免疫調節疫苗的製作方法

2023-10-17 10:43:59

免疫調節疫苗的製作方法
【專利摘要】一種免疫調節疫苗，其包括-導向佐劑，其包括連接至TLR9配體和第一肽α-螺旋的至少抗CD32部分，和-免疫原，其具有至少一個表位和與第一α-螺旋纏繞的第二肽α-螺旋，一種用於製備疫苗的試劑盒，和一種致敏疫苗，其包括在藥物製劑中的連接至TLR9配體和肽的α-螺旋的至少抗CD32部分。
【專利說明】免疫調節疫苗

【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫調節疫苗，其包括免疫原和與之連接、由此調節對免疫原的免疫 應答的導向佐劑（directedadjuvant)。本發明進一步涉及包括免疫原性組合物的疫苗，所 述免疫原性組合物包括
[0002] -導向佐劑，其至少包括連接至TLR9配體的抗⑶32部分，和
[0003] _免疫原，其結合至所述導向佐劑；
[0004] 其用於治療受試者以誘發針對免疫原的瞬時IgG免疫應答。

【背景技術】
[0005] 對於包括變態反應（allergy)、癌症和自身免疫病等的免疫疾病，由Thl/Th2/ Thl7/Treg細胞調節的免疫平衡調節及其在新免疫治療開發中的應用起到重要作用。
[0006] Thl細胞（1型輔助T細胞）的特徵在於產生促炎性細胞因子如IFN-y、IL-2和 TNF-0。Thl細胞參與細胞介導的免疫。由Thl細胞產生的細胞因子刺激微生物病原體的 吞噬和破壞。幾種慢性炎性疾病已描述為Thl主導的疾病，即多發性硬化症、糖尿病和類風 溼性關節炎。
[0007] Th2細胞（2型輔助T細胞）的特徵在於產生IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13。 Th2細胞被認為在變態反應響應中起作用。細胞因子如IL-4通常刺激抗體的產生。IL-5刺 激嗜酸性細胞應答，也是免疫應答的一部分。特應性（atopy)和變態反應被認為是Th2主 導病況。
[0008] Thl/Th2或Thl7/Treg免疫失衡成為各種免疫疾病的原因。
[0009] 變態反應被認為是對環境中的蛋白質的超敏反應。變應原（allergen)為特應 性患者在IgE抗體應答隨後導致變態性反應下應答的抗原。複合體或融合蛋白中的抗原 可為環境變應原（如室塵蟎（housedustmite)、樺樹花粉（birchpollen)、草的花粉 (grasspollen)、貓抗原、蟑螂抗原），或食品變應原（如牛奶、花生、蝦、大豆），或二者的 組合。IgE分子因其在效應細胞（肥大細胞、嗜鹼性粒細胞（basophiles)和嗜酸性粒細胞 (eosinophiles))激活中的作用而是重要的。普遍接受的是，IgE還通過上調B細胞和樹突 細胞（DC)的抗原捕獲潛能（二者藉助於低親和性受體（CD23)和高親和性受體（FeeRI)) 而在變態反應性疾病的誘導階段起到重要作用。IgE抗體的消極作用可由變應原特異性 IgG抗體抵消，例如因為它們引導免疫應答遠離B細胞轉向單核細胞和DC，且它們能夠通過 這些細胞上的FeeRI與FeyRIIb(⑶32b)共交聯來下調IgE受體介導的效應細胞的活化。 另外，它們與IgE分子競爭變應原結合位點。由此，可通過變應原特異性IgG分子（特別是 IgGl)的誘導而治療、治癒和預防變態反應。
[0010] 與IgE分子的大致3天的血清半衰期相比，IgG分子具有大約3周的血清半衰期。 IgE分子通過(nalfve)B細胞和Th2細胞之間的相互作用誘導，這提供IL-4和IL-13並伴隨 ⑶40L表達，這在記憶B細胞和眾細胞中是將類別開關（classswitch)誘導為IgE所必需 的。相反，產生IFN-Y和IL-2的Thl細胞將類別開關誘導為IgG。因此，Thl而不是Th2 輔助T細胞對變應原應答的誘導有益於預防、治療和治癒變態反應性疾病。
[0011] 迄今為止，使用變應原的若干種主動免疫得到應用。最常見的是所謂的"免疫治 療"，其依賴於以相對高濃度的變應原頻繁免疫。該技術僅在少數變態反應性疾病如蜂毒變 態反應以及在鼻炎和結膜炎的某些情況中適度有效，最近某些報導已顯示在較溫和形式的 哮喘和過敏性皮炎中的有效性。更近一些，已施用其中將增加量的變應原在相當短的時間 範圍內注射的快速免疫治療，其結果稍勝一籌。通常，皮下途徑用於變應原給藥，但最近該 途徑已與口服或者甚至局部施用進行了比較，結果一般是陽性的，但並不總是一致。不同的 免疫治療技術為Saint-Remy描述的一種技術（EP0178085和EP0287361)，其中使用了在體 外與相關變應原複合的自身IgG抗體。該技術允許施用相當少量的變應原，並具有較少的 副作用。
[0012] 這些治療背後的機理尚未清楚。在傳統治療中，如果該治療誘導特異性IgG抗體 增加，則似乎存在有益效果，儘管不是每種特異性IgG的顯著增加都與成功的免疫治療相 關。之所以如此的可能觀點是IgG抗體對B細胞、單核細胞和肥大細胞上的CD32的親和性 相對低。Saint-Remy法從患者選擇特異性IgG抗體，隨後將其於相關的變應原體外混合。 這樣，它們確保變應原不能與細胞或細胞上的其它抗體同種型如肥大細胞上的IgE自由反 應。另外，它們聲稱抗獨特型（anti-idiotypic)抗體相對於特異性IgG分子升高，其此後 會防止變態反應。
[0013] 在WO97/07218中記載了變應原-抗⑶32融合蛋白。在該公報中，避免了分離特 異性IgG分子和這些IgG抗體對CD32的親和性低的問題，並且降低了使用完整的"IgE結 合"變應原的傳統免疫治療的風險因素。然而，所聲稱的由於將含抗CD32的疫苗單獨導向 到樹突細胞所造成的Thl記憶應答的誘導並沒有被證實。
[0014] W02007098934A1描述了能夠結合至TLR9和CD32的包括至少一個抗原的至少一個 表位的分子，其生產和其作為藥劑的用途，特別是用於變態反應治療的用途。
[0015] 免疫調節不僅可在變態反應性疾病的情況下起作用，而且還可在一系列其它疾病 中起作用。
[0016] 增強對感染劑（infectiousagents)如微生物病原體的免疫應答是預防性或治療 性抗感染免疫治療的目標。
[0017] 在腫瘤免疫治療中，目標也是使用除了細胞毒性T淋巴細胞（CTL)以外的腫瘤抗 原特異性T輔助型I(Thl)細胞。
[0018] 醫學上已知為惡性贅生物的癌症是一組廣泛的各種疾病，它們全部涉及沒有調節 的細胞生長。在癌症中，細胞不可控制地分裂和生長，形成惡性腫瘤，並侵襲身體的附近部 位。癌症還可通過淋巴系統或血流擴散至身體更遠的部位。並不是所有的腫瘤都是癌性的。 良性腫瘤不是不可控地生長，不侵襲近旁組織，且不擴散至全身。有超過200種折磨人類的 不同已知癌症。
[0019] 確定癌症的原因是複雜的。已知許多東西增加癌症的風險，包括使用菸草、某些感 染、輻射、缺乏身體運動、肥胖症和環境汙染物。這些可直接損傷基因或與細胞內已存在的 遺傳缺陷組合而引起疾病。大約5至10%的癌症是完全遺傳的。
[0020] 癌症可以以多種方式檢測，包括某些體徵和症狀的存在、篩選試驗或醫學影像。一 旦檢測到可能的癌症，通過組織樣品的鏡檢來診斷。癌症通常用化學治療、輻射治療和手術 治療。疾病生存的機率根據癌症的類型和位置以及開始治療時疾病的程度而大幅變化。雖 然癌症可影響所有年齡的人群，並且少數類型的癌症更常見於兒童中，但癌症發展的風險 通常隨年齡增加。2007年，全球範圍內癌症導致全部人類的約13%死亡（790萬）。比例隨 著更多人群的老齡化和隨著在發展世界中發生大眾生活方式的改變而升高。
[0021] 由於免疫系統基於自身與非自身之間的區別而對其遭遇的環境因素應答，所以因 癌症發病而出現的多種腫瘤細胞或多或少地耐受患者的自身免疫系統，這是因為腫瘤細胞 本質上是在沒有適當地調節控制下生長、分裂和擴散的患者自身的細胞。
[0022] 免疫耐受或免疫學耐受為免疫系統不攻擊抗原的過程。在天然耐受或自身耐受 中，身體不增加對自體抗原（self-antigen)的免疫應答。其以三種形式出現：中樞耐受、夕卜 周耐受和獲得的耐受。
[0023] 中樞耐誇1:
[0024] 中樞耐受發生在淋巴細胞發育期間並在胸腺和骨髓中運行。這裡，識別自體抗原 的T和B淋巴細胞在它們發育成完全免疫活性細胞之前被刪除，防止自身免疫。該過程在 胎兒生命中最活躍，但隨著不成熟淋巴細胞的產生而貫穿整個生命繼續進行。
[0025] 外周耐
[0026] 外周耐受為在T和B細胞成熟後發展並進入外周的免疫學耐受。離開胸腺的T細 胞相對但不是完全安全。某些將具有可對自體抗原響應的受體（TCRs)，所述自體抗原以足 夠高的濃度存在，以致它們能夠結合至在胸腺中T細胞不會遇到的"弱"受體（例如，組織 特異性分子，諸如朗格罕氏島（isletsofLangerhans)、腦或脊髓中的那些）。胸腺中逃脫 胸腺內陰性選擇的那些自身反應性T細胞可造成細胞損傷，除非它們被刪除或被有效地控 制在外周組織中。已知存在沉默此類潛在自身反應性T細胞的幾種反饋機制。它們包括下 述：無變態反應性（anergy)、活化誘導的細胞死亡、外周抑制。
[0027] 獲得的或誘導的耐
[0028] 獲得的或誘導的耐受是指免疫系統對外部抗原的適應，其特徵在於胸腺組織對在 其它環境中會很可能誘導細胞介導的免疫或體液免疫的給定抗原的特異的非反應性。最重 要的天然類型的獲得的耐受之一為妊娠免疫耐受，此時胎兒和胎盤必須被母體免疫系統耐 受。
[0029] 靶向腫瘤相關抗原的免痔治療:
[0030] 癌症免疫治療是使用免疫系統來排斥癌症。主要的前提是刺激患者的免疫系統 來攻擊引起疾病的惡性腫瘤細胞。這可通過患者的主動免疫（例如，通過給藥細胞癌症疫 苗，如普羅文奇（Provenge)，Dendreon，西雅圖，華盛頓，US)4來進行，在該情況中患者的自 身免疫系統訓練為識別腫瘤細胞作為要摧毀的靶標，或者通過給藥治療性抗體作為藥物來 進行，在該情況中患者的免疫系統被招募來通過治療性抗體來破壞腫瘤細胞。活化患者免 疫系統對抗腫瘤的另一方法為使用所謂的腫瘤相關抗原（TAA's)，該腫瘤相關抗原為自身 蛋白質，其在健康正常細胞中在一定程度上表達，但在腫瘤細胞中過表達，或者它們包括使 腫瘤細胞增殖的細胞激素/生長因子 5。這些TAAs製成製劑並以免疫原性的方式呈遞至體 內，以使免疫系統將建立應答，儘管事實是這些蛋白質是自身的。很明顯，該方法僅對患者 已發育外周或獲得的耐受所對抗的TAAs有用。當識別TAA的T和B細胞已從免疫學組庫 (immunologicalrepertoire)中刪除時，主動癌症免疫治療並不是一個選項。
[0031] 胃泌素:
[0032] 可用作治療消化系統癌症（gastrointestinalcancers)如胰腺癌的祀標的自 身抗原（autoantigen)(激素/生長因子）的實例為小胃泌素（littlegastrin) (G17)6A 另外，G17的中和還可有益於任意胃泌素相關的病況，包括胃潰瘍、胃食管反流病（Gastro EsophagealRefluxDiseas,GERD)1(1，這是由於胃的pH受胃泌素調控，而對於終末期腎衰竭 (EndStageRenalFailure,ESRF)n，貝丨」是由於在ESRF患者中胃泌素在高於正常濃度下循 環。
[0033] US5023077描述了免疫原性組合物和用於治療和預防胃和十二指腸潰瘍病的方 法，該免疫原性組合物基於胃泌素肽，該胃泌素肽偶聯至免疫原性載體，例如白喉類毒素、 破傷風類毒素、鑰孔戚血藍蛋白（keyholelimpethemocyanin)或牛血清白蛋白。
[0034] 胃泌素在胃腸道具有一些重要的功能，兩個最重要的是刺激胃腸道 中的酸分泌和刺激胃腸道中的細胞生長。激素以至少兩種分子形式存在， 十七胃泌素（heptadecagastrin)，所謂的小胃泌素（〃G17〃），和三十四胃泌素 (tetratriacontagastrin) (〃G34〃），其根據每個分子中的胺基酸殘基（〃AA〃）數命名，其中 G17構成G34的17個氨基末端（"N-末端〃）。
[0035] US5609870描述了抗-G17免疫原的製備，這在哺乳動物中產生抗其自身G17的不 與G34反應的抗體，所述製備包括使由對應於G17的N末端胺基酸序列直至其C末端的氨 基酸殘基數為12的片段序列組成的肽綴合至間隔子肽，所述間隔子肽綴合於免疫原性載 體如白喉類毒素、破傷風類毒素、鑰孔戚血藍蛋白或牛血清白蛋白。
[0036] 免痔平衡:
[0037] 受Thl/Th2/Thl7/Treg細胞調控的免疫平衡在免疫治療開發中扮演重要作用。
[0038] 自身免疫病中需要調控Thl/Th2/Thl7/Treg失衡，g卩，在免疫系統攻擊自身組織 的情況下。
[0039] TLR9 的作用：
[0040]Toll-樣受體（TLRs)是一類在固有免疫系統中起到關鍵作用的蛋白質。它們是單 鏈、跨膜的非催化性受體，通常在細胞表面上和崗哨細胞如巨噬細胞和樹突細胞的內吞小 泡中表達。TLR識別病原體相關分子模式（PAMPs)(其為結構上保守的分子，源自微生物）， 並且起始信號轉導以誘導固有免疫和隨後的適應性免疫所需的細胞因子的產生。
[0041] 各種TLR顯示不同的表達模式。該基因傾向於在免疫細胞富集的組織中表達，例 如腎臟、淋巴結、骨髓和外周血白細胞。
[0042]已在人類和小鼠中共鑑定出了十三種TLR(簡單命名為TLRl至TLR13，並且已經在 其它哺乳動物物種中發現了這些中的許多的TLR的等同形式。然而，不是小鼠中的每個TLR 受體也都發現於人類中，反之亦然。另外，不是每個TLR受體的配體和功能是已知的，例如 TLR10為具有未知功能的孤兒受體（orphanreceptor)。
[0043] TLR受體的活化已用於治療各種疾病，例如TLR9被藥劑活化已顯示有益於治療變 態反應和腫瘤。小鼠和人類中的研宄表明，TLR9的天然配體是DNA分子中未甲基化的CpG 序列。與細菌基因組或病毒DNA相比，CpG位點在脊椎動物基因組中相對稀少（?1% )。 TLR9由多種免疫系統細胞例如樹突細胞、B淋巴細胞、單核細胞和自然殺傷（NK)細胞表達。 然而，在健康人中，TLR9的表達僅限於漿細胞樣樹突細胞（pDCs)和B細胞。該表達是細胞 內的，位於核內體小泡（endosomalcompartments)內，通過結合至CpG基序富集的DNA來 起到警告免疫系統的病毒和細菌感染的作用。然而，在病理學狀態下，TLR9表達已報導還 位於細胞的細胞表面上12_14。
[0044] 已報導了許多不同的合成的TLR9激動劑分子。激動配體（TLR9活化）已分類成 二組：
[0045] 由CpGA類組成的組，特別是CpG-A⑶15寡脫氧核苷酸（ODN)，也稱作"D"-型0DN。 此類TLR9激動劑誘導強IFNa誘導和樹突細胞的最低成熟，且在本文中稱為"組1"TLR9配 體。實例為0DN221616:
[0046]GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQID48)
[0047] 由CpGB類組成的組，特別是CpG-B⑷17寡脫氧核苷酸（ODN)，也稱作"K"-型0DN。 此類TLR9激動劑誘導弱IFNa誘導和樹突細胞成熟，且在本文中稱為"組2"TLR9配體。實 例為 0DN200618;19:
[0048]TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQID49)
[0049] 由CpGC類組成的組，也稱作CpG-C2tl寡脫氧核苷酸（ODN)。此類TLR9激動劑誘 導IFNa和未成熟樹突細胞的成熟，且在本文中稱為"組3"TLR9配體。實例為0_M36221:
[0050] TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT(SEQID69)
[0051] 迄今為止記載的TLR9的所有配體基於核苷酸。儘管TLR9特異性抗體已報導並用 於闡明受體的存在和位置，但這些分子還未描述為TLR9的配體，沒有任何TLR9活化或抑制 活性的報導。
[0052]⑶32的作用：
[0053] ⑶32強表達於單核細胞/樹突細胞以及B細胞上，因而此類分子被設計為將免疫 應答導向重要的免疫細胞，意欲防止B細胞的抗原呈遞，而促進尤其是樹突細胞（DCs)的抗 原呈遞，當充分刺激時後者導致Thl對抗原應答的誘導。有至少兩種類型的DC:骨髓樣樹 突細胞（mDC)和漿細胞樣樹突細胞（pDC)，已導致DCl和DC2細胞的新理念。在該理念下， DCl細胞在抗原特異性刺激之後促進Thl細胞發育的誘導，DC2細胞支持Th2細胞的發育。 單核細胞衍生的DC(或mDC)通常被認為是DCl類型，而pDC被認為是DC2型。兩種類型的 DC表達⑶32a並將誘導抗原特異性T細胞應答；然而，並不保證結果將是Thl類型。事實 上，在變態反應性供體中，Th2應答是更有可能的。重要的是，pDC表達TLR9受體，TLR9受 體結合CpG-ODN(含有未甲基化的CpG基序的寡脫氧核苷酸（ODN))。該受體在pDC中的活 化導致非常強的IFN-a和IL-12生產，這促進Thl誘導並因而將潛在的DC2轉化成DCl細 胞。
[0054] 因此，此類分子可將TLR9受體在pDC中的活化與抗原特異性Thl細胞的特異性刺 激和誘導相結合。
[0055] 在腫瘤免疫治療中，特定的目標是使用除細胞毒素T淋巴細胞（CTL)以外的腫瘤 抗原特異性T輔助型I(Thl)細胞。
[0056]捲曲螺方定（Coiledcoils)：
[0057] 捲曲螺旋由蛋白質中的結構基序構成，其中2-7個a-螺旋纏繞在一起類似於繩 索的股線；二聚體和三聚體是最常見的類型。捲曲螺旋螺旋體已用於使產生異二聚體的卷 曲螺旋結構域的Fv抗體片段穩定化22。
[0058] 複合蛋白質分子（proteinaceousmolecules)的穩定性和摺疊結構在設計免疫原 時是至關重要的。因此，本發明的目的為提供具有改進的穩定性和結構用於調節對特定免 疫原的免疫應答的疫苗。
[0059] 進一步需要提供改進的靶向胃泌素和胃泌素依賴的病況的免疫治療。因而，本發 明的目的為提供具有改進的免疫原性、穩定性和結構以調節對特定胃泌素表位的免疫應答 的疫苗。


【發明內容】

[0060] 本發明通過所要求保護的主題解決。
[0061] 根據本發明，提供有免疫調節疫苗，所述免疫調節疫苗包括
[0062] -導向佐劑，其至少包括連接至TLR9配體和第一肽a-螺旋的抗⑶32部分，和
[0063] -免疫原，其具有至少一個表位和與第一肽a-螺旋纏繞的第二肽a-螺旋。
[0064] 具體地，所述表位為T細胞和/或B細胞表位。
[0065] 根據本發明的具體方面，所述第一和第二肽a_螺旋各自包括3-5個胺基酸重複 的胺基酸基序，以小於KT6M的KcU優選小於KT7M的KcU更優選小於KT8M或KT9M的Kd彼 此特異性結合。
[0066] 根據本發明的另外的具體方面，所述抗CD32部分選自由抗CD32抗體、優選靶 向⑶32a的抗體片段和肽組成的組。抗體片段具體可例如為Fab、Fv、scFv、dAb、F(ab)2 或Fcab片段，或任何其它可能的實體，只要其特異性結合至受體並在結合後內在化 (internalized)艮P可。
[0067] 根據本發明的另一方面，TLR9配體為選自由CpGA類組成的組的TLR9激動劑，特 別是CpG-A⑶23寡脫氧核苷酸（ODN)，也稱作"D" -型0DN。此類TLR9激動劑誘導強IFNa 誘導和最低樹突細胞成熟，且在本文中稱為"組1"TLR9配體。
[0068] 根據本發明的另一方面，TLR9配體為由CpGB類組成的組的TLR9激動劑，特別是 CpG-B(K)24寡脫氧核苷酸（ODN)，也稱作"K" -型0DN。此類TLR9激動劑誘導弱IFNa誘導 和樹突細胞成熟，且在本文中稱為"組2"TLR9配體。
[0069] 根據本發明的另一方面，TLR9配體具體為由CpGC類組成的組的TLR9激動劑，也 稱作CpG-C25 ;26寡脫氧核苷酸（ODN)。此類TLR9激動劑誘導IFNa和未成熟樹突細胞的成 熟，且在本文中稱為"組3 "TLR9配體。
[0070] 根據本發明的另一方面，所述TLR9配體具體為模擬任意CpGA、B或C類寡脫氧核 苷酸的免疫刺激肽，即特異性結合至TLR9具有活化、激動功能的肽。
[0071] 根據本發明的另一方面，TLR9配體為選自由抑制性ODNs27 ;28寡脫氧核苷酸（有時 稱為抑制性CPGs)組成的組的TLR9拮抗劑，例如，包含由CCx(非-C)(非-C)xxGGG(X=任 意鹼基）29組成的組的抑制性基序的那些。特異性抑制性ODNs已被證實不誘導IFNa，也不 誘導樹突細胞成熟，還阻礙通過TLR9的激動劑的活化。
[0072] 此類TLR9激動劑或詰抗劑可在以適當細胞為基礎的試驗中確定，該試驗測定 IFNa或者標記物⑶80、⑶83和⑶86至少之一的穩定表達，反映了未成熟樹突細胞（DC)的 成熟。為此，如Tel等人3(1所述將漿細胞樣樹突細胞（pDCs)從健康供體的血液中純化，並 隨後用適當濃度的TLR9配體溫育。24h後，使用標準ELISA實驗方案在上清液中測定IFNa。 為了確定細胞的成熟狀態，在與TLR9配體溫育前後使用標準FACS步驟用商購可得的特異 性抗體染色表達CD80、CD83或CD86的pDC。
[0073]IFNa的誘導可由IFNa表達水平和相對於參考水平的相應增加來確定。相對於非 刺激細胞的增加可與由已確定的針對如由組1、2或3TLR9配體所定義的各類型CpG的參考 誘導的誘導水平相比較，並典型地在相應參考的30%和300%之間，優選至少100%，更優 選至少120%，至少150%，至少200 %或至少250%。
[0074] 未成熟的樹突細胞的成熟可通過⑶80、⑶83和⑶86的任意標記物的表達水平來 確定。相對於非刺激細胞的相應增加可與由已確定的針對如由組1、2或3TLR9配體所定義 的各類型CpG的參考誘導的誘導水平相比較，且典型地在相應參考的30%和300%之間，優 選至少100%，更優選至少120%，至少150%，至少200 %或至少250%。
[0075] 具體地，組1和3的TLR9激動劑將導致IFNa表達增加，組2和3的TRL9激動劑 將導致任意DC成熟因子⑶80、⑶83和⑶86表達增加。甚至在組1-3各自的TLR9激動劑 的存在下，TLR9拮抗劑將導致IFNa表達降低和任意DC成熟因子⑶80、⑶83和⑶86表達 降低。
[0076] 根據本發明的具體實施方案，免疫原源自
[0077] _用於癌症疾病的免疫治療的腫瘤相關抗原，或者
[0078]-用於傳染病的免疫治療的病原體，或者
[0079] _用於變態反應疾病的免疫治療的變應原。
[0080] 此類疫苗典型地為免疫刺激疫苗，例如，刺激體液和T-細胞（Thl)免疫應答。
[0081] 免疫刺激疫苗的該實施方案具體採用為TLR9激動劑的TLR9配體。在該情況下疫 苗主要誘導Thl對免疫原的應答。
[0082] 具體地，所述抗CD32部分靶向CD32a，優選具有Kd彡KT6M,更優選小於KT7M或小 於KT8M的高親和性。
[0083] 更具體地，所述抗⑶32部分為特異性或選擇性的⑶32a結合劑，S卩，不靶向⑶32b 或以Kd>10_6M，優選高於10_5M，，更優選高於KT4M的低親和性靶向⑶32b。結合至⑶32a和 Q)32b的差別親和性（differentialaffinity)優選至少llog，更優選至少21ogs或至少 31ogs，或者較高的Kd值差別。
[0084] 在進一步採用TLR9激動劑的免疫刺激疫苗中典型地使用與⑶32a而不是⑶32b 結合為特別優選高親和性或高差別親和性的抗CD32部分。進一步優選此類疫苗採用選自 一系列腫瘤靶標或病原體靶標的免疫原，其中Thl應答和特異性IgG抗體對於與疾病有效 鬥爭是必須的。
[0085] 根據可選的實施方案，所述抗⑶32部分靶向⑶32a和⑶32b二者，具有Kd彡KT6M 的高親和性，優選高於KT7M的親和性，更優選高於KT8M的親和性。在進一步採用TLR9激 動劑的疫苗中典型地使用與CD32a和CD32b二者的結合為特別優選的高親和性的抗CD32 部分。進一步優選此類疫苗採用選自一系列變態反應靶標的免疫原，其中獲得了Th2應答 的重新導向以得到Thl應答。典型地，不優選對疫苗自身的抗體。另外，特異性疫苗優選以 與結合至⑶32a大致相同的親和性結合至⑶32b。
[0086] 與特異性靶向任意⑶32a或⑶32b或⑶32a和⑶32b二者的抗⑶32部分的結合 親和性可以適當的試驗確定，例如典型的ELISA，其使用商購可得的HIS標記的重組形式的 CD32a和CD32b，塗布至Ni-NTAELISA板，例如Ni-NTAHisSorbPlates(Qiagen,Austria)。 抗CD32部分可生物素化並由此可使用鏈黴親和素-HRP或鏈黴親和素AP和適當的底物 來檢測。可選地，該部分可在FACS試驗中使用表達⑶32a而不是⑶32b的U937細胞（如 ATCC:CRL1593)，和表達CD32b而不是CD32a的EBV轉染的B細胞，如vanReijsen等人31 記載的CFB4:2來檢測。
[0087] 根據本發明的其它實施方案，免疫原源自
[0088] -用於變態反應疾病的免疫治療的變應原，或者
[0089] -用於自身免疫病的免疫治療的人自身抗原。
[0090] 用於自身免疫病的此類疫苗典型地為免疫耐受疫苗，例如包括通過調控T細胞並 下調體液免疫應答誘導針對免疫原的T細胞耐受。
[0091] 免疫耐受的該實施方案具體採用為1組TLR9激動劑或為TLR9拮抗劑的TLR9配 體。在該情況下，疫苗將主要下調針對免疫原的Thl/2/17應答，除了活化Treg細胞外。
[0092] 用於變態反應的此類疫苗可為：
[0093] -例如通過採用為1組TLR9激動劑或為TLR9拮抗劑的TLR9配體，調控T細胞並 下調體液免疫應答來誘導針對免疫原的免疫耐受疫苗。在該情況下，疫苗將主要下調針對 免疫原的Thl/2/17應答，除了活化Treg細胞外；
[0094] 或者
[0095] -免疫刺激疫苗，採用為組3TLR9激動劑的TLR9配體誘導針對免疫原的Thl應答， 同時防止針對疫苗的體液免疫應答。
[0096] 根據免疫耐受疫苗的該實施方案，所述抗⑶32部分特異性靶向⑶32b或者⑶32a 和⑶32b二者，具有Kd<KT6M的高親和性，優選具有Kd<KT7M的較高親和性，更優選 Kd< 1(T8M。優選抗⑶32部分特異性靶向⑶32a和⑶32b二者。
[0097] 同樣，對於用於變態反應的免疫刺激疫苗，所述抗CD32部分特異性靶向CD32a 和CD32b，具有Kd<KT6M的高親和性，優選具有更高的親和性，例如，Kd< 10_7M，更優選 Kd< 1(T8M。優選抗⑶32部分特異性靶向⑶32a和⑶32b二者。
[0098] 具體地，根據本發明提供疫苗，其中所述免疫原源自變應原，用於變態反應疾病的 免疫治療，和其中所述抗⑶32部分靶向⑶32a和⑶32b。
[0099] 本發明的具體實施方案可由下表描述，表明根據結合CD32a和/或CD32b的特異 性和親和性的抗CD32部分的選擇、TLR9配體的類型和免疫原的類型。
[0100] 表1:具體實施方案：
[0101]

【權利要求】
1. 一種免疫調節疫苗，其包括 -導向佐劑，其至少包括連接至TLR9配體和第一肽a -螺旋的抗⑶32部分，和 _免疫原，其具有至少一個表位和與所述第一肽螺旋纏繞的第二肽螺旋。
2. 根據權利要求1所述的疫苗，其中所述第一和第二肽a -螺旋各自包括胺基酸基序 的3-5個胺基酸重複，以小於1(T6M的Kd彼此特異性結合。
3. 根據權利要求1或2所述的疫苗，其中所述抗CD32部分選自由抗CD32抗體、抗體片 段和肽組成的組。
4. 根據權利要求1至3任一項所述的疫苗，其中所述TLR9配體為選自由CpG寡脫氧核 苷酸A、B和C類或者模擬任意所述CpG寡脫氧核苷酸的免疫刺激肽組成的組的TLR9激動 劑。
5. 根據權利要求4所述的疫苗，其中所述免疫原源自 -用於癌症疾病的免疫治療的腫瘤相關抗原，或者 -用於傳染病的免疫治療的病原體，或者 -用於變態反應疾病的免疫治療的變應原。
6. 根據權利要求4所述的疫苗，其中所述抗CD32部分靶向CD32a。
7. 根據權利要求4所述的疫苗，其中所述免疫原源自變應原，用於變態反應疾病的免 疫治療，且其中所述抗⑶32部分靶向⑶32a和⑶32b。
8. 根據權利要求1至3任一項所述的疫苗，其中所述TLR9配體為選自由抑制性ODN組 成的組的TLR9拮抗劑。
9. 根據權利要求8所述的疫苗，其中所述免疫原源自 -用於變態反應疾病的免疫治療的變應原，或者 -用於自身免疫病的免疫治療的人自身抗原。
10. 根據權利要求9所述的疫苗，其中所述抗⑶32部分靶向⑶32b，或者⑶32a和 CD32b〇
11. 根據權利要求9或10所述的疫苗，其用於變態反應疾病的免疫治療，其中所述抗 CD32部分靶向CD32a和CD32b。
12. 根據權利要求9至11任一項所述的疫苗，其包括 -導向佐劑，其由包括SEQ ID 70的序列或由SEQ ID 70的序列組成的連接至所述第 一肽a -螺旋的抗⑶32部分組成，偶聯至SEQ ID 69的TLR9配體，優選以1:1-18 (分子/ 分子）的比例；和 -免疫原，其包括連接至第二肽a-螺旋的SEQ ID 30的免疫原，優選SEQ ID 75,或其 功能性活性變體，優選其中除去Cys379的變體；或者所述免疫原由上述組成； 其中所述導向佐劑和所述免疫原通過第一和第二肽a _螺旋的捲曲螺旋結構彼此結 合。
13. -種試劑盒，其用於製備根據權利要求1至12任一項所述的疫苗，所述試劑盒包括 下列組分 -導向佐劑，其至少包括連接至TLR9配體和第一肽a -螺旋的抗⑶32部分，和 -免疫原，其具有至少一個T細胞表位和與所述第一肽a-螺旋匹配的第二肽a-螺 旋。
14. 一種致敏疫苗，其至少包括藥物製劑中的連接至TLR9配體和肽a -螺旋的抗⑶32 部分。
15. 根據權利要求14所述的疫苗，其中所述a -螺旋為捲曲螺旋雙鏈螺旋。
16. 根據權利要求14或15所述的疫苗，其中所述TLR9配體為選自由CpG寡脫氧核苷 酸A、B和C類，或者模擬任意CpG寡脫氧核苷酸的免疫刺激肽組成的組的TLR9激動劑。
17. 根據權利要求14至16任一項所述的疫苗，其用於在利用根據權利要求1至10任 一項所述的免疫調節疫苗免疫治療患者之前預先免疫所述患者。
18. -種包括免疫原性組合物的疫苗，所述免疫原性組合物包括 -導向佐劑，其至少包括連接至TLR9配體的抗⑶32部分，和 _免疫原，其結合至所述導向佐劑，優選通過連接或親和結合； 其用於治療受試者以瞬時誘發導向免疫原的IgG免疫應答，優選具有接種時誘導的 特異性最大IgG滴度，接著在接種時6個月內滴度減少至少30%、優選至少40%、或至少 50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%或多至100%。
19. 根據權利要求18所述的疫苗，其中所述滴度減少為在一系列接種中的最後接種 時。
20. 根據權利要求18或19所述的疫苗，其中所述免疫原為或包括自體抗原的抗原或表 位。
21. 根據權利要求20所述的疫苗，其中所述自體抗原選自由腫瘤相關抗原（TAA)、前激 素和激素組成的組，所述腫瘤相關抗原優選由腫瘤細胞產生的腫瘤細胞表面受體或可溶性 抗原，例如Her2/neu、幹擾素 a (INFa)、表皮生長因子（EGF)、EGF受體（EGF-R)、表皮細胞 粘附分子（EpCAM)、a-甲胎蛋白（AFP)、癌胚抗原（CEA)、MUC-1或路易斯Y，所述前激素和 激素例如消化性激素、甲狀腺激或性激素中任一種，所述消化性激素包括胃泌素、胰泌素或 膜島素。
22. 根據權利要求20或21所述的疫苗，其中所述受試者為人類且所述自體抗原為人 源。
23. 根據權利要求18至22任一項所述的疫苗，其中所述IgG免疫應答可逆。
【文檔編號】A61K39/00GK104487083SQ201380037510
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年7月2日 優先權日:2012年7月13日
【發明者】G·穆德 申請人:S-目標療法有限公司