELISA試劑盒的特異性、靈敏度測試
[0088](I)特異性檢測
[0089]按實施例4所述的檢測方法，利用實施例3製得的試劑盒分別檢測豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)免疫早期(7-14天)血清、豬瘟病毒(CSFV)感染早期(7_14天)的血清、純化的CSFV-Erns IgG抗體(實施例2製得)、豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV，又稱豬藍耳病毒)感染的血清、豬圓環病毒2型(PCV2)感染的血清、豬偽狂犬病毒(PRV)感染的血清、豬乙型腦炎病毒(JEV)感染的血清和豬瘟病毒陰性血清。
[0090]每種血清平行加樣三個孔，測定OD45tlnm值，計算其OD45tlnm平均值。結果如下表所示:
[0091]
【權利要求】
1.一種檢測豬瘟病毒Erns IgM抗體的ELISA試劑盒，其特徵在於包含有:包被抗豬IgM單克隆抗體的酶標板、樣品稀釋液、陽性對照和陰性對照、檢測用抗原、濃縮洗滌液、酶結合物、酶顯色底物和終止液；所述的檢測用抗原為豬瘟病毒Erns蛋白。
2.根據權利要求1所述的檢測豬瘟病毒ErnsIgM抗體的ELISA試劑盒，其特徵在於:所述的檢測用抗原的濃度為5-10μ g/mL ;所述的豬瘟病毒Erns蛋白通過包含如下步驟的方法製備得到:提取豬瘟病毒的RNA為模板通過反轉錄PCR擴增Erns蛋白目的基因，將目的基因與連接到pET30a載體上再轉入含有PGr07重組質粒表達伴侶蛋白GroEL的BL21進行原核表達、純化得到純化的重組豬瘟病毒Erns蛋白；其中擴增引物為: CSFV-Erns 基因上遊引物:5』 -CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA-3』， CSFV-Erns 基因下遊引物:5』 -CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3』。
3.根據權利要求1所述的檢測豬瘟病毒ErnsIgM抗體的ELISA試劑盒，其特徵在於:所述的包被抗豬IgM單克隆抗體的酶標板所包被的抗豬IgM單克隆抗體的量為0.1-0.5 μ go
4.根據權利要求1所述的檢測豬瘟病毒ErnsIgM抗體的ELISA試劑盒，其特徵在於:所述的樣品稀釋液為含1% BSA、0.1%深海魚明膠、0.02%疊氮化鈉的PBS。
5.根據權利要求1所述的檢測豬瘟病毒ErnsIgM抗體的ELISA試劑盒，其特徵在於:所述的陽性對照為用樣品稀釋液100倍稀釋的含豬瘟病毒Erns IgM抗體的的豬陽性血清；所述的陰性對 照為用樣品稀釋液100倍稀釋的未感染過豬瘟病毒且未以豬瘟疫苗免疫過的健康豬陰性血清。
6.根據權利要求1所述的檢測豬瘟病毒ErnsIgM抗體的ELISA試劑盒，其特徵在於:所述的濃縮洗滌液為含0.5% Tween20的0.lmol/L、pH7.2-7.4的PBS，使用前用去離子水做10倍稀釋。
7.根據權利要求1所述的檢測豬瘟病毒ErnsIgM抗體的ELISA試劑盒，其特徵在於:所述的酶結合物為辣根過氧化物酶標記的抗豬瘟病毒Erns單克隆抗體，其濃度為10-20 μ g/mL。
8.根據權利要求1所述的檢測豬瘟病毒ErnsIgM抗體的ELISA試劑盒，其特徵在於:所述的酶顯色底物為TMB顯色液。
9.根據權利要求1所述的檢測豬瘟病毒ErnsIgM抗體的ELISA試劑盒，其特徵在於:所述的終止液為lmol/L的H2SO4溶液。
10.權利要求1-9任一項所述的檢測豬瘟病毒ErnsIgM抗體的ELISA試劑盒的使用方法，其特徵在於包括如下步驟: (1)將待測血清或其它樣品用樣品稀釋液按1:100稀釋，每孔100μ L加入酶標板中，平行加樣2~6個孔，同時設置陽性對照組、陰性對照組及空白對照組；其中陽性對照組加Λ IOOyL陽性對照液、陰性對照組加入100 μ L陰性對照液、空白對照組加入100 μ L樣品稀釋液，每組對照平行加樣2~6個孔； (2)加樣完成後,輕振酶標板混勾孔中樣品,37C鮮育I小時； (3)棄去孔中溶液，洗滌液清洗3~5次，最後一次在吸水紙上拍幹； (4)每孔加入100μ L檢測用抗原，37°C孵育I小時； (5)重複步驟(3)，每孔加入酶結合物100μL，37°C孵育I小時；(6)重複步驟(3)，每孔加入酶顯色底物100μ L，室溫避光反應10-15分鐘； (7)每孔加入100μ L終止液，將酶標板置於酶標儀測定450nm吸光度值； (8)結果計算與判定:檢測中陽性對照血清的OD值與陰性對照血清的OD值之差必須大於0.4時，檢測被認為有效；C0值=陰性對照光吸收值OD45tolX 2.1倍，樣品值=樣品光吸收值0D450nm/C0值，其中，樣品 值> 1為陽性；樣品值≤1為陰性。
【文檔編號】G01N33/577GK103983782SQ201410250235
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月6日 優先權日:2014年6月6日
【發明者】李建, 漆世華, 韓興, 舒銀輝, 廖園園, 劉潔, 謝紅玲, 秦紅剛, 徐松, 牟林琳, 朱薇, 溫文生 申請人:武漢中博生物股份有限公司